分子生物实验技术

1、分子生物学实验技术,DNA分析 RNA分析 蛋白质分析,DNA分析,DNA重组技术 DNA杂交技术 DNA文库的构建和筛选 DNA聚合酶链反应 DNA测序技术 DNA多态性及其检测 基因结构的分析 DNA芯片技术,DNA重组技术是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。,DNA重组技术,核酸酶 限制性核酸内切酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 核酸修饰酶,【工具酶】,核酸酶 (nuclease),核酸外切酶：从核酸的一端开始将核苷酸一个接一个水解。,核酸外切酶VI

2、I (Exo VII) 酶切单链; 无需Mg2+;,核酸外切酶III (Exo III) 酶切双链，需Mg2+; 从3端开始外切;,核酸酶 (nuclease),l核酸外切酶 (lExo) 酶切双链，需Mg2+; 从5端开始外切;,核酸酶 (nuclease),核酸酶 (nuclease),核酸内切酶：从核酸链中间水解3,5磷酸二酯键。,S1核酸酶： 内切单链DNA或RNA分子; Zn2+必需;,DNase I： 优先从嘧啶核苷酸处水解双链或单链DNA。,RNase H： 能够特异性地降解DNA-RNA杂交链中的RNA链的内切酶。,限制性核酸内切酶 (Restriction endonucle

3、ase),识别双链DNA分子中的特定序列，并切割DNA双链。 主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA的入侵。,II型限制性核酸内切酶,BamH I,5G-OH P-GATCC3 3CCTAG-P OH-G5,Bgl II,Not I,Sma I,Pst I,5CTGCA-OH P-G3 3G-P OH-ACGTC5,5A-OH P-GATCT3 3TCTAG-P OH-A5,5CCC-OH P-GGG3 3GGG-P OH-CCC5,5GC-OHP-GGCCGC3 3CGCCGG-P OH-CG5,II型限制性核酸内切酶,DNA连接酶 (Ligase),催化相邻的核苷酸分子间3-羟基和5

4、-磷酸基形成磷酸二酯键，其底物可以是DNA或RNA。,分子克隆中最常用的连接酶是 T4 DNA连接酶： 底物必须是双链核酸，包括双链DNA分子（粘端、 平端）、DNA-RNA杂合子以及RNA-RNA双链分子。 DTT(二硫苏糖醇)可以促进T4 DNA连接酶的作用。,修复双链DNA上缺口处的磷酸二酯键,DNA连接酶 (Ligase),修复与RNA链结合的DNA链上缺口处的磷酸二酯键,DNA连接酶 (Ligase),DNA连接酶 (Ligase),连接带有相匹配的粘性末端或平头末端的DNA分子,从分子动力学的角度讲，两个带有粘性末端的DNA分子之间的连接比平头末端分子间的连接效率要高得多。,DNA

5、多聚酶 (Polymerase),以带有3-羟基的DNA片段为引物，以单链DNA分子为模板，按碱基互补配对的原则，将dNTP加到3末端的羟基上，合成模板链的互补链。合成链延伸的方向从53。,大肠埃希菌DNA聚合酶I(全酶) 53的聚合酶活性; 53脱氧核酸外切酶的活性; 35的外切酶活性; RNaseH的活性;,DNA多聚酶 (Polymerase),大肠埃希菌DNA聚合酶I大片断(Klenow) 53的聚合酶活性; 35的外切酶活性;,Klenow 酶的基本用途：补平由核酸内切酶产生的5粘性末端,DNA多聚酶 (Polymerase),Taq DNA聚合酶 从栖热水生菌中分离，最适温度75-

6、80； 主要用于PCR反应，DNA序列测定等；,逆转录酶(reverse transcriptase)：以RNA为模板的DNA聚合酶 AMV(禽成髓细胞瘤病毒); Mo-MLV(Moloney鼠白血病病毒 )；,核酸修饰酶,碱性磷酸酶(alkaline phosphatase)： 催化核酸的5端脱去磷酸基团，其底物可以是单链或双链的DNA和RNA。,T4多核苷酸激酶(T4 polynucleotide kinase)： 催化将ATP分子位的磷酸基团转移到多核苷酸5端的羟基上(单链或双链DNA， 或RNA) 。,末端脱氧核苷酸转移酶(terminal deoxynucleotidyl trans

7、ferase)： 催化DNA链的3-OH端加脱氧核糖核苷酸的聚合反应。,载体应具备的条件 具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）； 具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点； 具有较高的外源DNA的载装能力； 具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点； 具有合适的筛选标记；,运送外源基因高效转入受体细胞；为外源基因提供复制能力或整合能力；为外源基因的扩增或表达提供必要的条件。,【载体】,质粒(plasmid) 噬菌体(phage)和病毒载体 黏粒(cosmid) 噬菌粒(phagemid or phasmid) 酵母人工染色体(YAC) 细菌人工染色体(BAC),【载体】,载体的种类,质

8、粒 (plasmid),生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子，常见于原核细菌和真菌中，多为共价闭合的环状双链DNA分子结构。,根据在每个细胞中的分子数(拷贝数)多寡，质粒可分为两大复制类型：严紧型复制控制的质粒、松弛型复制控制的质粒。,质粒 (plasmid),质粒的特点 能够自我复制(ori)。 含有供筛选鉴定的抗生素标记或 遗传标记(Ampr,Tcr)。 含有供外源DNA插入的多克隆位 点(Multiple Cloning Site)。 自身体积较小，易进入宿主细胞。,质粒接受的外源DNA片段：15 kb 常用的质粒有：pGEM, pBR322, pU

