低聚糖与水溶性膳食纤维对婴儿肠道菌群益生作用研究

低聚糖与水溶性膳食纤维对婴儿肠道菌群益生作用研究秦雪梅，刘静，霍贵成东北农业大学乳品科学教育部重点实验室，哈尔滨150030摘要目的通过体外静置培养，分析低聚糖包括低聚果糖FOS、低聚半乳糖GOS和水溶性膳食纤维聚葡萄糖POL对婴儿肠道菌群的益生作用。方法取完全母乳喂养的新鲜婴儿粪便，加已灭菌的磷酸盐缓冲液，离心，取其上清液按10的体积比加到培养基中，在厌氧箱中静置培养，在不同时间取样，测定婴儿肠道的菌落状态及其各种肠道菌群的数量变化，用益生指数PI表示；通过测定不同时间代谢产物的PH来判断低聚糖和水溶性膳食纤维的抗发酵能力，和被降解速率，最后分析代谢产物中的短链脂肪酸SCFA含量，综合比较它们的益生作用。结果分析，FOS、GOS、POL都有一定的益生作用，POL的抗发酵能力比较显著。关键词低聚糖；水溶性膳食纤维；PI值；短链脂肪酸中图分类号TS2014文献标志码A文章编号10059989201106009605PREBIOTICEFFECTSOFOLIGOSACCHARIDESANDSOLUBLEDIETARYFIBERONINFANTINTESTINALFLORAQINXUEMEI,LIUJING,HUOGUICHENGKEYLABOFDAIRYSCIENCE,MINISTRYOFEDUCATION,NORTHEASTAGRICULTURALUNIVERSITY,HARBIN150030ABSTRACTOBJECTIVEPROBIOTICEFFECTSOFFRUCTOOLIGOSACCHARIDESFOS,GALACTOOLIGOSACCHARIDEGOS,ANDPOLYDEXTROSEPOLONINFANTINTESTINALFLORAWEREANALYZEDINVITROINTHISSTUDYMETHODSFRESHSTOOLOFINFANTSFEDBREASTMILKEXCLUSIVELYWASSELECTED,MIXEDWITHSTERILEPBSANDCENTRIFUGED,THENTHESUPERNATANTWASADDEDTOTHECULTUREMEDIUMWITHTHERATIOOF10V/VINPLATESTHEPLATESWEREINCUBATEDINTHEANAEROBICMEANWHILESAMPLINGATDIFFERENTTIMEANDDETERMININGTHESTATUSOFINFANTINTESTINALBACTERIAANDTHECHANGESINTHENUMBEROFINTESTINALFLORAWHICHWASEXPRESSEDASPREBIOTICINDEXPITHEANTIFERMENTATIONCAPACITYANDDEGRADATIONRATEOFOLIGOSACCHARIDEANDWATERSOLUBLEDIETARYFIBERWEREALSODETERMINEDBYTESTINGTHEPHVALUESOFDIFFERENTMETABOLITESINDIFFERENTTIMESWHILETHECONTENTSOFSHORTCHAINFATTYACIDSSCFAINMETABOLITESWEREANALYZED,THUSTOEVALUATETHEIRPROBIOTICEFFECTSRESULTALLOFFOS,GOSANDPOLSHOWEDPROBIOTICEFFECTSTOSOMEDEGREETHOUGHTHESIGNIFICANTHIGHERANTIFERMENTATIONCAPACITYWASSEENINPOLKEYWORDSOLIGOSACCHARIDESSOLUBLEDIETARYFIBERPIVALUESSHORTCHAINFATTYACIDS收稿日期20101206通讯作者基金项目东北农业大学生物乳制品理论与技术创新团队项目CXT007。作者简介秦雪梅1983，女，河北张家口人，硕士研究生，研究方向为乳制品发酵。96食品科技FOODSCIENCEANDTECHNOLOGY食品开发2011年第36卷第6期通常认为，益生元PREBIOTICS是那些能够选择性地促进机体肠道内原有的一种或有限几种有益细菌益生菌生长或其活性的一种非消化性的食品功能因子1。