【基金标书】2011CB504700-重要病毒跨种间感染与传播致病的分子机制研究

项目名称： 重要病毒跨种间感染与传播致病的分子机制研究 首席科学家： 高福 中国科学院微生物研究所 起止年限： 托部门： 中国科学院 二、预期目标 总体目标 本项目根据 国家新发人类传染病 防治上的 战略需求 ，聚焦国际上病毒病研究的 前沿 ，立足于我国重要病毒性传染病 发生与 流行 的现状 ，选择 新型 冠状病毒、 乙脑病毒、登革病毒、狂犬病毒 和 流感 病毒 等 对我国具有严重危害或潜在危害的代表性病毒为主要研究对象，运用病毒学、分子生物学 、细胞生物学 和结构生物学等 现代生命科学技术 手段， 揭示重要病毒尤其是新型病毒在动物宿主中的生态分布特征； 解析 病毒 基因 变异和进化规律 ，阐明 病毒跨种间感染 与致病的 分子基础 ，在病毒跨种间传播研究基础理论方面有突破，进一步推动我国在该领域的研究达到国际先进水平， 为我国新发传染病的防治提供科学支撑 。通过该项目的实施，将不仅培养一批在病毒学研究领域国际创新型拔尖人才和学术骨干， 形成 具有国际竞争力的团队， 而且将建立分子病毒学、分子免疫学和病毒生态学研究等科研基地，为我国新发人传染病的预防与控制水平的持续提升奠定稳固的科学基础。 五年预期目标 建立 自 然贮存宿主 重要 病毒 病原生态学 研究平台 从野生动物中分离 新型冠状病毒、尼帕或类似副粘病毒 、汉坦病毒、流感病毒； 弄清楚 毒直接动物溯源和生态传播链；阐明我国境内蝙蝠体内感染和携带的几种已知人类重要病毒的种类、分布和 病毒在蝙蝠等重要贮存动物贮存和传播的分子机理 ，揭示乙脑病毒在不同动物宿主之间的传播机制与传播关系； 明确高致病性禽流感病毒主要疫源地（青海湖流域、洞庭湖）生态的分布、储存方式、生存及消长规律 ，以及 流感病毒在家禽和哺乳动物的生态分布，建立自然宿主动物病毒资源库。 阐明重要 病毒分子变异 和 进化 的 规律 以及生物学特性 通过对 新型冠状病毒、乙脑病毒、 尼帕或类似副粘病毒 、 流感病毒等 进行病毒的全基因组序列测定 ， 揭示 功能基因组的 遗传 变异 特征；通过基因组信息学 特征 分析，揭示病毒基因组进化规律。 确定登革病毒在蚊子细胞中复制所必须的 5 3势作用元件，鉴定出在登革病毒复制过程中起重要作用的种属特异顺势作用元件和细胞因子。 阐明重要病毒尤其是新型病毒的生物学特性，包括病毒的致病性、传播性和感染性，揭示病毒基因变异对病毒致病性与传播性的影响等，奠定病毒种间传播研究的分子基础。 3、 揭示 跨种间传播中病毒 配体与受体的 作用 机制 用现代分子生物学技术和反向遗传操作技术构建系列假病毒及嵌合病毒 ， 结合蛋白质生物大分子相互作用研究， 阐明 病毒 配体 与不同物种宿主细 胞 受体 的相互作用 机制 ，病毒侵入宿主细胞过程的囊膜蛋白受体结合与融合机制 ； 揭示 部分新型冠状病毒的受体 类型及性质，奠定 型冠状病毒跨物种感染 研究 的 基础 ；通过体外真核表达病毒识别宿主细胞受体蛋白，弄清基因重要结构位点的改变，对其受体结合功能和侵入细胞功能的影响，以及与病毒高致病力的关系； 应用细胞转染等现代技术，在不操作活病毒的基础上，找寻黄病毒受体 。 4、解析重要病毒在不同宿主细胞中的复制 机制 利用现代生命组学等技术解析新型 冠状病毒 、乙型脑炎 病毒 等基因组复制、转录、表达以及组装的机理，弄清病毒蛋白在 不同宿主细胞复制过程中 的作用基础；解析 病毒在不同宿主细胞复制过程中病毒及宿主细胞 及 达谱对不同病毒复制转录的影响与结构基础 ，探讨 病毒感染的种属与组织嗜性及复制的共性与特性 ； 鉴定 出 和登革热病毒 的蚊子细胞蛋白因子，确定它们在病毒 制过程中的作用。 