9、C18/19等。,噬菌体 (phage),一类非细胞微生物，能高效率高特异性地侵染宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏起来，而且在一定的条件下上述两种状态还会相互转化。,高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞； 自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增；,大肠埃希菌的 l 噬菌体,噬菌体 (phage),l-DNA在体外呈线性双链分子，两端各含一段由12个核苷酸构成的互补单链序列，称为cos序列或cos点。,l噬菌体是大肠埃希菌的温和型噬菌体 l噬菌体由外壳包装蛋白和l-DNA组成 l-DNA全长48502个核苷酸 l-DNA上至少有61个基因,噬菌体 (phage

10、),溶原性方式：l噬菌体感染大肠埃希菌后，也可能将其DNA直接整合到宿主的 染色体DNA上，随宿主染色体DNA复制，传给宿主后代。 l-DNA的整合是可逆的，改变l-DNA或宿主细胞的性质，可使噬菌体从溶原状态进入溶菌状态。DNA重组技术一般需要l噬菌体进入溶菌状态。,l 噬菌体的增殖：溶菌(lytic),溶菌性方式,溶原(lysogenic),噬菌体 (phage),l噬菌体基因组的结构和功能 左臂(约20kb)：含编码组装完整噬菌体所需要的蛋白质的基因。 右臂(约10kb)：含控制噬菌体生长的调控基因和序列，以及DNA的复制起始区。 中段(约20kb)：含DNA整合、切出，噬菌体溶原生长所

11、需的序列。,野生型l-DNA包装的上限为51kb，本身长度为48.5kb，只有当插入的外源DNA片段不大于2.5kb时，才能被包装成有感染力的噬菌体颗粒。 人工构建的l-DNA载体分成两大类：取代型载体和插入型载体。,噬菌体 (phage), 取代型 l-DNA载体,噬菌体 (phage), 插入型 l-DNA载体,噬菌体 (phage),l-DNA载体的特点 l-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠埃希菌； l-DNA载体的装载能力为25kb，远远大于质粒的装载量； 重组l-DNA分子的筛选、提取和存放较为方便； l-DNA载体适合克隆和扩增外源DNA片段，但不适合表达外源基因；,

12、常用的l-DNA载体：lgt系列、EMBL系列、Charon系列等。,噬菌体 (phage),大肠埃希菌的 M13单链噬菌体,M13 噬菌体的外型呈丝状 M13 噬菌体由外壳包装蛋白和正链DNA组成 M13 噬菌体不裂解宿主细胞，但抑制其生长 M13 DNA全长6407个核苷酸 M13 DNA上至少有10个基因,噬菌体 (phage), M13 单链噬菌体的增殖,M13进入大肠埃希菌后, M13 DNA载体的构建,噬菌体 (phage),IR区域：共508个核苷酸，不编码任何基因，可用来插入外源基因。,IR区域, M13 DNA载体的特点, 使克隆的DNA片段以特定单链的形式输出受体细胞外;

13、M13重组分子筛选简便; M13-DNA载体的最大缺陷是装载量小，一般小于2kb;,病毒DNA载体,黏粒和噬菌粒,l-DNA载体和M13-DNA载体的装载量最大分别为25kb和2kb，但在很多情况下，往往需要克隆更大的外源DNA片段，黏粒和噬菌粒载体的构建就是为了进一步提高噬菌体DNA的装载量。 在包装上限固定的条件下，大幅度缩短噬菌体DNA的长度，就能增加载体的装载能力。将噬菌体DNA中与包装有关的序列与质粒组装在一起，既能最大限度地缩短噬菌体DNA载体的长度，同时又能保证重组DNA分子在体外仍可被包装成有感染力的颗粒，这便是构建黏粒和噬菌粒载体的思路。 当然，由于黏粒和噬菌粒不再携带包装蛋

14、白基因，因此重组DNA分子在细胞内不能形成噬菌体颗粒。,黏粒(cosmid),黏粒(cos质粒)的特点 能像l-DNA那样进行体外包装，并高效转染受体细胞 ； 能像质粒那样在受体细胞中自主复制； 装载量大(45 kb)且克隆片段具有一定的大小范围； 操作简便，筛选容易； 不能体内包装，不裂解受体细胞；,人工构建的一类含有DNA包装所必需的cos序列，以及质粒的复制序列、标志基因和多克隆位点的特殊载体。,黏粒(cosmid),1978年，Collins和Hohn将1.8kb的l-DNA片段与pBR322质粒片段组合在一起，所构建的载体装载范围为31- 45kb。,cos site - carry

15、ing plasmid,噬菌粒(phagemid或phasmid),人工构建的一类含有单链噬菌体包装序列、复制子，以及质粒复制子、克隆位点、标记基因的特殊类型的载体。,噬菌粒载体的特点 能像M13-DNA那样体外包装，并高效转染受体细胞 ； 能像质粒那样在受体细胞中自主复制； 装载量比常规的M13mp系列要大很多(10 kb) ； 通过克隆双链DNA能获得同等长度的单链DNA ； 操作简便，筛选容易；,噬菌粒(phagemid或phasmid),pUC118/119 (pUC18/19 + M13间隔区）,重要的噬菌粒载体,pBluescript (pUC + f1-ori + PT7 + P

