高效毛细管电泳分离手性物质

1、高效毛细管电泳分离手性物质分析测试第15卷第2期1996.3.25FENX1CESHIXUEBAO(JournalofInstrumentalAnalysis)霾,一l综述lrf6.NU一高效毛细管电泳分离手性物质7孙亦梁(北京大学化学系北京100871)捌嘈培寺.6(中国药品生物制品检定所北京100050)摘要本文对近年来发晨起来的高效毛细管电泳技术(HPCE)在手性分离方面的工作做了评述,讨论了高效毛细管电泳手性对映体的分离方式和定量方面,并对在这一重要顿蛾中可能的发晨趋势做了展望.关蕾词:塾墨塑竺皇,量丝塑臼Pc巨,a,口I.一】生物活性物质的立体结构与其生物活性密切相关.手性左右旋异构

2、体中,通常仅一种对映体具有我们所需要的生物活性,另一种对映体或是非活性的,或具有不同的活性,或是毒性的,或具有我们还不清楚的活性1.在药物方面,据文献报道-2,在现有1850种药物中,天然与半合成药物占523种,合成药物1327种.在天然与半合成药物中,非手性的有6种,手性的为5l7种.在合成药物中,具有手性的528种,其中只有61种是单对映异构体,其它均为外消旋混合物.最近,美国食品医药管理局(FDA)已颁布了开发新立体异构药物的政策.欧洲,日本,北美的药品管理部门准备采取类似的措旅.这就需要开发对手性药物能进行分离和测定的简便,有效方法.由于对映体的物理化学性质极其相近,手性分离的难度较大

3、.色谱技术是目前手性分离的主要手段.并已取得了较大进展3.高效毛细管电泳(HPcE)z3是八十年代发展起来的-f分离分析技术,它已在生物犬分子,药物等许多领域中显示出巨大潜力,特别是作为它的一个分支的胶束电动毛细管色谱(MECC)的发展,3使HPCE扩展到了对中性物质的分离.由于HPCE具有高效,快速,设备简单,样品l处理相对简便等特点,它被认为是在手性分离方面与GC,HPLC相互补充并有较佳前景的一种手段3.自从Gassrnann等利用配体交换原理首次实现氨基酸丹酰化衍生物的HPCE手性分离以来,应用HPCE进行手性分离的研究已取得了一定的进展0.本文将主要HPCE手性分离方面的工作做一综述

4、.1分离方式在手性分离中可采取直接法和间接法两种途径.它们都涉及到非对映立体异构体的形成,所不同的是所形成的非对映立体异梅体是否具有可逆性.采用间接法时,对映体首先与光学纯手性化合物进行化学反应而生成一对非对映立体异构体,然后再进行分离.此种方法分离的是衍生物而不是原对映体,可在非手性环境下用色谱法分离Lurie采用间接法将amphetamine,methamphetamine等手性药物首先与2,3,4,6一?联系人分析试第l5卷第2期(1996)tetraO-acetyl一Dglueopyranosylisothiocyanate衍生,然后用MECC方式实现了分离.间接法的挑战性往往不是分离

5、问题,而是衍生反应的优化.直接法是指在手性环境下对对映体的直接分离.分离是基于两对映体与手性选择剂形成可逆的非对映立体异构体配合物来实现的,一些分析工作者称此法为真正的手性分离,目前在毛细管电泳手性分离中基本上都采用直接法.本综述将主要针对直接法.以下将根据分离机理和使用手性选择荆种类的不同口进行评述:1.1毛细警区带电泳(czE)1.1.1基于配俸交换的毛细警区带电泳体系首例将HPCE用于手性分离的工作就是基于此原理.然而到目前为止,依据配体交换原理的HPCE手性分离报道却相对较少,这一体系通常涉及双基配位体,过渡金属离子和待分离化合物,它主要用于可作为金属离子双基配位体的分子(如氨基酸)的