解析 流感病毒聚合酶基因突变、插入、缺失等 对病毒 复制和致病性 的影响。 、 揭示宿主限制性因子在病毒跨 种 间 传播 中的作用 机制 筛选 鉴定出与流感病毒、 汉坦病毒 、狂犬病毒和逆转录病毒 蛋白互作的宿主 细胞 限制性因子 ；通过研究不同种属的宿主限制性因子对病毒感染性的影响， 阐明宿主限制性因子在病毒感染、致病及跨种属感染中的分子机制。 并通过 研究病毒蛋白与宿主细胞内蛋白的相互作用， 筛选与病毒相关蛋白发生相互作用的细胞内靶蛋白，探讨相关新蛋白与靶蛋白之间的相互作用对病毒机能的影响，并为 将来研制小分子药物奠定理论基础。 6、 建立新型病毒感染动物模型 建立不同生理和免疫状态 下 流感病毒或新型冠状病毒等 病毒 感染动物模型 ，揭示实验动物病毒感染、复 制、传播能力、机体免疫应答水平变化、机体病变和进程等 ，结合感染前生理和免疫状态的本底情况， 揭示 免疫应答水平的不同与病毒致病能力的关系， 解析 不同免疫状态导致病毒不同致病能力的分子作用机制 。 建立人 基因小鼠感染模型 ；揭示 和 淋巴细胞比例及分布规律、细胞因子释放情况等免疫反应变化规律， 阐明 制性在病毒跨种 间 传播中的作用 ；建立新型病毒体内分布实时监测小鼠 模型 。 7、人才培养 与基地建设 培养一批在病毒学研究领域国际创新型拔尖人才和学术骨干， 形成 具有国际竞争力的团队， 造就一支跨学科、跨领域 、精诚合作、团结奋进的科研队伍 ， 而且将建立分子病毒学、分子免疫学和病毒生态学研究等科研基地，在新型病毒生态学、病毒生理与病理学、病毒结构学、病毒基因组学等研究领域取得重大突破， 发表 百篇以上 具有国际前沿水平的科研论文， 为我国重要传染病的防治提供理论和科学支撑。 三、研究方案 学术思路 : 本项目 立足于我国重要病毒 传染病 产生与跨种间传播的现状与国家在传染病防控方面的重大需求， 综合现代病毒生态学、分子病毒学、分子生物学、生物信息学、细胞生物学和生物化学等，以解析病毒跨种间传播机理为目标，以新型冠状病毒、黄病 毒、狂犬病毒、流感病毒等为重点研究对象，利用学科交叉，发挥多学科优势，从病毒的生态分布、遗传变异与进化、病毒与宿主细胞相互作用等层面揭示重要病毒跨种间传播与致病的分子机制（见图 1）。 通过本项目 实施 ， 造就 一支在病毒 跨种间传播 研究领域具有国际竞争力的优秀团队， 在新发传染病发生机制研究方面取得重大突破， 为 国家 应对突发公共卫生事件、构筑 公共安全体系、保障人民健康提供 理论依据和 技术支撑。 技术路线： 详见流程图（图 1）。本研究将系统地研究 新型冠状病毒、乙脑病毒、狂犬病毒、流感病毒等重要病毒 的 生态分布、变异进化规律 、病毒与受体的识别、病毒在细胞内的复制机制、宿主限制性因子对病毒复制的影响等，围绕病毒跨种间感染传播与致病的分子机制开展研究工作。 四、年度计划 研究内容 预期目标 第 一 年 1 在全国各地大量采集 蝙蝠、啮齿类动物、食虫目动物的血清、咽拭子和肛拭子样品；采集不同地区，不同动物，包括野生动物、动物园动物和特种养殖经济动物、以及包括鸡、猪和犬等家畜和家禽的棉拭子、组织和血液样品 . 2 进行流感病毒、新型冠状病毒、乙脑病毒等的分离和病毒流行病学调查研究，研究病毒的宿主特征，对分离 鉴定的病毒进行全基因组测定与分析；观察新型病毒的生物学特征，重点是对动物的致病性和传播性流感病毒在不同宿主中的复制及跨种属传播机制； 3 利用原核或真核细胞表达乙型脑炎病毒、登革病毒、流感病毒囊膜蛋白；利用分子筛层析、离子交换等技术分离纯化蛋白；病毒囊膜蛋白的晶体筛选；建立自噬途径研究细胞模型。 