16、T3）,人造染色体载体,将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分配区、稳定区与质粒组装在一起而构成。当大片段的外源DNA克隆在这些染色体载体上后，便形成重组人造染色体，它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。,目前常用的人造染色体载体包括： 酵母人造染色体（YAC） 细菌人造染色体（BAC）,人造染色体载体, 酵母人工染色体(Yeast Artificial Chromosome) 以pBR322质粒DNA为骨架，加入酵母的着丝粒序列、自主复制序列、 端粒序列、克隆位点和筛选标记等。,YAC的克隆容量很大，可装载数百kb至1000kb以上的外源DNA。,人造染色体载体, 细菌人工

17、染色体(bacterial Artificial Chromosome),以大肠埃希菌中存在的一种F质粒为基础，加入多克隆位点和抗性筛选基因等构建而成。,BAC能携带100-300 kb 的插入片断(平均150 kb)，可随细菌染色体而复制，不会被丢失。,基因克隆的策略和技术路线,适用于革兰氏阴性细菌(如大肠埃希菌等)，其原理是Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，细菌细胞此时的状态叫做感受态。,Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化,重组DNA分子的转化,大肠埃希菌感受态细胞的制备, 大肠埃希菌培养至OD600 = 0.5，离心收集菌体 用预冷的1

18、0 mM CaCl2溶液悬浮菌体，离心收集菌体 用适量预冷的75 mM CaCl2溶液悬浮菌体 冰浴放置12 - 24小时，备用,重组DNA分子的转化,大肠埃希菌感受态细胞的质粒转化, 取100ml感受态细胞，加入重组DNA分子连接液，混匀； 冰浴放置半小时； 在42保温 2 分钟（热脉冲）； 快速将转化细胞转移至冰浴中放置1-2分钟； 加入1ml新鲜培养基，于37培养1小时（扩增）； 涂在合适的固体培养基平板上进行筛选；, l噬菌体DNA的转染,重组DNA分子的转化,加入20倍体积的新鲜培养基，30培养2小时，直至培养液中菌体裂解，培养液澄清度增加，然后涂板筛选。,感受态细胞的培养,将大肠杆

19、菌在含有麦芽糖(不含葡萄糖)和MgCl2的培养基中培养至OD600 = 0.5,吸附,加入经体外包装好的重组噬菌体悬浮液，30保温10分钟。,转染裂解,重组DNA分子的转化, 电穿孔转化,将待转化的质粒或DNA重组分子连接液加在电穿孔转化仪的样品池中，两极施加高压电场。在强大电场的作用下，细胞壁和/或细胞膜产生缝隙，质粒或DNA重组分子便可进入细胞内。,电穿孔转化法操作简单，而且几乎对所有含细胞壁结构的受体细胞均有效，但转化效率差别很大。,基因克隆的策略和技术路线,重组子的筛选和鉴定, 抗药性筛选法,用于区分重组子与非重组子,将外源基因克隆在pUC18的lacZ标记基因内部，使之灭活，此时重组

20、子呈Apr、lacZ-，淡黄色菌落；而非重组子则呈Apr、lacZ+，蓝色菌落。,重组子的筛选和鉴定, 显色筛选法 用于区分重组子与非重组子,重组子的筛选和鉴定, 限制性酶切图谱法,用于鉴定目的重组子,用EcoRI酶切转化子质粒DNA， 目的重组子：3.0 kb + 3.7 kb 或者：1.0 kb + 5.7 kb 非重组子：2.7 kb, DNA测序分析法, 菌落噬菌斑原位杂交法, PCR技术分析法,基因克隆的策略和技术路线,DNA分析,DNA重组技术 DNA杂交技术 DNA文库的构建和筛选 DNA聚合酶链反应 DNA测序技术 DNA多态性及其检测 基因结构的分析 DNA芯片技术,DNA杂

21、交(hybridization)技术,核酸分子杂交的基本原理： 具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下(适宜的温度及离子强度等)按碱基互补原则退火形成双链。,杂交的对象： 待测的核酸序列：基因组DNA；细胞RNA；或克隆的基因片段； 探针(probe)：用于检测的已知核酸片段，通常需加以标记。,杂交的方式： 膜上印迹杂交(固-液相杂交)：体外进行 原位杂交：组织或细胞内进行,Southern印迹法,用于检测与特异探针杂交的DNA片段大小和数量。,基本步骤： 酶解 电泳 碱变性 转移 固定 杂交 显影, 固相支持物的选择, 具有较强的稳定结合核酸分子的能力(10mg/cm2)； 与核酸分子的结

22、合牢固，能经受杂交、洗膜等操作过程； 非特异性的吸附少； 具有良好的机械性能(柔韧性好、韧性强)，易于操作；,目前常用的是：硝酸纤维素膜(本底信号较低)和尼龙膜(对小分子片段结合较强；可反复使用)。, 转移,Southern印迹法,电转移,真空转移,虹吸转移,Southern印迹法, 探针标记, 切口平移法(nick translation)：适用于双链DNA探针的标记, 随机引物法(radom prime)：双、单链DNA和RNA的标记均可,Southern印迹法, DNA末端标记法：标记活性不高，一般用于寡核苷酸探针的标记,3末端标记：,5末端标记:,在T4多核苷酸激酶的催化下，可使ATP