主要是指各种寡糖或低聚糖，它们除了能增殖双歧杆菌、乳酸杆菌之外；主要的发酵终产物是短链脂肪酸SCFA。目前一些研究认为聚葡萄糖也具有益生元的作用，可促进肠道双歧杆菌、乳酸杆菌等有益菌的生长繁殖，同时产生大量短链脂肪酸，如乙酸、醋酸、叶酸和乳酸，改变肠道PH，改善有益菌群的繁殖环境，从而加快肠道蠕动，使粪便顺利排出，可有效地预防便秘2。便秘的不良后果有很多，时常伴有食欲不振，导致营养不良、精神萎靡、肠道功能紊乱，这样会加重便秘。由此，找到对婴儿肠道菌群有益生作用，可以有效预防婴儿便秘的益生元尤为重要4。婴儿理想的益生元应是被益生菌高度选择性发酵的，可以促进双歧杆菌、乳酸杆菌增殖，抑制大肠杆菌等致病菌生长，其代谢产物应和母乳喂养婴儿的代谢产物相似。目前对益生元作用的研究仍以体内分析法居多，这种方法不但所需条件苛刻，而且费时费力。采用厌氧发酵的体外分析方法，不但能节省时间，还能更好地控制整个发酵过程。体外分析益生元的方法由RYCROFT等5的静置培养基发展到MACFARLANE等6的三阶段恒化器或肠道模型法。OLANOMARTIN等7和PALFRAMAN等8也分别采用了静置和动态培养方法，分析了大量寡糖及低聚糖的益生元活性，有的还结合了体内分析方法，证实了2种方法的一致性RYCROFT等5。本实验通过体外培养的方法，验证其对婴儿肠道菌群的益生作用，为其在婴儿食品的应用方面提供参考依据。灭菌15MIN待用。碳水化合物溶液10，W/V通过022M孔径过滤添加到培养基中，作为唯一的碳源。VK1SIGMA公司10L通过022M孔径滤膜过滤除菌后添加到培养基中。在厌氧条件下培养，培养发酵的过程中PH不受控制5。112主要仪器高效液相色谱仪WATERS2695；色谱柱BIORADAMINEXHPX87H柱30078MM；示差折光检测器WATERS2487；FORMAANAEROBICSYSTEM1029厌氧箱THERMOELECTRONCORPORATION；离心机ANKEGL20G；高功率恒温数控超声波清洗器KQ800GKDV型。12实验方法121益生作用为了评价碳水化合物对肠道重要有益菌促进生长的能力，在低聚糖和聚葡萄糖发酵的0、8、24H时分别用无菌注射器取100L发酵液，测定其菌落总数和双歧杆菌数、乳杆菌数、大肠杆菌数和梭菌数9。双歧杆菌数测定GB/T4789342008；乳酸杆菌数测定采用GB/T4789352008；梭菌数测定采用GB/T4789132003；大肠杆菌数测定采用GB/T478932008；菌落总数的测定采用GB/T478922008。同时测定发酵液的OD值，作为参考。为了比较各种碳源的益生影响，用下面的公式计算生物指数PIBIF/TOTALESC/TOTALLAC/TOTALCLOS/TOTAL式中BIF、ESC、LAC、CLOS分别表示培养一定时间后双歧杆菌、大肠杆菌、乳杆菌、梭菌与对应菌初始时间的菌数之比；TOTAL为培养一定时间后的总菌数与初始时间总菌数之比。122PH测定评定低聚糖和水溶性膳食纤维被微生物的发酵速率，通过PH的变化来判断各种碳源被婴儿肠道菌群发酵的程度。分别在培养时间0、2、4、8、24H时，取3ML代谢产物，测定其PH，同时计算出PH的下降值10，观察不同碳源的发酵液的PH变化。123代谢产物短链脂肪酸的测定1231高效液相色谱条件乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐的测定用色谱柱BIORADAMINEXHPX87H柱300MM78MM，流动相是0005MOL/L的H2SO4，过膜，脱气，流速是06ML/MIN，温度是50。用示差折光检测器，进样量20L11。1材料和方法11材料和仪器111试剂与材料低聚果糖FOS、低聚半乳糖GOS保龄宝生物股份有限公司；聚葡萄糖POL河南金润食品添加剂有限公司；氢氧化钡、硫酸锌分析纯，天津市东丽区天大化学试剂厂。培养基成分蛋白胨2G，酵母浸出物2G，K2HPO4004G，KH2PO4004G，MGSO27H2O001G，CACL22H2O001G，NAHCO32G，半胱氨酸HCL05G，胆盐05G，吐温802ML，氯化血红素005MG/ML10ML，刃天青00254ML，用蒸馏水定容至1000ML，调节PH为70，121下1232短链脂肪酸标准溶液的制备取甲酸、97食品科技FOODSCIENCEANDTECHNOLOGY食品开发2011年第36卷第6期乙酸、丙酸、丁酸标准品，加去离子水配成100MMOL/L的标准储备液，稀释至合适的浓度，各浓度取1ML及试液注入色谱仪，平行测定3次，以色谱峰峰面积定量。