4 冠状病毒在不同宿主中的复制及跨种属传播机制；登革病毒在不同宿主中的复制及跨种属传播机制；病毒在不同组织中复制的 达谱对病毒复制的调控及分子机制； 5 以成熟的病毒蛋白与宿主因子互作平台为基础，寻找流感病毒的宿主限 制性因子 ;筛选与汉坦病毒主蛋白（核蛋白为主）相互作用的宿主细胞因子 ;通过蛋白质互作手段，找出种间毒株差异的宿主相关蛋白，并获得不同毒力狂犬病毒株感染的潜伏期早期和感染中、晚期免疫相关细胞和中枢神经组织材料。 6 人 基因小鼠构建 ； 高致病性禽流感病毒、西尼罗病毒等新型病毒嗜神经生物学特征鉴定 1 采集蝙蝠样本 500 份；家畜样本500 份； 2 获得流感病毒、新型冠状病毒、乙脑病毒等的分离毒株和序列；获得分离毒株的致病性和传播性特点。 3 获得不同基因型的乙型脑炎病毒、登革病毒、流感病毒囊膜蛋白；获得部分囊膜蛋白的晶 体结构。 4 对病毒目的基因进行定点突变，观察病毒突变株和野生株对不同宿主细胞及不同组织来源细胞中复制能力的差别，寻找决定病毒在不同种属宿主细胞中复制的关键位点。 5 筛选出 5分别与流感病毒、汉坦病毒及狂犬病病毒蛋白相互作用的宿主细胞因子。 6 获 得 人 基因小鼠。完成5高致病性禽流感病毒、狂犬病毒等新型病毒的生物学特征鉴定，获得至少 4 株具有不同神经嗜性新型病毒。 7 发表研究论文 10 篇以上 研究内容 预期目标 第 二 年 1. 检测新型冠状病毒、新型汉坦病毒、新型副粘病毒新型感病毒在 动物中的感染情况；对病毒检测为阳性样品进行病毒培养 和分离；分析新检测的病毒序列与已知人类同类病毒的差异和进化关系。 2. 继续进行病毒的分离和调查；研究病毒在经过不同宿主传播后病毒生物学特性的改变特征和规律；对分离鉴定的病毒进行全基因组测定，利用基因组信息学分析技术，研究病毒的遗传变异和分子进化规律和特征，并建立病毒的反向遗传操作技术系统。 3. 分离病毒易感细胞膜蛋白，利用 方式筛选候选受体；质谱鉴定候选受体；研究不同流感病毒白与受体的作用特征 ； 在细胞模型上研究自噬影响流感病毒侵入的分 子机制。 4. 流感病毒在不同宿主中的复制及跨种属传播机制；冠状病毒在不同宿主中的复制及跨种属传播机制；登革病毒在不同宿主中的复制及跨种属传播机制；病毒在不同组织中复制的 5. 运用蛋白 追踪宿主限制性因子与病毒核蛋白相互作用后对病毒复制、装配及成熟释放的影响和生物学意义 ; 通过色谱质谱技术对外周免疫相关细胞和中枢神经组织进行蛋白质组学分析，发现狂犬病病毒感染前后宿主在蛋白质组水平表现出的差异点； 6. 建 立病毒体内分布实时监测动物模型，对高致病性禽流感病毒等病毒的感染动力学进行初步探讨。 1. 获得 10 株以上病毒的部分基因组序列； 确定新型病毒与人类病毒在在血清学和基因序列上的差异。 2. 获得流感病毒、新型冠状病毒、乙脑病毒等的分离毒株和全基因组序列；获得流行毒株的遗传变异规律和生物学特性；建立病毒的反向遗传操作系统 1 套 。 3. 获得乙脑病毒、登革病毒细胞候选受体；获得一些影响流感病毒 白与唾液酸受体的重要蛋白残基；初步了解流感病毒如何影响细胞自噬的信号通路 。 4. 获得目的重组病毒；建立人冠状病毒库；揭示不同突变对病毒 译和复制的影响；获得宿主细胞 达谱。 5. 筛选出 2分别与流感病毒和汉坦病毒相互作用的宿主限制性因子；阐明部分宿主限制性因子对流感病毒和汉坦病毒复制的影响及其作用机制；获得狂犬病病毒感染前后宿主在蛋白质水平的差异点 6. 明 确 高 致 病 性 禽 流 感 病 毒 对 在基因小鼠体内感染特性，初步揭示 完成新型病毒的基因组测序，利用生物信息学方法并发现 嗜神经性相关毒力位点，通过反向遗传学手段进行验证。 7. 发表研究论文 20 篇以上 研究内容 预期目标 第 三 年 1. 