23、分子-磷酸基团转移到DNA或RNA的5-OH基团上，因此采用-32P-ATP为底物，可对核酸的5末端进行标记。,Southern印迹法,除了放射性核素以外，也可采用非放射性核素来标记探针，常用的有生物素、地高辛等。,Southern印迹法, 探针纯化,探针标记反应结束后，反应液中仍会存在存在一些未掺入到DNA中去的dNTP等小分子，常需要进一步纯化。, 凝胶过滤柱层析：常用Sephadex G-50(分子筛作用)； 乙醇沉淀法；, 预杂交和杂交,为减少非特异性杂交反应，通常应进行预杂交，将非特异性的DNA位点封闭，常加入变性的鲑鱼精子DNA或小牛胸腺DNA。 大多数杂交反应在68C进行，当含有

24、变性剂甲酰胺时，反应在42C进行。寡核苷酸探针的杂交反应一般在低于Tm值5C下进行。,菌落斑点杂交,核酸原位杂交,以DNA或RNA为探针，检测组织、细胞内特定核酸序列的方法。,DNA分析,DNA重组技术 DNA杂交技术 DNA文库的构建和筛选 DNA聚合酶链反应 DNA测序技术 DNA多态性及其检测 基因结构的分析 DNA芯片技术,基因文库的构建和筛选,基因库(gene pool),特定生物体全基因组的集合(天然存在)。,基因文库(gene library or gene bank),从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆的形式存在(人工构建)。,根据构建方法的不同，基因文库分为： 基

25、因组文库(含有全部基因) cDNA文库(含有编码全部蛋白质的基因),指所构建的基因文库中任一基因存在的概率，它与基因文库最低所含克隆数N之间的关系可用下式表示： N = ln ( 1 P ) / ln ( 1 f ) 其中：P = 任一基因被克隆(或存在于基因文库中)的概率 f = 克隆片段的平均大小/生物基因组的大小,例如:人的单倍体DNA总长为2.9x109bp，基因文库中克隆片段的平均大小为15kb，则构建一个完备性为0.9的基因文库至少需要45万个克隆；而当完备性提高到0.9999时，基因文库至少需要180万个克隆。,基因文库的完备性,【基本概念】,【基本概念】,基因文库的质量标准,除

26、了尽可能高的完备性外，一个理想的基因文库应具备下列条件：,重组克隆的总数不宜过大，以减轻筛选工作的压力； 载体的装载量最好大于基因的长度，避免基因被分隔克隆； 克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域，以利克隆排序； 克隆片段易于从载体分子上完整卸下； 重组克隆能稳定保存、扩增、筛选；,【基本概念】,基因组文库：以染色体DNA为材料，用鸟枪法构建。 cDNA文库：以mRNA为材料，用cDNA法构建。,基因文库构建的策略,在高度分化的生物体中，不同组织和细胞在不同时段的mRNA种类不同(即基因的表达谱不同)，因此同种生物体的cDNA文库一般还有组织细胞的界定，如肝组织cDNA文库或胚胎组织cDN

27、A文库等。因此，cDNA文库的信息量远小于基因组文库。,基因组文库 (genomic library), 基因组DNA的制备,为了最大限度地保证基因在克隆过程中的完整性，用于基因组文库构建的DNA在分离纯化操作中应尽量避免过度的断裂。制备的DNA分子量越大，经切割处理后样品中含有不规则末端的DNA片段的比率就越低，重组率和完备性也就越高。,用常规方法制备的染色体DNA的长度一般在100 kb左右，如果先将细胞固定在低融点凝胶中，然后置入含有SDS、蛋白酶K、RNase的缓冲液中浸泡，可获得1000 kb大小的DNA片段。,基因组文库 (genomic library), 基因组DNA的切割,一

28、般采用超声波处理和部分酶切两种方法，其目的是：, 保证DNA片段之间存在部分重叠区； 保证DNA片段大小均一；,超声波处理：DNA片段呈平头末端，需加装人工接头； 部分酶切法：一般选用四对碱基识别序列的内切酶， 如：Sau3AI或MboI等；, DNA片段的分级分离,例如，将染色体DNA用SalI切开，琼脂糖凝胶电泳分离，用刀片切下相当于10-25kb大小区域内的凝胶块，从此凝胶块中回收DNA片段，然后与载体进行拼接。,基因组文库 (genomic library),切割后的DNA片段在连接前必须根据载体的装载量进行分级分离，以杜绝不相干的DNA片段随机连为一体！,基因组文库 (genomic

29、 library), 载体和受体的选择,为了压缩重组克隆的数量，用于基因组文库构建的载体通常选装载量较大的l-DNA或cos质粒；对于大型基因组(如动植物和人类)需使用YAC或BAC载体。 用于基因文库构建的受体一般根据所选的载体使用大肠埃希菌或酵母菌。,几种载体的最大装载量如下： 质粒 15 kb BAC 300 kb l-DNA 25 kb YAC1000 kb cos质粒 45 kb, 从基因文库中筛选目的基因,基因组文库 (genomic library), 重组克隆的排序,基因组文库 (genomic library),大型基因文库(包括人的基因文库)的构建在技术上并不十分困难，如果

30、一个YAC基因文库的插入片段总和为整个基因组的十倍以上时，一般就能从基因文库中调出任何一段DNA序列。然而基因文库的克隆都是随机序列，必须将所有的克隆排列成一个像天然染色体DNA上所表现出的信息顺序。这项工作的工作量可能远大于基因组文库的构建，属于基因文库的后期制作。,基因组文库 (genomic library),酶切片断末端标记法,随机探针联合杂交法,基因组文库 (genomic library),基因组文库 (genomic library),染色体走读法(chromosome walking),基因组文库 (genomic library),基因组文库 (genomic library

