1.3-1.4 基因工程的应用和蛋白质工程(个人原创精品2015年).ppt

1.3基因工程的应用,第一只转基因动物（1980）,第一只转基因灵长类动物（安迪）,基因工程的应用,转基因抗虫水稻,转基因干扰素（安达芬）,主要在抗病虫害、抗逆性、提高品质等方面的转基因作物。至1998年4月，世界各国批准进行的大田实验已达4387项，其中大豆、玉米、棉花、油菜已经进入商业应用阶段。,一、植物基因工程硕果累累,2001年转基因作物种植面积最大的四个国家及其所占比例,68%,22%,7%,3%,一、植物基因工程硕果累累,1、提高农作物的抗逆能力（抗虫）,转基因抗虫苹果,转基因抗虫棉花,所采用的抗虫基因主要有：Bt毒蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因、淀粉酶抑制剂基因、植物凝集素基因等,一、植物基因工程硕果累累,1、提高农作物的抗逆能力（抗病）,转黄瓜抗青枯(细菌)病基因的马铃薯,抗烟草花叶病毒的转基因烟草,抗病毒：病毒外壳蛋白基因、病毒的复制酶基因,抗真菌：几丁质酶基因、抗毒素合成基因基因,基因,抗细菌：裂解肽基因、溶菌酶基因,一、植物基因工程硕果累累,1、提高农作物的抗逆能力（其他抗逆转基因作物）,抗盐碱和干旱作物：,调节细胞渗透压的基因,耐寒的番茄：,鱼的抗冻蛋白基因,抗除草剂的大豆：,抗除草剂基因,转基因抗除草剂玉米,一、植物基因工程硕果累累,2、利用转基因改良植物的品质,富含赖氨酸的转基因玉米,富含胡萝卜素的“金大米”,转基因延熟番茄,普通番茄,一、植物基因工程硕果累累,2、利用转基因改良植物的品质,转基因龙胆花,转基因蓝猪耳,观赏花卉,问题：颜色单调，变色困难,解决：花青素有关调节基因,转基因牵牛花,二、动物基因工程前景广阔,转基因鲑鱼,导入外源生长激素基因，使转基因动物生长得更快,将肠乳糖酶基因导入奶牛基因组，转基因奶牛分泌的乳汁中乳糖的含量大大减低，其它营养成分不变。,二、动物基因工程前景广阔,乳腺（房）生物反应器：,指以转基因雌性动物个体的乳腺分泌乳汁来生产所需药品。,成果：抗凝血酶、血清白蛋白、生长激素、抗胰蛋白酶,转基因动物生产药物,就基因药物而言，最理想的表达场所是转基因动物的乳腺。,二、动物基因工程前景广阔,用转基因动物作器官移植的供体,器官移植问题：,1、供体器官少2、排斥反应强,具特殊用途的猪和小鼠,三、基因工程药品异军突起,胰岛素分子结构,胰岛素是治疗糖尿病的特效药，长期以来只能依靠从猪、牛等动物的胰腺中提取，100Kg胰腺只能提取4-5g的胰岛素，产量低价格高。将合成的胰岛素基因导入大肠杆菌，每2000L培养液就能产生100g胰岛素，使其价格降低了30%-50%!,含有51个氨基酸，两条肽链，化学本质是蛋白质。所以只能静脉注射胰岛素。,干扰素分子结构,三、基因工程药品异军突起,干扰素注射剂,干扰素是病毒侵入细胞后产生的一种糖蛋白。几乎能抵抗所有病毒引起的感染，是一种抗病毒的特效药。此外对治疗某些癌症和白血病也有一定疗效。过去从人血中提取，300L血才提取1mg！,三、基因工程药品异军突起,人造血液及其生产,人造血液、白细胞介素、乙肝疫苗等通过基因工程实现工业化生产，均为解除人类的病苦，提高人类的健康水平发挥了重大的作用。