对检测为阳病毒性的进行病毒分离培养；开展新分类病毒的细胞和动物敏感性实验，评价病毒的宿主范围和对实验动物的致病能力 ; 2. 继续进行病毒分子流行病学的调查与研究，分析病毒的进化和变异规律；利用构建的反向遗传操作技术平台，研究病毒基因点变异、基因突变、基因重配等对病毒致病性和传播性的影响，重点探讨影响病毒传播特性尤其是跨种间传播特性的关键因子或因素。 3. 在细胞模型上对筛选的乙脑病毒、登革病毒候选受体进行进一步的验证 ；流感病毒突变体的表达纯化、与唾液酸受体复合体的晶体结构；在细胞模型上研究自噬影响流感病毒侵入的分子机制。 4. 流感病毒在不同宿主中的复制及跨种属传播机制；冠状病毒在不同宿主中的复制及跨种属传播机制；登革病毒在不同宿主中的复制及跨种属传播机制；病毒在不同组织中复制的 5. 继续探索宿主限制性因子在流感病毒及汉坦病毒复制过程中的调控机制；探索弱毒诱导的早期抗感染因子（宿主限制性因子）的本质和强毒诱导的早期致病因子对宿主限制性因子的影响； 6. 病毒体内分布实时监测动物模型构建； 新 型病毒嗜神经性相关毒力位点的功能研究。 1. 获得 3新分离病毒的全基因组序列 ； 揭示野生动物或家畜冠状病毒的遗传变异情况 。 2. 建立病毒的毒株库和基因库；确定影响病毒致病性和传播性的关键基因位点。 3. 获得 1乙脑病毒、登革病毒受体或辅助受体；从分子结构水平揭示流感病毒 白与唾液酸受体相互作用影响流感病毒跨种间传播的机制；阐明流感病毒表达蛋白如何影响细胞自噬水平 。 4. 揭示病毒在不同宿主上生长能力的动态变化；获得人冠状病毒感染性克隆；获得四种病毒 的细胞蛋白因子。 5. 深入阐明宿主限制性因子在流感病毒及汉坦病 毒复制过程中的调控机制；筛选出 1与狂犬病病毒相互作用的宿主限制性因子 。 6. 通过转基因技术获得流感病毒体内分布实时监测动物模型； 通过细胞学和动物学实验，初步阐明新型病毒嗜神经性相关毒力位点的作用机制 7. 发表研究论文 20 篇以上 研究内容 预期目标 第 四 年 1. 研究新型病毒的受体及其跨种物种感染的分子机理研究； 分析我国汉坦肾出血热疾病主要疫区疾病流行情况与病毒遗传变异的关系；检测犬流感病毒的流行情况。 2. 持续进行病毒的分离，密切关注动物临床和人医临床新型病毒的出现和新型病毒的基因组特征；并利用构建的反向遗传操作技术平台，研究病 毒基因非编码区的作用和功能，探讨病毒基因非编码区核苷酸的改变对病毒致病性和传播性重点是跨种间传播特性的影响 。 3. 根据前三年研究结果，如果未按原计划获得病毒的受体或辅助受体，将采用其他方法进一步筛选；对已筛选到的受体进行体外表达，研究病毒囊膜蛋白与受体的相互作用 。 4. 流感病毒在不同宿主中的复制及跨种属传播机制；冠状病毒在不同宿主中的复制及跨种属传播机制；登革病毒在不同宿主中的复制及跨种属传播机制；病毒在不同组织中复制的 达谱对病毒复制的调控及分子机制 。 5. 比较不同种属的宿主限制性因子对流感病毒感染、致病影 响的差异；比较导致 型和轻型 讨不同种属宿主细胞限制性因子对病毒感染及致病的分子基础和调控机制；进一步解析狂犬病病毒结构蛋白中哪种成分在影响宿主限制性因子方面发挥主要作用。 6. 新型病毒体内感染动力学 研究； 新型病毒嗜神经性相关宿主蛋白 / 1. 揭示蝙蝠、啮齿类动物、食虫目动物在病毒跨种群传播的关键基因序列； 初步弄清楚我国犬流感病毒的可能的来源 。 2. 丰富病毒毒株库和基因库；阐明新型病毒的基因 和生物学特点；确定病毒非编码区的功能位点。 3. 获得重组表达的受体蛋白；阐明病毒囊膜蛋白与受体直接的相互作用能力 。 4. 