31、),cDNA文库, cDNA第一链的合成, cDNA第二链的合成,cDNA文库,自身引导法：,使用S1来切割双链cDNA中的单链发夹环难以控制，常导致cDNA大量缺失。,cDNA文库,置换合成法：获得的双链cDNA 5端会有几对碱基缺失,cDNA文库,引导合成法：获得的双链cDNA能保留完整的5端序列,cDNA文库,由于绝大多数真核生物的mRNA小于10kb，因此用于cDNA文库构建的载体通常选质粒。, 双链cDNA的克隆,双链平头的cDNA通常可以使用下列三种方法克隆入载体中：, 平头末端直接与载体连接，但插入的片段无法回收； 平头两端分别接同聚物尾，最好是AT同聚物尾，以便重组 分子通过加

32、热局部变性和S1核酸酶处理回收插入片段； 加装人工接头引入酶切口(必要时需对cDNA进行甲基化处理)， 以便插入片段回收；,减数cDNA文库,DNA分析,DNA重组技术 DNA杂交技术 DNA文库的构建和筛选 DNA聚合酶链反应 DNA测序技术 DNA多态性及其检测 基因结构的分析 DNA芯片技术,DNA聚合酶链反应(PCR),DNA聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction)又称为PCR扩增技术，是一种高效、快速、特异性的体外DNA聚合程序。,1985年，美国PE-cetus公司人类遗传研究室的 Kary mullis发明了具有划时代意义的PCR技术； 1988年，Ta

33、q DNA聚合酶的发现；美国PE-cetus 公司推出世界上第一台PCR热循环仪； 1993年，Kary mullis因发明PCR技术获得诺贝尔 化学奖； 1995年，定量PCR仪诞生；,PCR反应的基本原理,PCR反应的质量标准,特异性：序列选择,有效性：序列产量,准确性：序列对错,上述标准并非由单一因素所决定，因此在PCR反应中必须对多种参数进行联合控制和改进。但由于PCR反应中的各参数往往是相互影响的，因此任何参数的改进不可能同时满足特异性、有效性、准确性。,PCR的反应条件,DNA聚合酶, DNA聚合酶对PCR准确性的影响,主要取决于DNA聚合酶所具有的负责对错误掺入的碱基进行校正的3

34、5核酸外切酶活性。出错率为1.6X106-2.1X104。, DNA聚合酶的使用, 特异性的改进：在建议使用的范围内尽可能地降低酶浓度。 浓度过高会降低特异性，同时也导致不必要的消耗。, 准确性的改进：建议使用高保真的DNA聚合酶。,DNA聚合酶, 常用的DNA聚合酶,Taq DNA聚合酶(Thermus aquaticus) Taq DNA酶的聚合出错率较高(2.1X10-4)，因为它没有35的外切酶活性和校正功能。但是通过优化反应条件，可使Taq聚合酶的出错率降低到原来的1/3。Taq DNA聚合酶催化的聚合反应的普遍错误类型是由AT转换为GC；如果模板DNA具有形成二级结构的可能性则Ta

35、q DNA酶还常常导致扩增产物的缺失突变。,注意避免稀释保存Taq DNA聚合酶。,DNA聚合酶,Pfu DNA聚合酶(Pyrococcus furiosus),Pfu是一种高保真的DNA聚合酶，出错率极低 (7.0X107-1.6X106)；扩增出的产物带有平头末端；扩增速度极快，达1.5-2 min/kb；Pfu DNA聚合酶的热稳定性很高。,DNA和RNA均可作为PCR扩增反应的模板，但一般情况下，mRNA需先逆转录成cDNA再进行扩增。,PCR的模板, PCR模板的来源,纯净物：重组质粒、制备的染色体DNA、回收的DNA片段等； 粗样品：粪便、脑脊髓液、血液、食物、动物贝壳、土壤、 尿

36、液、唾液、福尔马林固定剂、组织切片、脓汁、 喷嚏液、痰液、毛发等；,粗样品中含有大量的PCR反应抑制物质，必须去除这些种类繁多的抑制剂或者添加必要的PCR反应增强剂显得十分重要。,PCR的模板, PCR模板的处理,特异性的改进：增加模板的量。, 从样本中抽提DNA或使DNA分子暴露出来； 包括：裂解细胞、去除蛋白质等, 去除粗样品中抑制PCR反应的物质； 包括：样品稀释、溶剂萃取、乙醇沉淀、高速离心、超滤等, PCR模板的使用,模板浓度的变化很大程度上取决于待扩增的碱基序列。一般而言，模板DNA长度小，PCR扩增产物的量就大。,PCR的引物, PCR引物的设计原则,引物的长度,理想的引物长度应

37、该在15-30bp之间，常见的是20-27bp。引物越长，特异性越高，但成本也越高。,引物的序列,引物与模板完全互补的序列要大于50%，但引物的3至少应有1-2bp是特异的；应避免模板DNA上存在潜在的引物同源区域，引物序列内部(尤其是3)应杜绝互补区域的存在。,在不影响扩增反应特异性的前提下，可在引物的5端引入诸如限制性内切酶识别位点、启动子序列等有用的非模板序列，为扩增后操作提供便利条件。,PCR的引物,引物的GC含量,应在35%-65%之间，最好在45%-55%范围内。如果因靶序列的原因，引物不得不含有过高的GC碱基，那么就在其5端设计一串A或T；同样，如果引物中的AT含量过高，就在其5

