自噬研究方法工具汇总-BIO-RAD

1、1 / 5 自噬研究方法工具汇总自噬研究方法工具汇总- BIO-RADBIO-RAD 细胞自噬细胞自噬 细胞自噬(autophagy)是依赖溶酶体途径对胞质蛋白和细胞器进 行降解的一种过程。这个过程可以清除功能异常的细胞器、细胞内 病原体以及再循环细胞组分。尽管自噬最早被发现是应答饥饿，现 在发现自噬受到各种胁迫信号的诱导，基础水平的自噬有利于细胞 内稳态的维持。很多因素包括激素刺激的天然免疫信号及能量耗尽 或高温等引起的物理胁迫会诱导自噬上调。相反，很多疾病如癌症、 传染性疾病和神经退行性疾病及衰老和自噬的下调都有关联。 自噬主要有三种信号通路：自噬主要有三种信号通路： Microautop

2、hagy 小自噬通过溶酶体的膜内陷“吞入”目标分子， 起到降解细胞质中小体积物质的作用。这个过程研究得不是很清楚， 膜内陷相关的 GTPaseVps1p 蛋白和自噬相关蛋白(Atg)参与其中。 分子伴侣介导的自噬(chaperone-mediatedautophagy,CMA)直接 将细胞质蛋白带到溶酶体。带 KFERQ-序列的蛋白质和热休克蛋白 Hsc70 及其它分子伴侣相互作用形成的复合体和溶酶体膜上的 Lamp- 2A 受体结合后，导致 Lamp-2A 聚合引发复合体中的底物易位穿越溶 酶体膜。 Macroautophagy 大自噬被研究得最多，可以降解更大量的胞浆 物质，由特殊的细胞器

3、自噬小体介导。大自噬起始于吞噬泡装配点 （PAS）的形成和 Unc51-likekinase (Ulk)复合体的组装，这启动 了自噬小体的形成（图 1）。接着是成核阶段，Ulk 复合物与由 2 / 5 beclin-1、Vps15、Vps34、Atg14 组成 classIII PI3K 复合物相互 作用形成吞噬泡。接着吞噬泡膜扩展形成自噬小体，在这个过程中 Atg12/5/16 复合物促成了磷脂酰乙醇胺（PE）和 LC3（酵母中是 Atg8）的偶联，这是自噬小体膜唯一已知的标志物。PE-LC3 偶联物 在几个关键步骤中起作用：自噬泡膜的扩展、自噬体的识别及自噬 溶酶体的形成。整个过程涉及 3

4、0 多个自噬相关基因（Atg 蛋白）， 包括 Beclin-1、溶酶体相关膜蛋白(Lamp-1 and Lamp-2)和微管相 关蛋白 1A/1Blight chains 3A/B (MAP1LC3A/B 或简称 LC3)，这些 都是自噬常见的标志物。最后一步，完全形成的自噬小体与溶酶体 融合释放内含的物质被降解。 自噬细胞信号通路 如何检测自噬？如何检测自噬？ Microautophagy 小自噬研究的工具有限，最常用的就是用电子 显微镜观察溶酶体膜内陷形成的囊泡。 Chaperone-mediated autophagy (CMA) 被研究得较多，三种分 子伴侣 lys-Hsc70、膜相关

5、 Hsc70 和 lys-Hsp90 有积极参与，作为 CMA 底物受体的膜蛋白 Lamp-2A 的水平可以用来评估 CMA 的活力， 3 / 5 Lamp-2A 和 Hsc70 的共定位可以用来识别 CMA-active 溶酶体。另外 对于 CMA 底物的评估可参考以下方面： 1. KFERQ-like targeting motif 是否出现 2.与 lys-Hsc70positive 溶酶体相关联 3.溶酶体活力依赖的降解速度 4. 与细胞质 Hsc70 的相互作用 5. 与 Lamp-2A 胞内区域相互作用; 6. Lamp-2A 活力相关的浓度; 7.易位到纯化的溶酶体中的能力 Ma

6、croautophagy 大自噬的评估最好使用多个自噬阶段的标志物。 因为自噬小体数量的增加可能是自噬上调也可能是自噬最后阶段被 抑制，所以放置合适的对照能说明得更清楚。 1.1.电子显微镜电子显微镜 透射电镜术(TEM)被广泛用于检测自噬过程中形成的各种结构， 从吞噬泡到自噬小体到自噬溶酶体，但这个技术对使用者操作要求 较高，且不能准确定量。 2.2.检测标志物检测标志物 LC3/Atg8LC3/Atg8 和和 p62/SQSTM1p62/SQSTM1 微管相关蛋白 1A/1B light chains 3A/LC3A 和 3B/LC3B (MAP1LC3A/B), 通常简称 LC3 或酵母

7、中称 Atg8，是自噬小体最可靠 的标志物。 在自噬过程中，非激活型胞质 LC3 (LC3-I) 经过水解和脂质化 后转变为激活的自噬小体膜结合 LC3-II。通过 Western Blot 可以 4 / 5 观察到更小的 LC3-II 条带, 或者通过免疫荧光或免疫组化，可观 察到 LC3 从胞浆转移到膜结构上。提示，自噬活跃时，LC3-II 的水 平也可能低，因为自噬小体与自噬溶酶体融合后 LC3-II 会被降解。 另外某些 anti-LC3 抗体识别 LC3-I 和 LC3-II 灵敏度上有差异，且 LC3-I 对于反复冻融和降解更敏感即使在 SDS 上样缓冲液中，因此 样品要立即煮沸使

8、用而不要反复冻融。 p62 降解是另一个常用的标志物，它在自噬清除多泛素化蛋白 时会被优先降解。自噬过程中 LC3 和 p62 的转录也会被调节，因此 除了检测 LC3 和 p62 的降解，还需加上其它检测。 3.3.检测检测 Lamps,Lamps, Atg5,Atg14,Atg5,Atg14, andand Beclin-1Beclin-1 针对溶酶体标志物 Lamp-1 和 Lamp-2,或吞噬泡及自噬小体的标 志物 Atg5,Atg14,Beclin-1 的抗体经常被用在免疫荧光显微镜上、 western blot 及流式细胞仪上追踪自噬过程的进展。Lamp-2 的检测 应该与 LC3

9、-II 检测联用，因 Atg14 也与 ER 关联它的检测也需要与 其它标志物检测联用。 4.4.组织蛋白酶组织蛋白酶 CathepsinCathepsin 活力检测活力检测 荧光标记的组织蛋白酶底物可通过报告 cathepsin B, K，L 的 蛋白酶活力来发现活细胞中的溶酶体。这些可渗透细胞的无毒的试 剂加入到细胞中被 cathepsin 降解后产生荧光物质，与细胞核染料 如 Hoechst 及溶酶体和细胞器标志物如 acridineorange 联用，可 检测自噬水平。这些检测方法兼容荧光显微镜和酶标仪。 5.5.检测自噬潮检测自噬潮 autophagicautophagic fluxflux 5 / 5 因为自噬是一个动态的过程，自噬潮是一个动态连续的概念， 涵盖了自噬体的形