揭示病毒在体内不同部位的复制能力的差别；揭示病毒突变株和野生株对不同种属细胞感染，复制能力的差别；分析影响病毒在宿主中复制能力的结构基础 。 5. 阐明不同种属宿主细胞限制性因子对流感病毒和汉坦病毒感染及致病的分子基础和调控机制；确定狂犬病病毒结构蛋白中哪种成分在影响宿主限制性因子方面发挥主要作用 6. 完成高致病性禽流感病毒在小鼠体内的感染动力学 研究，揭示高致病性禽流感病毒在哺乳动物体内的组织嗜性和感染过程； 通过蛋白质组学、生物芯片等技术发现与新型病毒嗜神经性相关的宿主蛋白/. 发表研究论文 25 篇。 研究内容 预期目标 第 五 年 1. 新型病毒体内感染动力学 研究； 新型病 毒 嗜 神 经 性 相 关 宿 主 蛋 白/筛选与鉴定 。 2. 持续进行病毒的分离和病毒基因组信息学研究和病毒生物学特性研究；综合分析课题组几年的研究结果，分析病毒基因组的变异在病毒跨种间传播中的作用； 3. 筛选病毒囊膜蛋白与受体复合体的晶体结构； 4. 新型病毒嗜神经性相关宿主蛋白/功能研究 5. 对前 4 年的 研究成果进行进一步的补充和完善，进行项目 的 总结验收。 1. 阐明动物携带的新型冠状病毒、汉坦病毒、流感病毒等与人类疾病的关系 。 2. 完善病毒毒株库和基因库；总结病毒流行规律和影响生物学特性的功能位点 。 3. 获得病毒囊膜蛋白与受体复合体的晶体结构，阐明病毒与受体的相互作用机制，揭示病毒跨种间传播机制 。 4. 阐明宿主限制性因子在流感病毒感染、致病及跨种属感染中的作用及分子机制；阐明汉坦病毒感染后大量包涵体形成的分子机制及免疫病理意义；阐明机体中枢神经系统对狂犬病病毒的固有免疫机制和狂犬病病毒对中枢神经系统的致病机制 5. 发表论文 25 篇以上。 6. 完成项目验收。 一、 研究内容 1、重要病毒在自然宿主中的生态分布 在前期对 我国不同地域 、 不同时间 、 不同宿主动物 病毒如 新型冠状病毒 、乙脑病毒和 汉坦病毒 研究的调查研究基础上，进一步扩大地域与宿主调查， 确定我国境内蝙蝠体内感染和携带的几种已知人类重要病毒的种类、分布和 病毒在蝙蝠等重要贮存动物贮存和传播的分子机理 ，研究乙脑病毒在不同动物宿主之间的传播机制与传播关系；研究 生态环境因素对病毒感染宿主范围的影响 ；评价新型病毒对人与动物的潜在危害 ； 调查流感病毒在野禽、家禽和哺乳动物的生态分布，研究侯鸟迁徙与疫病流行的关系， 为疫病防控政策的制定 提供理论依据；建立病毒在自然宿主的生态分布数据库，奠定重要病毒跨种间传播研究与分析的物质基础。 重要 病毒分子变异、进化规律及其生物学特性 在 对重要病毒 进行生态学和流行病学 调查研究的基础上，以新型冠状病毒、乙脑病毒、狂犬病毒、 流感病毒等重要病毒为研究对象，进行病毒的全基因组序列测定研究，研究功能基因组的变异和进化特征 ；同时研究重要病毒尤其是新型病毒的生物学特性，包括病毒的致病性、传播性和感染性，研究病毒基因变异对病毒种间传播作用的影响等。由于近年来的研究 发 现病毒非结构蛋白和病毒 非编 码区在致病性和传播性也起 到非常重要的作用，因而在全基因组序列 研究中， 要注重研究病毒非编码区变异和进化特征，观察病毒非编码区变异对病毒生物学特性的影响。 3、病毒跨种间传播中病毒与受体的相互作用 以乙型脑炎、 流感病毒等为突破口，研究病毒与受体的亲和特性以及细胞受体和配体的相互作用机制；用现代分子生物学技术和反向遗传操作技术构建系列假病毒及嵌合病毒。结合蛋白质生物大分子相互作用研究，研究病毒与不同物种宿主细 胞的相互作用 ；同时利 用昆虫细胞表达 病毒表面蛋白 及各种突变体蛋白， 从结构层面研究受体与配体的作用，以此为基础，用物理方法（ 生物学 检测 手段研究病毒表面蛋白的突变对受体结合能力的影响。