38、端设计一串G或C，以便将整条引物的GC含量控制在合适的范围内。,引物长度20bp，Tm = 4 x (G+C) + 2 x (A+T) () 引物长度20bp，Tm = 62.5 + 0.41 x (GC%) - 500 / 长度 (),引物的熔点温度(Tm值),在很多情况下，两条引物的Tm不尽相同，但只要在55-75范围内，且两者相差4-6，尚不至于影响RCR扩增反应的产量。如果两条引物的Tm差别过大，可以适当延长较低Tm值的引物的3端(这样可以保持扩增产物的长度不变)或5端。,PCR的引物, PCR引物的使用, 特异性的改进：降低引物的浓度。 高浓度的引物往往会导致非特异性的退火及副产物形

39、成，同 时也会促进引物二聚体的产生。在模板量一定的情况下，降 低引物浓度实际上也是降低引物与模板的分子之比。, 有效性的改进：增加引物与模板的分子比。如果引物中有不 配对的碱基，则适当降低引物的浓度。, PCR引物的标准使用范围：0.1-1.0mM，最好0.2-0.5mM。,PCR反应的其它参数, 脱氧三磷酸核苷酸(dNTPs), 特异性的改进：降低dNTPs的浓度，但Mg2+的浓度也应同步降低。, 准确性的改进：降低dNTPs的浓度，但Mg2+的浓度也应同步降低。, 有效性的改进：对于较大分子量的模板，应适当提高dNTPs的量。, dNTPs的标准使用范围：20-200 mM。,如果一种dN

40、TP的浓度过高，它就会优先掺入到延长链中，造成扩增产物的不准确，因此要保持四种dNTPs的一致。,PCR反应的其它参数, 镁离子(Mg2+), 特异性的改进：降低Mg2+浓度，但过低的Mg2+浓度又会影响扩增效率。, Mg2+的标准使用范围：0.5-10 mM。, 有效性的改进：提高Mg2+浓度，但过量Mg2+将导致非特异性扩增。,Mg2+的浓度是PCR反应系统的主要优化参数，尤其当扩增产物长度大于1kb时，这个参数显得更为重要。,PCR反应的其它参数, 预热温度和时间,标准使用范围：92-96；30秒-10mins,在酶不存在时，预热能灭活样品中有害的蛋白酶和核酸酶，同时又能保证模板的完全变

41、性，尤其是基因组DNA直接作为模板使用时，更显得重要。, 变性温度和时间,标准使用范围：92-96；30-120秒, 标准使用范围：37-65；10-120秒, 特异性的改进：提高退火温度；减少退火时间。,PCR反应的其它参数, 退火杂交温度和时间,退火温度一般要比估计的相应的引物Tm低5左右。,必要时一般可比建议的退火温度提高2-5；过长的退火时间在正常情况下并不能提高产量，只会增加非特异性引物杂交的可能性。,PCR反应的其它参数, 延伸聚合温度和时间,标准使用范围：72；60-120秒,常用的DNA聚合酶的聚合速度每秒至少50bp，如果PCR扩增产物长度400bp，聚合时间可以少于15秒，

42、特别是当退火温度选得较高的时候，在退火阶段就有一些单体掺入。如果扩增产物比较长，则需要相应延长反应时间，最好比理论计算时间更长些，以弥补由于反应系统粘度增大所产生的反应滞后作用。,PCR反应的其它参数, 循环次数,Nf = N0 (1 + Y)N,PCR产物呈指数扩增，最终的DNA扩增量可用如下公式计算,其中：N循环次数，N0起始拷贝数，Nf最终拷贝数， Y平均每次的扩增效率, 特异性的改进：降低循环次数，减小扩增片段长度。, 有效性的改进：对于1kb的扩增片段，可增加循环中各步骤的时间。,PCR技术的衍生,筑巢式PCR(nested PCR),先用一对引物进行PCR扩增，然后用所扩增的DNA

43、片段内侧的第二对引物进行第二次PCR反应。,特点：此法可明显提高反应的特异性，增加扩增效率。,PCR技术的衍生,反转录-PCR(RT-PCR),一种以mRNA为模板，经cDNA扩增出DNA的技术，能极其灵敏地检测到任何基因的转录物，而与mRNA的相对量无关。,标准步骤：, mRNA的分离； cDNA反应的引物退火； mRNA反转录为cDNA； cDNA的PCR扩增；,引物选择：, 基因特异性引物(GSP)； 寡聚dT引物； 随机六聚体引物；,PCR技术的衍生,反向-PCR(inverted-PCR),可以扩增已知基因外测，而不是内侧的DNA序列。,PCR技术的衍生,不对称PCR(asymmet

44、ric PCR),在PCR扩增循环中引入不同的引物浓度，使得由两条引物介导的扩增反应呈不对称状态。,不对称PCR中的两条引物浓度一般采用50-100:1的配比。在最初的10-15个循环中，主要产物还是双链DNA，但是当低浓度的引物耗尽后，高浓度引物引导的PCR反应便会产生大量的单链。,PCR技术的衍生,多重PCR(multiplex PCR),加入多对引物，对同一模板的若干区域进行同时扩增。,适用于绘制真核生物庞大基因或基因组中的缺失图谱，如分子病的临床辅助诊断。,PCR技术的衍生,锚定PCR(anchored PCR),又称为cDNA末端快速扩增PCR，主要用于扩增和克隆5端未知的cDNA序