,四、基因治疗曙光初照,基因治疗：,把正常基因导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能，从而达到治疗疾病的目的，这是治疗遗传病的最有效的手段（根本手段）。,SCID患者生存在无菌环境中,重症联合免疫缺陷（SCID）患者缺乏正常的人体免疫功能，只要稍被细菌或者病毒感染，就会发病死亡。这个病的机理是细胞的一个常染色体上编码腺苷酸脱氨酶的基因（ada）发生了突变。可以通过基因工程的方法治疗。,体外基因治疗：从病人体内获取某种细胞进行培养，然后，在体外完成基因转移，再筛选成功转移的细胞扩大培养，最后重新输入患者体内。,体内基因治疗：用基因工程的方法，直接向人体组织细胞中转移基因的治疗方法。,例如：,囊性纤维病治疗，利用修饰的腺病毒作为载体，将治疗囊性纤维病的正常基因转入患者的肺部组织中。,基因治疗,基因诊断,基因诊断也称为DNA诊断或基因探针技术，即在DNA水平分析检测某一基因，从而对特定的疾病进行诊断。如用白血病患者细胞中分离出的癌基因制备的DNA探针，可以用来检测白血病。探针制备：放射性同位素(如32P)、荧光分子等标记的DNA分子；原理：利用DNA分子杂交原理,1.4蛋白质工程的崛起,辨一辨,基因诊断基因探针基因芯片基因治疗,基因诊断也称为DNA诊断或基因探针技术，即在DNA水平分析检测某一基因，从而对特定的疾病进行诊断。,是一段带有检测标记，且顺序已知的，与目的基因互补的核酸序列。,将数以万计、乃至百万计的基因探针有规律地排列在支持物上，构成的一个二维DNA探针阵列。,把正常基因导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能，从而达到治疗疾病的目的,一、蛋白质工程崛起的缘由,基因工程的实质：,将一种生物的基因转移到另一种生物体内，使后者产生本身不能产生的蛋白质，从而表现出新的性状。,基因工程的实质：,在原则上只能产生自然界已存在的蛋白质。,基因工程,一、蛋白质工程崛起的缘由,改造,玉米中赖氨酸含量比较低,天冬氨酸激酶（352位的苏氨酸）,二氢吡啶二羧酸合成酶（104位的天冬酰胺）,天冬氨酸激酶（异亮氨酸）,二氢吡啶二羧酸合成酶（异亮氨酸）,玉米中赖氨酸含量可提高数倍,在已研究过的几千种酶中，只有极少数可以应用于工业生产，绝大多数酶都不能应用于工业生产，这些酶虽然在自然状态下有活性，但在工业生产中没有活性或活性很低。这是因为工业生产中每一步的反应体系中常常会有酸、碱或有机溶剂存在，反应温度较高，在这种条件下，大多数酶会很快变性失活。提高蛋白质的稳定性是工业生产中一个非常重要的课题。,天然蛋白质的不足,一般来说，提高蛋白质的稳定性包括：,1、延长酶的半衰期,2、提高酶的热稳定性,3、延长药用蛋白的保存期,4、抵御由于重要氨基酸氧化引起的活性丧失等,通过物理化学与生物化学等技术了解蛋白质的结构与功能，并借助计算机辅助设计、基因定点诱变和重组DNA技术改造基因，以定向改造天然蛋白质，甚至创造自然界不存在的蛋白质的技术。其中基因工程是关键技术。,因此蛋白质工程又被称为第二代基因工程。,蛋白质工程的概念,原理:,改造基因（基因修饰或基因合成）,二、蛋白质工程的基本原理,由于基因决定蛋白质，因此，要对蛋白质的结构进行改造，最终还必须通过基因来完成。,通过基因工程来改造蛋白质,原理:,改造基因（基因修饰或基因合成）,二、蛋白质工程的基本原理,由于基因决定蛋白质，因此，要对蛋白质的结构进行改造，最终还必须通过基因来完成。