骨质疏松的分子生物学研究

骨质疏松发生机制的分子生物学途径Molecular biology Pathway for osteoporosis,罗湖医院 骨科刘新主任医师,提纲,骨质疏松从宏观到微观破骨细胞与成骨细胞OPG/RANK/RANKL系统与破骨细胞Wnt/-catenin信号通路与成骨细胞靶点信号传导分子治疗人工关节内置物骨溶解松动的靶点治疗,骨质疏松引起宏观人体形态改变,X片可见椎体压缩骨折,脊柱骨质疏松模式图,放大镜下椎体骨质疏松结构,低倍电镜下骨质疏松结构图,电镜下骨质疏松骨吸收图片,电镜下骨质疏松骨吸收结构,破骨细胞模式图,显微镜下活体破骨细胞吸收轨迹,电镜下破骨细胞结构,破骨细胞再吸收示意图,破骨细胞的生长,Horowitz MC, et al. Immunol Rev. 2005;208:141-153.,单核细胞,巨噬细胞,多能前体,前单核细胞,Pu.1GM-CSF,NF-B, c-FosNFAT,单核破骨细胞前体,成熟破骨细胞,RANK,RANK+,RANKL,Abbreviations: GM-CSF, granulocyte macrophage colony-stimulating factor; NF-B, nuclear factor kappaB; NFAT, nuclear factor of activated T-cells; RANK, receptor activator for nuclear factor kappa B.,干细胞,骨髓间充质细胞,CBFA1BMPsTGFs,增殖,增殖,BMPsTGF-s,CBFA1Msx-2PTHTGF-IGF-I, IIVitamin D3c-fos,增殖,CBFA1Glucocorti-coidsVitamin D3PGE2PTH TGF- IGF-I, II,成熟的成骨细胞,CBFA1Dlx-5fra-2/jun-D,矿化,成骨细胞,Lian JB, et al. In Osteoporosis. 2nd ed. Marcus R, et al, eds. Stanford, CA: Academic Press, 2001.,承诺没有回头路,骨母细胞,确定如何随着时间的推移激活许多单位都确定的分化，功能，这些细胞和祖细胞的死亡信号，如何积极和平衡的基本多细胞单位，是否在周期结束时，骨量会获得丢失，或稳定,Canalis E et al. N Engl J Med 2007;357:905-916,骨重建,成骨细胞堆积成新的板层骨. 骨细胞是骨基质中的成骨细胞破骨细胞吸收骨基质,静止期,骨重建,骨重建周期,人体骨组织处于不断重建过程之中，正常成人体内的成骨细胞骨矿沉积与破骨细的骨质吸收处于平衡状态.OP的发生与骨重建失衡引起的骨丢失密切相关.在病理状态下，骨重建率增加，由于骨形成的周期较骨吸收的周期长，新骨的形成相对旧骨的吸收不足，从而导致骨丢失,为什么骨重建?,提供骨骼支架应对机械负荷修复和阻止微损伤（“磨损”和“撕裂”）保持骨质量释放储存在细胞内的生长因子和矿物质（钙和磷酸盐）到循环中,All bone cells participate in remodeling Considerable energy expended to remodel the skeleton所有骨细胞参与重塑 相当多的能源消耗重塑骨架,成骨细胞及骨髓基质细胞表达RANKL，与破骨细胞前体细胞或破骨细胞表面上的RANK结合后，促进破骨细胞的分化和激活，并抑制破骨细胞的凋亡。由成骨细胞分泌的OPG可以与RANKL结合，竞争性抑制RANKL与RANK之间的结合，从而抑制成熟破骨细胞的生成,Whyte M. N Engl J Med 2006;354:860-863,OPG/RANK/RANKL系统与破骨细胞,OPG/RANK/RANKL蛋白,OPG：骨保护蛋白;RANK：核因子-受体活化因子RANKL：核因子-受体活化因子配体,骨形态发生蛋白： 多肽的转化生长因子超家族，其中包括activins和抑制素的成员。这些蛋白质结合并激活特定的受体启动的信号转导和影响内导致osteoblastogenesis的事件,Wnt信号： 使用一个Wnt-catenin信号通路。 Wnt信号绑定到特定的受体，低密度脂蛋白受体相关蛋白5和6（LRP5和LRP6的）。这稳定的translocates进入细胞核，调节基因表达的-catenin的。,IGF-I:： 在肝脏和其他组织，包括骨骼，介导生长激素的纵向骨生长的影响。 IGF-对骨的直接行动，是对骨骼发育和维持骨量的必要。同时作为循环增长激素依赖性激素和PTH的影响作为一个地方的骨骼生长因子。 IGF-I的主要影响成骨细胞的分化功能，防止成骨细胞凋亡,Canalis E et al. N Engl J Med 2007;357:905-916,Wnt/-catenin信号通路与成骨细胞,Dkk Sclerostin Wnt,Frizzled,Liganded State,APC,axin,Gsk3,-Catenin,-Catenin,-Catenin,Dsh,Frat-1,-Catenin,p300/CBP,SMRT/ NCoR,Tcf/Ldf,Altered Transcription of Genes,Nuclear Localization,Nucleus,BONE FORMATION,WIF sFRP,LRP5/6,OSTEOBLAST,With permission fromShoback D. J Clin Endocrinol Metab. 2007;92:747-753.,Dkk Sclerostin Wnt,Frizzled,配体状态,APC,axin,Gsk3,-Catenin,-Catenin,-Catenin,Dsh,Frat-1,-Catenin,p300/CBP,SMRT/ NCoR,Tcf/Lef,Altered Transcription of Genes,核定位,细胞核,成骨细胞,骨形成,WIF sFRP,APC,P,蛋白酶体降解,LRP,Frizzled,LRP5/6,LRP5/6,Kremen,axin,-Catenin,Gsk3,(没有新骨形成,Dkk Sclerostin,Unliganded State,Pathway Dead,LRP5/6,LRP5/6,LRP5/6,With permission fromShoback D. J Clin Endocrinol Metab. 