45、列。,PCR技术的衍生,原位PCR(in situ PCR)：PCR技术与原位杂交技术结合的产物,原位杂交技术可以检测到10个拷贝的DNA或细胞，而原位PCR技术能使杂交的灵敏度提高10倍，也就是说可以在1mg的细胞DNA样品中检测到1个拷贝的特定DNA序列。,标准步骤：, 待检测的组织或细胞用甲醛溶液固定； 用蛋白酶对细胞进行通透性处理，确保PCR试剂能进入细胞； 对DNA或RNA靶序列进行胞内原位扩增； PCR扩增产物通常用地高辛系统标记，以便检测；,PCR技术的衍生,定量PCR(quantitative PCR),用一种标准物作为对照估计出另一种特异性靶DNA或RNA分子的含量。,终点法

46、定量PCR：在PCR反应结束后，对其产物进行分析和定量检测,构建内标的原则, 具有与靶基因相同的扩增条件和扩增效率； 探针结合位点不同于靶基因； 已被精确定量；,构建内标的方法, 靶基因扩增产物的突变子； 限制性酶切片段的插入或缺失； 含靶基因引物结合位点的非同源性DNA序列；,荧光实时定量PCR：在PCR反应的每一个循环后，分别检测PCR产量,PCR技术的衍生,TaqMan探针, 必须与模板序列完全吻合， 长度以20-30bp为宜； 必须位于引物对的中间， 不能与引物重叠； GC含量控制在40-60%，避免 单碱基重复；Tm值高于引物 10C；,PCR技术的衍生,Ct,Ct,Fluoresc

47、ence,Cycle number,Ct：循环阈值,荧光实时定量PCR的优越性,PCR技术的衍生, 保证采样点处于PCR扩增的指数期； 大大减少了非特异性扩增的干扰； 很高的重复性和可靠性； 无需打开反应管检测，减少了污染的可能性； 可以进行高通量的定量分析；,PCR技术的应用, 特定DNA序列的克隆和重组子的鉴定,PCR技术的应用, DNA的体外定点突变和分析,PCR技术的应用, 检测病原体, 辅助临床诊断, 检测病变基因的缺失或缺损(扩增产物变小或无扩增产物); 检测病变基因的点突变(扩增产物电泳迁移率改变); 检测病变基因的重排(扩增产物大小改变); 检测病变mRNA的结构(扩增产物大小

48、改变); 检测染色体易位(扩增产物大小改变); 骨髓移植的PCR指纹图谱快速配型(随机引物扩增);,DNA分析,DNA重组技术 DNA杂交技术 DNA文库的构建和筛选 DNA聚合酶链反应 DNA测序技术 DNA多态性及其检测 基因结构的分析 DNA芯片技术,DNA测序技术,双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)：一种核苷类似物，可以在DNA聚合酶 催化的DNA合成中取代链上任意位置的脱氧核苷酸，终止DNA合成。,DNA测序技术,双脱氧末端终止法(Sanger法)的基本反应,DNA测序技术,双脱氧末端终止法(Sanger法)的基本操作,DNA分析,DNA重组技术 DNA杂交技术 DNA文库的构建和筛选

49、DNA聚合酶链反应 DNA测序技术 DNA多态性及其检测 基因结构的分析 DNA芯片技术,DNA多态性及其检测,DNA变异涉及:, 染色体数目的变化和染色体结构的变化(染色体畸变), 可以通过显微镜来检测; DNA上一个或几个碱基的变化，无法在显微镜下观察;,基因突变： 发生频率1%的变异，往往无明显效应。,DNA多态性及其检测,DNA多态性的研究计划,人类基因组多样性计划： 比较不同人种的差异 环境基因组计划： 区分个体对环境相关疾病易感性的差别； 药物基因组计划： 研究个体对药物反应存在的差异；,DNA多态性的类型, 可变数目串联重复多态性 (variable number tandem

50、repeat, VNTR),因等位片段(基因)内部的串联重复核苷酸单元的拷贝数不同而呈现的等位片段(基因)长度多态性，在基因组中广泛分布。, 小卫星DNA (minisatellite DNA)： 中等长短的串联重复DNA顺序，重复单元长6-70bp 微卫星DNA (microsatellite DNA)： 短串联重复顺序(short tandem repeat, STR)，以1-6bp为重复单元, 单核苷酸多态性 (single nucleotide polymorphism, SNP),基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。,DNA多态性的类型,SNP占所有已知多态性的9

51、0%以上,在人类基因组中广泛存在，平均每500-1000个碱基对中就有1个，估计其总数300万个。, 散在重复的DNA顺序多态性,如Alu I重复顺序在不同人群中存在明显不同的多态分布。,DNA多态性的检测, 限制性片段长度多态性分析 (restriction fragment length polymorphism, RFLP),基因组DNA经某一种限制性内切酶完全酶解后，会产生分子量不同限制性等位片段。凡能引起酶切位点改变(原有酶切位点的消失或出现新的酶切位点)的DNA变异,均可导致限制性等位片段长度发生变化，这种变化引起的多态现象即为RFLP。, 抽提基因组DNA，并用限制性内切酶消化；

52、 凝胶电泳分离限制性片断，并转移至膜上； 标记DNA探针，并与膜上DNA杂交； 放射自显影或酶学检测；,基本步骤：,DNA需要量大；检测技术繁琐；带型少，信息量小；, 扩增片段长度多态性分析 (amplified fragment length polymorphism, AFLP),通过选择性扩增基因组DNA酶切片段，产生扩增产物的多态性。其本质也是为了显示限制性片段长度多态性。,该技术结合了RFLP技术的稳定性和PCR技术的简便高效性，同时又克服了RFLP带型少、信息量小的缺点。, 用限制性内切酶消化基因组DNA，形成大小不等的随机片段； 在这些片段的两端接上特定的寡聚核苷酸接头； 根据接