6、手性分离.Crassmann等脚利用Cu(I)一Lhistidine作为缓冲溶液添加荆成功地分离了几对丹酰化氨基酸衍生物对映体.手性分离是通过左右旋氨基酸对映体与Cu(I)一Lhistidine配合钫中histidine交换形成两个非对映的具有不同稳定常数的三元混配配合钫来实现的.用D-histidine替代L-histidin.可改燮两氨基酸对映侉的迁穆次序.在实验条件下,甩Co(I)代替Cu(I)未能实现氨基酸对映体的分离,可能是由于Co(I)形成了动力学上稳定的三元配合钫所致Gozel等0用Cu(I)-aspartame配合物体系改善了丹酰化氨基酸的手性分离,并成功地分离了14种氨基酸的

7、对映体.Cu(I)-qaspartame摩尔比约为0.5时对分离有利.他们向缓冲溶液中加入十四烷基硫酸钠(STs)采用MECC方式来改善不同氨基酸之间的分离.Cohen等报道了利用Cu(I)一didecylLahnineSDS体系对几种丹酰化氨基酸衍生物的手性分离.1.1.2环翱精一毛细警区带电泳体系(CDsCZE)Li等对环精精(cyclodextrin筒写为CD)的结构,性质以及在分析化学中的应用做了较为详细的总结.环糊精是目前GC,IqPLC手性分离中应用较多的一种手性选择剂.根据文献它也是HPCE手性药物分离中应用最多的一种手性选择剂在a一,类环糊精中,类环糊精应用得最为广泛.一般认为

8、利用环糊精实现手性分离在多数情况下是基于主客体配合物的形成.在CDCZE分离体系中,只向缓冲电解质溶液中加入环糊精,不加表面活性剂.它适用于在一定pH下以离子状态存在的样品.现有的绝大部分工作瞄均采用了这种分离方式.由于环糊精是不荷电的,故以电渗流的速度移动,样品的迁移时间主要由样品的电泳迁移率及样品与配体环糊精的相互作用决定.一般对阳离子,在pH2.5的磷酸盐缓冲溶液中获得较好的分离对阴离子,在pH9.0的硼酸缓冲溶液中获得较好的分离.能否获得分离,环糊精的种类及待分离物质的结构起重要作用2.待分离对映体与环糊精腔体之间的有利于分离的相互作用是实现手性分离的决定因素.一般e-CD适于象氨基酸

9、,无机离子等小分子的手性分离;CD适于比苯环大比苯并芘小的分子的手性分离;7-CD适于大分子的手性分离.对环糊精羟基氢原子进行甲基,乙基,丙基,羟基丙基等基团取代后影响腔体的琉水性和立体性质,因此影响分离的选择性.与CD的强相互作用并不一定导致手性分离,因为在某些场合,两对映体与CD可以形成没有手性选择性差异而作用力却很强的配合物.Wren等D.提出一种数学模型,说明环糊精的浓度在手性分离中有一最佳值,其大小与对映体和手性选择剂之间的亲合力有关,亲合力愈大,最佳浓度值愈小.一些实验结果soss2证实了这一结论.向缓冲溶液中加入甲醇等有机溶剂在某些条件下会改善分离,但在另一些场合下可能会使分离度

10、下降.5,分离度随着分析温度的升高线性下降.离子强度,溶液pH及缓冲溶液的组成对分离度第l5卷第2期(1996)分析测试亦有影响.Nielen口研究了场强对分离度的影响.场强过高会导致分离下降.Snopek等的工作表明,在某些分离中向缓冲溶液中加入可溶的烷基羟基烷基纤维素(alkylhydroxyalkylcellulose)类物质会改善分离.Quang等0通过向含环糊精的缓冲溶液中加入四烷基铵类试剂控制电渗流改善了一些碱性药物的手性分离,但由于电渗流的减小或方向的改变使分析时间拉得过长.由于羧甲基cD在pH>5时荷负电,可用于中性对映体的分离,而在pH<4时由于其不荷电可用于荷电