,预期蛋白质功能设计预期的蛋白质推测应有的氨基酸序列找到对应的脱氧核苷酸序列。,途径:,蛋白质三维结构,氨基酸序列多肽链,基因DNA,mRNA,蛋白质工程流程图,中心法则,蛋白质合成的过程是按照中心法则进行的。而蛋白质工程的过程却与之相反。,蛋白质工程的主要步骤,从生物体中分离纯化目的蛋白；,测定其氨基酸序列；,借助核磁共振和X射线晶体衍射等手段，尽可能地了解蛋白质的二维重组和三维晶体结构;,设计各种处理条件，了解蛋白质的结构变化，包括折叠与去折叠等对其活性与功能的影响；,设计编码该蛋白的基因改造方案，如点突变；,分离、纯化新蛋白，功能检测后投入实际使用。,讨论,某多肽链的一段氨基酸序列是：丙氨酸色氨酸赖氨酸甲硫氨酸苯丙氨酸,（1）怎样得出决定这一段肽链的脱氧核苷酸序列？请把相应的碱基序列写出来。,（2）确定目的基因的碱基序列后，就可以根据人类的需要改造它，通过人工合成的方法或从基因库中获取。,每种氨基酸都有对应的三联密码子，只要查一下遗传密码子表，就可以将上述氨基酸序列的编码序列查出来。但是由于上述氨基酸序列中有几个氨基酸是由多个三联密码子编码，因此其碱基排列组合起来就比较复杂，至少可以排列出16种，可以让学生根据学过的排列组合知识自己排列一下。首先应该根据三联密码子推出mRNA序列为GCU（或C或A或G）UGGAAA（或G）AUGUUU（或C），再根据碱基互补配对规律推出脱氧核苷酸序列：CGA（或G或T或C）ACCTTT（或C）TACAAA（或G）。,提示（1）,提示（2）,确定目的基因的碱基序列后，就可以根据人类的需要改造它，通过人工合成的方法或从基因库中获取。,蛋白质改造工程举例,天然胰岛素制剂在储存中易形成二聚体和六聚体，延缓胰岛素从注射部位进入血液，从而延缓了其降血糖作用，也增加了抗原性，这是胰岛素B23-B28氨基酸残基结构所致。利用蛋白质工程技术改变这些残基，则可降低其聚合作用，使胰岛素快速起作用。该速效胰岛素已通过临床实验。,1胰岛素改造,2水蛭素改造,水蛭素是水蛭唾液腺分泌的凝血酶特异抑制剂，它有多种变异体，由65或66个氨基酸残基组成。水蛭素在临床上可作为抗栓药物用于治疗血栓疾病。为提高水蛭素活性，在综合各变异体结构特点的基础上提出改造水蛭素主要变异体HV2的设计方案，将47位的Asn（天冬酰胺）变成Lys（赖氨酸），使其与分子内第4或第5位Thr（苏氨酸）间形成氢键来帮助水蛭素N端肽段的正确取向，从而提高凝血效率，试管试验活性提高4倍，在动物模型上检验抗血栓形成的效果，提高20倍。,3生长激素改造,生长激素通过对它特异受体的作用促进细胞和机体的生长发育，然而它不仅可以结合生长激素受体，还可以结合许多种不同类型细胞的催乳激素受体，引发其他生理过程。在治疗过程中为减少副作用，需使人的重组生长激素只与生长激素受体结合，尽可能减少与其他激素受体的结合。经研究发现，二者受体结合区有一部分重叠，但并不完全相同，有可能通过改造加以区别。由于人的生长激素和催乳激素受体结合需要锌离子参与作用，而它与生长激素受体结合则无需锌离子参与，于是考虑取代充当锌离子配基的氨基酸侧链，如第18和第21位His（组氨酸）和第17位Glu（谷氨酸）。实验结果与预先设想一致，但要开发作为临床用药还有大量的工作要做。