53、头序列设计引物，并在引物的3端加入1-3个碱基； 对限制性片段进行选择性PCR扩增； 通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离扩增产物；,基本步骤：,DNA多态性的检测,DNA多态性的检测, 简单序列长度多态性分析 (simple sequence length polymorphism, SSLP),微卫星DNA标记是继RFLP后发现的第二代DNA多态性标记。每一个微卫星DNA序列核心单元的重复次数在人群中具有广泛的个体差异，会产生不同长度的等位片段，这种多态性即为SSLP。, 用杂交的方法筛选微卫星DNA序列两端保守的单拷贝序列； 根据侧翼两端的保守序列设计一对PCR引物； 以此PCR引物，对不同个体的

54、DNA样本进行PCR反应； 通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析PCR产物；,基本步骤：,微卫星DNA多态性可用于亲子鉴定和DNA指纹分析。,DNA多态性的检测,(CA)n二核苷酸重复序列在一个家系中的PCR检测结果,DNA多态性的检测, 单链构象多态性分析 (single-strand conformation polymorphism, SSCP),DNA的构象是由碱基组成决定的，片段中单一碱基的置换即足以引起单链DNA空间构象的改变，并导致该单链DNA分子的电泳迁移率发生相应变化。通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，可以将突变的DNA片段与正常的DNA片段加以区分。, PCR扩增待测片段； 将扩增片段变

55、性解链； 在中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离； 观察凝胶电泳的条带位移变化；,基本步骤：,SSCP检测的DNA片段不宜过长，以220bp为佳，超过300bp会降低检测的灵敏度。一般情况下，SSCP的检出率约为80%。,DNA多态性的检测, 变性梯度凝胶电泳 (denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE),DNA片段双螺旋的解链温度由该段DNA的碱基数目和碱基组成共同决定。在含有化学变性剂的聚丙烯酰胺凝胶中，DNA双螺旋行进到某一变性梯度时会发生解链，解链后的DNA迁移速率会大大减小。因此，大小相同、序列不同的双链DNA片段可以因解链发生时间的不同而在

56、梯度凝胶电泳中得以分离。,一种在疾病候选基因中筛选单碱基多态(突变)的方法，检出率可达90%以上。, 温度梯度凝胶电泳 (temperature gradient gel electrophoresis, TGGE),用温度梯度代替化学变性剂。,一种以杂交为基础用于检测已知突变的技术。,DNA多态性的检测, 等位基因特异性寡核苷酸分析 (allele-specific oligonucleotide, ASO),SNP的特点：第三代DNA多态性标记, SNP的分布比微卫星DNA的位点更为普遍； 在遗传上非常稳定； 有些SNPs可直接改变蛋白结构和表达水平，可能是候选致病位点； 易于进行自动化分

57、析，可进行有效的高通量筛查；, MassARRAY质谱仪系统 以引物延伸法结合质谱分析为原理，用于大规模SNP基因型分析,优点：精确度高；通量大；自动化程度高；, DNA芯片技术,DNA多态性的检测,Extended Primer (26-mer),Extended Primer (24-mer),MassEXTEND Reaction,SEQUENOM, Inc. 2001 All Rights Reserved,DNA分析,DNA重组技术 DNA杂交技术 DNA文库的构建和筛选 DNA聚合酶链反应 DNA测序技术 DNA多态性及其检测 基因结构的分析 DNA芯片技术,基因结构的分析,通常仅

58、由一条环状双链DNA分子组成； 基因组中只有1个复制起始点； 基因是连续的，无内含子，转录后不需要剪切； 基因组中重复序列很少，编码顺序一般不会重叠； 具有操纵子结构；,原核生物基因组特点,操纵子(operon)：指数个功能上相关联的结构基因串联在一起，连同上游的调控区(包括启动子和操纵基因)以及下游的转录终止信号所构成的基因表达单位，所转录的RNA为多顺反子。,基因结构的分析,阻遏状态,诱导状态,大肠埃希菌乳糖操纵子负调控模型,基因结构的分析,真核生物基因组特点, 断裂基因 真核生物的结构基因是不连续的，编码氨基酸的序列(外显子)被 非编码序列(内含子)所打断。, 顺式作用元件(cis-ac

59、ting elements） 与结构基因表达调控相关、能够被调控蛋白特异性识别和结合的 DNA序列，包括启动子、增强子和一些转录因子的反应元件。,基因5和3末端定位, S1核酸酶作图法,利用S1核酸酶只能降解单链，不能降解双链的特点，先将末端标记的靶DNA探针变性，再与互补的RNA分子杂交，杂交体经S1核酸酶切割后在变性的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分析。,若采用目的基因上不同区段的DNA作为标记探针进行杂交，不但可确定基因的末端，也能确定该基因内部内含子的位置。,基因5和3末端定位, 核糖核酸酶保护法,基因5和3末端定位,利用体外合成的放射性标记的反义RNA探针与待检RNA进行杂交，所得的RNA:RNA杂交体经单链特异性的核糖核酸酶除去未杂交部分后，在变性的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分析。,基因5和3末端定位,与S1核酸酶作图法相比，此法更为灵敏，产生的假象较少，已成为mRNA末端定位以及确定内含子在相应基因中位置的标准方法。但是两种方法都无法区别真正的5末端与5末端的缺失。,基因5和3末端定位,通过凝胶电泳和放射自显影来分析RNA