11、对映体的分离,Schmitt等在pH5.8时利用羧甲基cD作为手性选择剂分离了荷正电对映体,作者认为分离是基于离子对的形成.Aturki等用商品化的羧甲基化cD聚合物作为手性选择剂对hydroxyphenylethylamine等几种药物做了手性分离研究.Rogan等将PlackettBurmman实验设计方法用于毛细管电泳分离手性药物clenbuterol来筛选优化分离条件,以减少实验工作量,其结果与单一变量实验方法所得结果基本一致.1,1.3冠醚一毛细管区带电泳(crownetherCZE)冠醚是另一类能形成主客体配合物的物质.Kuhn等首次报告了应用18冠6四羧酸(18c6)作为手性选择

12、剂用CZE手性分离氨基酸.它主要用于伯胺类物质的手性分离.已发现对于用环糊精和冠醚均能获得手性分离的色氨酸(D,Ltryptophan),将这二种手性选择剂同时使用时对分离具有协同作用.Hohne等用18C6在pH为2时分离了phenylahninol等手性药物,Walbroehl等对一些伯胺类手性物质用18C6作为手性选择剂进行了研究并与HPLC法作了对比,认为这两种方法具有互补性.1.1.4低聚一毛细管区带电泳(oligosaccharideCZE)Dri-Iulst研究了将低糖类(麦芽糊精和玉米糖浆)作为手性选择剂对一些酸性药物的手性分离.作者对不同低聚糖类的分离作用作了探讨,结果表明线

13、性a一(14)一葡萄糖聚合物较为有效.Quang等用dextrin作为手性选择剂手性分离了flurbiprofen等药物和几种丹酰化氨基酸衍生物.据认为无环糊精在水溶液中成为随机变化的圈状物,由螺旋部分和非螺旋部分组成.像环糊精一样,也可与一些客体分子形成主客体配合物.1.1.5蛋白质一毛细管区带电泳(proteinCZE)蛋白质已成功地作为HPLC固定相用于手性分离.Barker等用bovineserumalbumin(BSA)作为缓冲溶液添加物(手性选择荆)分离了leucovorin对映体.毛细管内壁对BsA的吸附影响实验重现性和毛细管使用寿命.毛细管内壁涂溃聚乙二醇可以提高重现性和使用寿

14、命.增加BSA浓度对分离度有所改善但柱效下降.在pH7.2对分离较有利.Busch等应用BSA,ovomucoid(卵类粘蛋白),orosomucoid(血清类粘蛋白)和fungalcellulase(菌质纤维素酶)作为CZE添加物对warfarin等5种药物的手性分离作了比较研究,结果BSA最为有效.上面的几种蛋白质在HPLC中有较为广迂的适用性,而在CE中并非如此.作者推断在它们作为HPLC柱填料键合固定化过程中引起了蛋白质三级结构的变化,使其更适于手性分离.1.1.6大分子抗生素作为毛细管区带电泳舔加物利富霉素B(rifamycinB)已作为一类新手性选择剂被Armstrongn等引入毛

15、细管电泳中用于一些氨基醇的手性分离.利富霉素属大环抗生素ansamycine(袢环类抗菌素)的一类.它具有特征的柄型(ansa)结构,即一个袢环结构(一生色团由脂链连起来构成).利富霉素类物质之间的不同之处在于它们萘氢醌环上取代基的类型和位置的不同.利富霉素B有九个手性中心,在芳环上有易电离的羧基和羟基,还含有羧甲基和酰氨键.这些官能团可提供手性识别所需要的多种作用.实验表明利富霉素B对一些氨基醇类化合物具有手性区分能力,而对羧酸类和其它阴离子化合物在实验条件下无手性分析测试第15卷第2期(1996)区分能力.溶液pH,有机溶剂的种类和浓度,离子强度,缓冲溶液类型和缓冲容量以及手性选择剂的浓度