1233代谢产物中短链脂肪酸含量测定分别在0、8、24H时取发酵液上清液2ML，加入4ML18BAOH2加4ML2ZNSO4剧烈震荡，自然沉淀10MIN，13000R/MIN离心15MIN，除去菌体和其他微粒，取1ML上清液进入液相色谱仪检测。实验测定了5位婴儿粪便中4种肠道菌的菌数变化，分别以低聚糖和水溶性膳食纤维为唯一碳源的研究中，发酵8H时，实验组中的双歧杆菌、乳酸菌及大肠杆菌的菌落总数都有所增加，FOS和GOS组的双歧杆菌增长比较快，POL组的双歧杆菌增长速度相对比较缓慢。发酵24H后，FOS和GOS组的乳酸杆菌数继续上升，双歧杆菌数有所下降，大肠杆菌和梭菌的生长受到明显的抑制。但是POL组的双歧杆菌数和乳酸杆菌数都有明显的增长，大肠杆菌数下降。以不同碳源为底物的婴儿粪样在静置发酵8H和24H的各细菌数见表1。2结果与分析21益生作用表1不同碳源发酵过程中对婴儿肠道细菌数量的变化LGCFU/MLSD碳源时间BIFLACESCCLOSTOTAL0812003628021691032551045894063FOS824887023854011703011720023756011745007614012614029931004956012GOS824896003856012709004723004758022753015621011616006932035958042POL824875005901022696013731020746011732009608022576015921003963004比较缓慢，在之后的4H，FOS组的下降幅度赶上GOS组，POL组与它们之间的PH差距逐渐拉大。由表4可知，在开始的4H和8H以FOS和GOS为碳源的发酵组，PH下降幅度相近，比较快。以POL组为碳源的发酵组PH相对其他2组下降比较慢。在之后的16H，以POL为碳源的发酵组PH下降幅度小，FOS组最快，依次为FOSGOSPOL。POL组PH下降速度比较缓慢，所需时间较长。由此可见POL的抗发酵能力比较强。23代谢产物中短链脂肪酸含量表5不同碳源代谢产物SCFA含量的平均值MMOL/L，平均值SD通过计算得出的PI值如表2所示，可知，在发酵8H，FOS、GOS和POL都有一定的益生作用。在24H，POL的益生作用持续的时间比较长，效果比较显著。表2以不同碳源为底物的婴儿粪样发酵8H和24H的PI值时间FOSGOSPOL8H24H02315022490242502192023560336422PH的变化FOS、GOS和POL在发酵过程中0、2、4、8、24H的PH见表3。表3底物为不同碳源的粪样在不同发酵时间中的PH碳源时间/H乙酸盐丙酸盐丁酸盐碳源0H2H4H8H24H08230050601405015870344100615002FOSGOSPOL893892894788745802730732745605545642512479586FOS241083395801224067082421062980451138909016290073604305021180322902由表3可知，在发酵开始2H，GOS组的PH就表现出明显的下降优势，POL组的PH下降的速度GOS表4不同碳源的粪样在各个时间段的PH变化值08242308496032136085060354101161023060130701108028碳源04H48H824HPOLFOSGOSPOL163160149125187103093066056由表5可知，所有底物发酵8H后，乙酸盐含量都有所增加；发酵24H后，乙酸盐含量较8H时98食品科技FOODSCIENCEANDTECHNOLOGY食品开发2011年第36卷第6期有明显增加，POL组的乙酸盐含量最高。GOS和FOS发酵组乙酸盐增加幅度相近，且实际含量相差不多。发酵8H后的丙酸盐含量均有明显增加，FOS组增加比较快，GOS组的丙酸盐含量比较少，但是丁酸盐含量比FOS和GOS组高。发酵24H后的，GOS组的丙酸盐含量还是最少，POL组的丙酸盐含量相对比较高。