,4治癌酶的改造,癌症的基因治疗分二个方面：药物作用于癌细胞，特异性地抑制或杀死癌细胞；药物保护正常细胞免受化学药物的侵害，可以提高化学治疗的剂量。疱疹病毒（HSV）胸腺嘧啶激酶（TK）可以催化胸腺嘧啶和其它结构类似物磷酸化而使这些碱基3-OH缺乏,从而阻断DNA的合成，杀死癌细胞。HSVTK催化能力可以通过基因突变来提高。从大量的随机突变中进行筛选出一种酶,在酶活性部位附近有6个氨基酸被替换，催化能力20倍以上。蛋白质工程的发展很快，研究工作很多，以上仅介绍了几个例子。蛋白质工程除了用于改造天然蛋白质或设计制造新的蛋白质外，其本身还是研究蛋白质结构功能的一种强有力的工具，它在解决生物理论方面所起的作用，可以和任何重大的生物研究方法相提并论。,蛋白质工程现状,蛋白质工程目前的现状：成功的例子不多，主要是因为蛋白质发挥其功能需要依赖于正确的空间结构，而科学家目前对大多数蛋白质的空间结构了解很少。,三、蛋白质工程的进展和前景,蛋白质工程的前景,蛋白质工程汇集了当代分子生物学等学科的一些前沿领域的最新成就，它把核酸与蛋白质结合、蛋白质空间结构与生物功能结合起来研究。蛋白质工程将蛋白质与酶的研究推进到崭新的时代，为蛋白质和酶在工业、农业和医药方面的应用开拓了诱人的前景。蛋白质工程开创了按照人类意愿改造、创造符合人类需要的蛋白质的新时期。,当前，蛋白质工程修饰、改造的蛋白质为数不算多，但进展较快。随着基因组测序的国际联合行动的快速进展，也带来并已出现了蛋白质高速发展的新阶段。,蛋白质工程进展,1医药方面,许多蛋白质工程的目标是设法提高蛋白质的稳定性。在酶反应器中可延长酶的半衰期或增强其热稳定性，也可以延长治疗用蛋白质的贮存寿命或重要氨基酸抗氧化失活的能力。在这个领域已取得了一些重要研究成果。用蛋白质工程来改造特殊蛋白质为制造特效抗癌药物开辟了新途径。,2在农业方面,蛋白质工程正在成为改造农业，大幅度提高粮食产量的新途径。近年来，美国坎布里奇的雷普里根公司的科研人员立题，以蛋白质工程作为设计优良微生物农药的新思路，他们实施对微生物蛋白质结构进行修改，仅此一举，使微生物农药的杀虫率提高了10倍。,蛋白质工程在工业上的应用取得的成果亦是很多。现以改变酶的动力学特性研制出高效除污酶为例说明其应用价值。,另外，美国、日本等国家的科学工作者利用蛋白质工程研制生物元件来取代“硅芯片”，研制生物计算机，开发生物传感器的蛋白质都取得了重大进展。还有利用蛋白质（酶）生产模仿羊毛、蚕丝、蜘蛛丝，其强度高、质量轻，均是蛋白质工程取得的应用性研究成果。,课堂小结,比较基因工程和蛋白质工程,基因,表达（转录和翻译）,形成氨基酸序列的多肽链,天然蛋白质的合成途径：,形成具有高级结构的蛋白质,行使生物功能,蛋白质工程的途径：,预期的蛋白质功能出发,设计预期的蛋白质结构,推测应有的氨基酸序列,找到相应的脱氧核苷酸序列酸,课堂练习,1.蛋白质工程的目标是根据对蛋白质（）的特定需求，对蛋白质的（）进行分子设计。,如：玉米的赖氨酸含量低，原因是赖氨酸合成过程中的两个关键的酶（）和（）的活性受赖氨酸浓度的影响，如果将（）中的第352位的苏氨酸变为（），把（）中第104位的天冬酰胺变成（）就可以提高玉米中的氨基酸含量2-5倍。,功能的特定需求,结构,天冬氨酸激酶,二氢吡啶二羧酸合成酶,天冬氨酸激酶,异亮氨酸,二氢吡啶二羧酸合成酶,异亮氨酸,2.蛋白质工程中直接需要进行操作的对象是（）,A.氨基酸结构,B.蛋白质空间结构,C.肽链结