16、均影响分离.由于利富霉素B是阴离子化合物,它本身的电迁移方向与电渗流方向相反.由于利富霉素B在紫外和可见区均有强的吸收,检测采用间接光度法.1.2胶柬电动毛细管色谱(MECC)1.2.1环糊精一胶束电动毛细管色谱体系(CDsMECC)在这种分离方式中,使用同时加有环糊精和表面活性剂如十二烷基硫酸钠(SDS)的缓冲溶液体系.由于环糊精不与胶束作用,与胶束比较而言,可认为环糊精作为另一相起作用,待分离溶质在三相(水相,胶束,环糊精)间分配,荷负电的胶柬与电渗流的运动方向相反,对映体与胶柬和环糊精均发生相互作用,但手性分离仅由对映体与环糊精的作用决定.Nishi等这种分离方式用7-CD分离了一些巴比

17、.妥盐类手性化台物,向胶柬溶液中加入有机溶剂和手性化台物如樟脑磺酸等改善了分离.OtsukaE对手性药物chlorpheniramine用CDCZE和CDMECC这两种分离方式都实现了分离.在CDsMECC中.可用改变CD浓度或改变胶束浓度这两种方式来调整容量园子,但同时由于增加了实验参数.在进行分离方法的研究中也就增加了要考虑的因素,可能会更加耗时.这两种方式具有互补性.其他作者0.也用CDMECC体系手性分离了其它一些药物.Soinin研究了环糊精阳离子表面活性剂体系对一些碱性药物如bupivacaine的手性分离.阳离子表面活性剂可覆盖毛细管内壁表面减小电渗流甚至改变电渗流的方向,同时影

18、响选择性,加入有机溶剂和水溶性纤维素有时也可改善分离.1.2.2加有手性表面活性剂的胶束电动毛细管色谱体系(MECCwithchiralsurfactants)手性表面活性剂形成手性胶柬,与待分离物质作用从而实现手性分离.众多的手性表面活性剂中只有少数几个可用于手性分离.Otsuka等用SodiumNdodecanoylLValinate(SDVa1)作为手性表面活性剂手性分离了benzoin和warfarin(法华林),分离中单独使用SD-Val不能实现手性分离,向SDVal胶束溶液中加入表面活性剂SDS,尿素和甲醇可改善峰形,分离度和选择性.但许多手性化合物用这一体系并不能获得分离.Nis

19、hi等rs.763报告了用胆汁酸盐作为手性表面活性剂的手性分离工作,胆汁酸的种类,缓冲溶液的pH及样品的结构均影响手性分离胆汁酸盐是天然的阴离子表面活性剂,在所研究的胆汁酸盐中,牛磺脱氧胆汁酸纳(sodiumtaurodeoxycholate)是最常用的一种.加入尿素口,环糊精口,甲醇娜可改善分离.胆汁酸盐似乎对具有平面剐性结构分子的手性分离是有效的.Mazzeo等773制备了一种新的手性表面活性剂(R)一和(s)一Nd0dec0xcarb0nylvaline并用(s)一型分离了几对药物对映体.可通过分别使用(R)一或(s)一型的办法改变两对映体的迁移次序.毛地黄皂甙(digitonin)和皂

20、角甙(saponins)口已用于衍生化氨基酸的手性分离,但尚未有用其分离药物的报道.1.3毛细管电色谱体系(CEC)1.3.1涂壁柱毛细管电色谱体系(CECwithwalIimmobilizedcolumns)Mayer等将环糊精固定于石英毛细管内壁,以电色谱方式分离了几种手性药物.他们研究了pH对毛细管稳定性的影响,并对涂层厚度,施加电压对分离的影响作了探讨.在分离中获得了较高的分离效率(约300000理论板数).Amstrong等报告了石英毛细管壁涂环糊精的方法,对涂壁柱分别作了CE,GC和SFC试验,并分离了几对对映体.1.3.2填充柱毛细管电色谱(CECwithpackedcolumn