总体分析，POL组的主要SCFA是乙酸盐和丙酸盐，丁酸盐含量几乎很少；FOS组和GOS组的乙酸盐含量也比较高，还产生一些丁酸盐。可以看出，以0H为对照，以不同碳源为底物的婴儿粪样发酵8H后，短链脂肪酸含量都有所增加。发酵24H后，POL组短链脂肪酸含量增加显著，尤其是乙酸盐含量。做高效液相分析时发现FOS、GOS和POL还产生了其他种类的短链脂肪酸，例如乳酸。物的溶解度、聚合度等化学特性。肠道菌群通过产生SCFA，对人体多个器官和代谢产生较大的影响17。结肠上皮细胞中SCFA的代谢活动，可能是肠道细菌与宿主间相互作用最重要的体现。3种主要的SCFA，如乙酸、丙酸和丁酸，对上皮细胞的代谢具有重要意义。母乳喂养的婴儿几乎不产生丁酸盐，而乙酸盐占96，接近于总的SCFA，和母乳喂养状态接近的被认为益生效果最好18。本研究仅检测了主要的SCFA，如乙酸、丙酸、丁酸。发现POL的主要SCFA组成是乙酸，和母乳接近。但是其是否有一些副作用还有待研究。FOS被双歧杆菌降解，主要产生乙酸、丙酸、叶酸和乳酸，从而改变肠腔PH，降解致病物质，直接抑制病菌生长，并且加快肠腔推进运动。POL主要代谢成乙酸盐和丙酸盐，而几乎不产生丁酸盐；和FOS和GOS相比，POL代谢产生了百分比更高的乙酸盐和更低的丁酸盐，更接近母乳益生元的状态。另外，聚葡萄糖引起了双歧杆菌和乳酸杆菌等有益菌的增殖，也引起梭状芽孢杆菌和大肠杆菌等致病菌的降低。在FOS和GOS组，乙酸含量也很高，但是丁酸盐含量也有所增长。有研究报道，丁酸是上皮细胞特别重要的能量来源，在细胞分化和生长中起着非常重要的作用。目前丁酸对于婴儿的作用报道比较少，还有待于研究。通过上述研究，根据PI值、PH的下降速度、SCFA量综合分析，FOS、GOS和POL对婴儿肠道都有一定的益生作用。在开始的8H，GOS的PI值相对比较高；但是发酵24H后，POL的PI值比较显著。从PH下降的速度考虑，在开始的8H，FOS组和GOS组下降幅度比较大；在整个发酵过程中，POL组PH下降速度比较缓慢，可见POL的抗发酵能力比较强。根据SCFA判断，POL组代谢产物中的乙酸含量比较高，丁酸盐含量比较少，和母乳接近。由此可知，这3种碳源对婴儿肠道菌群都有一定的益生作用，但是对婴儿的生长是否有副作用还有待研究，还需要对其做相关的安全性评价。3讨论PI值是一个定量描述益生元作用的指标，公式是基于发酵过程中主要菌群数量的变化，通过将这些数值带入PI公式进行计算，然后得出具体的PI分数，即PI值；公式中的字母表示的均是比值，即培养一定时间后的菌数与初始时间菌数之比；PI值越大，益生元作用越强1216。PI值是判断益生元作用的一种简单并且实用的方式，通过比较PI值的大小，可以定性、定量地描述益生元的作用。本实验中，通过比较8H和24H时PI值的平均值，可以看出FOS、GOS和POL都有一定的益生作用。相对来说，在开始的8HFOS和GOS组对婴儿肠道中双歧杆菌及乳杆菌的选择性增殖作用较高，在之后的时间发酵速度比较慢，POL组的益生作用持续的时间比较长，在发酵24H时的PI值明显增加。考虑可能是碳链偏长，聚合度高对婴儿肠道菌群的发酵作用有更高的抵抗力，导致发酵的时间延长，远端结肠逐渐膨胀，不容易被婴儿肠道菌选择性发酵，发酵所需时间较长。益生作用持续PH的变化间接说明不同碳源被婴儿肠道菌群发酵的程度及其自身的抗发酵能力，PH下降比较快，说明碳源的抗发酵能力比较弱。POL对婴儿肠道菌群有高的抗发酵能力，导致发酵的时间延长，远端结肠逐渐膨胀，可以减少婴儿便秘的发生。SCFA主要是大肠内碳水化合物发酵和蛋白质降解的产物，产生速率和数量取决于碳水化合参考文献BOEHMG,STAHLB,JELINEKJ,ETALPREBIOTICCARBOHYDRATESINHUMANMILKANDFORMULASACTAPAEDIATR,2005,944491821KUNZC,RUDLOFFS,BAIERW,ETALOLIGOSACCHARIDESIN1299食品科技FOODSCIENCEANDTECHNOLOGY食品开发2011年第36卷第6期HUMANMILKSTRUCTURAL,FUNCTIONALANDMETABOLICASPECTSANNUREVNUTR,2000,20699722AGGETTPJ,AGOSTONIC,AXELSSONI,ETALNONDIGESTIBLECARBOHYDRATESINTHEDIETSOFINFANTSANDYOUNGCHILDRENACOMMENTARYBYTHEESPGHANCOMMITTEEEONNUTRITIONJPEDIATRGASTROENTEROLNUTR,2003,3632937FANAROS,BOEHMG,GARSSENJ,ETALGALACTOOLIGOSACCHARIDESANDLONGCHAINFRUCTOOLIGOSACCHARIDESASPREBIOTICSININFANTFORMULASAREVIEWACTAPAEDIATR,2005,944492226CERYCROFT,MRJONES,GRGIBSON,ETALACOMPARATIVEINVITROEVALUATIONOFTHEFERMENTATIONPROPERTIESOFPREBIOTICOLIGOSACCHARIDESJOURNALOFAPPLIEDMICROBIOLOGY,2001,91878887MACFARLANEGT,MACFARLANES,GIBSONGRVALIDATIONOFATHREESTAGECOMPOUNDCONTINUOUSCULTURESYSTEMFORINVESTIGATINGTHEEFFECTOFRETENTIONTIMEONTHEECOLOGYANDMETABOLISMOFBACTERIAINTHEHUMANCOLONMICROBECOL,1998,3521807OLANOMARTINE,GIBSONGR,RASTELLRACOMPARISONOFTHEINVITROBIFIDOGENICPROPERTIESOFPECTINSANDPECTICOLIGOSACCHARIDESJAPPLMICROBIOL,2002,93350511PALFRAMANRJ,GIBSONGR,RASTALLRAEFFECTOFPHANDDOSEONTHEGROWTHOFGUTBACTERIAONPREBIOTICCARBOHYDRATESINVITROANAEROBE,2002,8528792NEWBURGDSOLIGOSACCHARIDESINHUMANMILKANDBACTERIALCOLONIZATIONJPEDIATRGASTROENTEROLNUTR,2000,30S81711AGGETTPJ,AGOSTONIC,AXELSSONI,ETALNONDIGESTIBLECARBOHYDRATESINTHEDIETSOFINFANTSANDYOUNGCHILDRENACOMMENTARYBYTHEESPGHANCOMMITTEEEONNUTRITIONJPEDIATRGASTROENTEROLNUTR,2003,3632937FANAROS,BOEHMG,GARSSENJ,ETALGALACTOOLIGOSACCHARIDESANDLONGCHAINFRUCTOOLIGOSACCHARIDESASPREBIOTICSININFANTFORMULASAREVIEWACTAPAEDIATR,2005,944492226KNOLJ,SCHOLTENSP,KAFKAC,ETALCOLONMICROFLORAININFANTSFEDFORMULAWITHGALACTOANDFRUCTOOLIGOSACCHARIDESMORELIKEBREASTFEDINFANTSJPEDIATRGASTROENTEROLNUTR,2005,403642MORRISONDJ,MACKAYWG,EDWARDSCA,ETALBUTYRATEPRODUCTIONFROMOLIGOFRUCTOSEFERMENTATIONBYHUMANFAECALFIORAWHATISTHECONTRIBUTIONOFEXTRACELLULARACETATEANDLACTATEBRJNUTR,2006,9657EMMABEARDS,ETALBACTERIAL,SCFAANDGASPROFILESOFARANGEOFFOODINGREDIENTSFOLLOWINGINVITROFERMENTATIONBYHUMANCOLONICMICROBIOTAANAEROBEJUNE,201016BRITTANYM