21、s)Li等【将aacidglycoprotein装填在50umi.d.毛细管中作为固定相实现了对benzoin等几种药物的直接手性分离.作者对场强,pH,溶剂组成对电渗流的影响,对pH,电解质浓度,流动相中有机溶剂的浓度对保留时问和立体选择性的影响分别作了研究增加有机溶剂的浓度减小电渗流和保留时间有机溶第l5卷第2期(1996)分析测试剂的种类和浓度对立体选择性亦有影响.提高流动相的pH缩短保留时间,但对立体选择性无影响.1.4毛细管凝胶电泳体系(CGE)1988年Guttrnn等曾将环糊精固定于聚丙烯酰胺凝胶中用毛细管凝胶电泳手性分离衍生化的氨基酸.1992年Birnbaum等将BSA在毛细

22、管中用戊二醛化学交联成凝胶,采用毛细管凝胶亲和电泳方式实现了对色氨酸对映体的手性分离,获得了较Lc分离高得多的分离效率.随后,Sun等用溴化腈作催化剂将BSA与高分子量糊精共价交联聚合,并将其添充在用聚丙烯酰胺涂壁的毛细管中,用以分离leucovorin对映体,在5h内20次进样无明显柱效损失.必要时,可将毛细管装换成新鲜的BSA一糊精聚合物.2手性分离的定量方面手性分离的目的旨在提供有关手性物质对映体纯度信息,通常提供两对映体的比值即可.从外消旋体的分离结果看,两对映体的峰高往往是不相同的,因此不宜用峰高比直接定量.Nishi等直接用峰面积比法检测了药物trimetoqulnolhydroe

23、hloride的光学纯度.Fanali等za研究了商品药物肾上腺素(epinephrine)的对映体组成测定问题.由于背景电解质中CD的存在可能导致两对映体与CD所形成配合物吸收光谱的差异,左右旋对映体的紫外吸光系数在检测波长下可能有所不同.这样用峰面积比直接定量就可能会有些误差.为了克服这一问题,他们引入了校正因子,即当两对映体的量为1t1时他们的峰面积比值,结果左旋对映体与右旋对映体的面积之比即校正因子为1.04.Peterson等对商品药物中l-epinephrine(肾上腺素)定量及d一,1-epinephrine比测定问题做了研究,用内标法对1-epinephrine定量获得了较高的

24、回收率和较好的重现性,在测两对映体比时亦进行了校正,结果右旋对映体与左旋对映体面积比为0.945(如果以右旋对映体为标准,则校正因子值为1.06).Nidenra4在定量研究中,使用峰高/迁移时间和峰面积/迁移时间这两个比值作为定量参数,并在计算两对映体含量比时进行归一化处理焉果发现用峰高/迁移时间这一参数定量时不成线性,因而不能使用.使用峰面积/迁移时间定量重现性好.Altria等将CE手性分离elenbuterol的方法交给分属于不同药品公司的7个实验室使用以确证毛细管电泳手性分离方法的可靠性,结果在峰面积和迁移时间的精密度,线性和准确度方面获得了较满意的结果.此外,分析工作者已将毛细管电

25、泳手性分离用于血浆,血清和尿样0这些生物体液的手性分析中.在测定实际样品时,对样品进行萃取,离析等前处理是必要的,以便消除干扰组分,浓缩待测组分,使样品浓度与检测灵敏度相匹配.Shibukawa在超过滤的血浆中外加入具有临床意义水平的手性药物leucovorin和5-methyltetrahydrofolate未经浓缩直接分析,虽获得了分离但检测灵敏度不能满足常规分析的需要.3展,望随着毛细管电泳技术的完善和人们对手性化学的重视,今后手性物质的HPCE分析将会得到进一步的发展.在手性分离的研究中,除了继续扩大现有各类环糊精应用范围外,人们可能对环糊精进行各种化学修饰;充分借鉴HPLC手性分离的

26、知识,经验和成果以及与手性作用有关的其它学科的成果,开拓各种类型的适于毛细管电泳分析需要的手性选择剂以满足多种药物手性分离的需要;在继续进行手性分离研究的同时,对定量研究和实际样品手性分析的研究将会得到发展和加强.灵敏度低是目前HPCE的主要弱点之一,解决这一问题尚须分析分析测试嵬15卷第2期(1996)化学家极大的努力.手性分离成功的关键在于选取合适的手性选择剂.只有手性选择剂与待分离物质相互作用,并且这种作用具有手性差异时(即手性选择剂与两对映体所形成的配合物的稳定性不同)才能实现分离.目前在选用手性选择剂时,主要是凭经验,用实验的办法完成的.现在已有将分子设计方法用于GC口,LC口手性分

27、离研究工作的报告.将来有可能将这一方法用于毛细管电泳手性分离中,作为筛选和设计合适的手性选择荆的辅助工具,以减少实验的盲目性,提高成功率.可以预料,由于CE的高效,快速,简单等特点,它将在手性物质的分离方面发挥越来越大的作用.参考文献,Chemical&EngineeringNews,1990,68(12)_38欧庆瑜.第二届垒国生物医学色谱学术论文集(上册),南京,1990,10ChangSCllGL,ChenS,ChangCnTrendsinAnalyticalChemistryt1993,12l144WainerIW.TrendsinAnalyticalChemistry.199

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30、ieriRH,Anders0nKW,MorrisSC,MorrisonJA.BlonzertTJ.J.Liq-Chromatogr-,1992,15_961SnookJ,JelinekI,KeulemansovaES.JChroraatogr.,1988,452_571JaniniGM,LssaqHJ.Liq-Chromatogr.t1992,15_927GassmannE,KMoJE,ZareRN.Sciencel1985,230|813KuhnR.KuhnSH.Chrometographis,1992,34l505LurieIS.J.Chromatogr.1992.605I269Gozel

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36、rmnA,CookeN.J.Chromatogr.A,1994,680l157RickardEC,BoppR】.】.Chromatogr.A.1994.680I609PierreLASt,SentelKB.J.Chromatogr.B.1994,657l291PennSG.LiuG.BergstromF.T.GoodlDM.LoranJS.J.Chromatogr-A,1994,680l147SehmittT,EngelhardtH.Chromatographia?1993?37(9/10)l475AturkiZ,FanaliS.J.Chromatogr.A.1994.680l137Ahria

37、KD,HardenRC,HartM.HeviziJ,HaileyPA,MakwanaJV,PortsmouthMJ.J-Chromatogr.,1993,641147RoganMM,AhriaKD,GoodalDM.Chromatographia,1994,38(11/12)I723HohneE,Crauss0J?GubltsG.J-HighResoutChromatogr.,1992,15t698WalbroehlY,WagnerJ.J.Chromatogr-A,1994?680I253DHustA,VerhekeN.J.Chromatogr.1992.608l275QuangC,Khale

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39、romatogr.,1992,574l127SoiniH,RiekkolaML,NovotnyMV.J.Chromatogr.,1992,608l265AumatelA.Well8RJ.J.Chromatogr.Sci.1993.31502FurutaR,DT.J.Chromatogr.A.1994,676l431OtsukaK_KawaharaJ.tatakamaK,TerabeS.J.Chromatogr.t1991,559l209NishiH.FukuyamaT_MatsuoM,TerabeS.AnalzticaChimicaActa,1990,236l281弘强曲n蛆町档孔靶弱耵弱舯札

40、韶粕卵韶钾儿他;292分析测试第15卷第2期(1996)76NishiH,FukuyamaT,Matsu0M,TerabeS.J.Chromatogr,1990-515:23377MazzeoJR,Grover.E.R.SwartzME.PetersenJS.J.Chromatogr.A,1994,680-12578MayerS.SchurigV.J.HighResolChromatogr.,1992,15:12979MayerS,SehurigV.J.Liq.Chromatogr.,1993.16291580ArmstrOngDW,TangY,WardT.NicholsM.Ana1.Chem.,1993.65-111481LiS.LloydDK.Aha1.Chem.,1993,65:368482BirahaumS.NilssonS.Ana1.Chem.i992,64l287283SunP,BarkerGE,Hart