2007;92:747-753.,Wnt/-catenin经典途径： 其主要组分包括:细胞外因子(Wnt)、跨膜受体( frizzled)、胞质蛋白(-catenin)及核内转录因子(TCFS/LEF),即当细胞外因子与跨膜受体结合后,受体作用于胞质内的蓬乱蛋白（Dsh或Dvl), Dsh能切断-catenin的降解途径,抑制-catenin蛋白降解和磷酸化,使其在胞质内累积,进而入核内与T细胞因子(TCF/LEF)相互作用,启动靶基因的转录和表达,调节细胞生长。,Wnt/-catenin在促进成骨细胞分化的同时增强了OPG的表达,从而使与RANK的竞争性作用增强,使OPG与更多的RANKL假性结合,抑制成骨细胞的分化,降低破骨细胞的活动,减少骨量的丢失。Wnt经典信号转导通路通过促进干细胞更新，刺激成骨前体细胞增殖，诱导成骨分化，抑制成骨细胞及骨细胞凋亡等机制增加骨量。上调或下调经典Wnt通路中相关因子的表达可引起骨量的变化。,正常的骨重建循环,衬里细胞,休眠,Bone,Illustration Copyright 2009 Nucleus Medical Art, All rights reserved. ,多因素调节骨重建,休眠,Bone,Abbreviations: GM-CSF, granulocyte macrophage colony-stimulating factor; IL, interleukin; OPG, osteoprotegerin; RANKL, RANK-ligand, PGE2, prostaglandin E2; TGF, transforming growth factor; TNF, tumor necrosis factor.,Illustration Copyright 2009 Nucleus Medical Art, All rights reserved. ,RANK 配体是破骨细胞形成、功能和生存最重要的调节介质,成骨细胞骨基质干细胞,激活破骨细胞,人骨髓巨核系祖细胞,前融合破骨细胞,多核破骨细胞,激素生长因子细胞因子PTHPGE2GlucocorticoidsVitamin DIL-11IL-6IL-1PTHrPTNF-,RANKLRANK,Bone Formation,Bone Resorption,Adapted from Boyle WJ, et al. Nature. 2003;423:337-342.,M-CSF,CFU-M = colony forming unit macrophageM-CSF = macrophage colony stimulating factor,For Internal Use Only. Amgen Confidential.,骨保护素（OPG）防止RANKL配体结合RANK并抑制破骨细胞形成、功能和生存,HormonesGrowth factorsCytokines,Bone Formation,Adapted from Boyle WJ, et al. Nature. 2003;423:337-342.,骨吸收抑制,破骨细胞形成，功能和生存抑制,CFU-M,OsteoclastPrecursor,CFU-M = colony forming unit macrophageM-CSF = macrophage colony stimulating factor,Osteoblasts,RANKL促进在破骨细胞活性增加,RANK配体/ OPG比值的改变是那些因为骨吸收增加而导致骨骼疾病最重要的的发病机制,RANK Ligand,OPG,防止OC activation,促进OC activation,Osteoclast Activity,1Hofbauer LC, et al. JAMA. 2004;292:490-5.2Lacey DL, et al. Cell. 1998;93:165-76.3Boyle WJ, et al. Nature. 2003;423:337-42.,OC = osteoclast,雌激素糖皮质激素,Normal 4 weeks of age,OPG ApoE Tg 8 weeks of age,RANKL KO 4 weeks of age,OPG KO 8 weeks of age,RANK KO4 weeks of age,小鼠功能基因组学研究发现OPG / RANK / RANKL为骨量的关键调节,OPG/RANK/RANKL系统与骨质疏松症,骨保护素(OPG)、核因子B受体活化因子（RANK)和核因子B受体活化因子配体(RANKL)系统是近年来发现的一组调控破骨细胞分化激活的细胞因子，三者均属肿瘤坏死因子受体超家族。成骨细胞及骨髓基质细胞表达RANKL，与破骨细胞前体细胞或破骨细胞表面上的RANK结合后，促进破骨细胞的分化和激活，并抑制破骨细胞的凋亡。由成骨细胞分泌的OPG可以与RANKL结合，竞争性抑制RANKL与RANK之间的结合，从而抑制成熟破骨细胞的生成。研究表明许多激素、细胞因子等均通过直接或间接地调节OPG、RANKL和RANK的表达，介导破骨细胞的分化和功能，而达到抗骨质疏松或致骨质疏松的作用。,靶点信号传导分子治疗,人源 RANKL 单克隆抗体（称为 AMG-162 或 denosumab）重组人骨保护素 Fc 融合蛋白Fc-OPG12/15-l脂氧合酶抑制剂: 由Alox15 IL-4介导的骨吸收调控的基因编码。口服钙敏感受体拮抗剂： 调节内源性甲状旁腺激素的短暂上升，类似间歇性调节外源性甲状旁腺激素骨硬化剂抑制剂：硬化蛋白是由骨细胞产生，并抑制骨形成。硬化拮抗作用可影响骨合成代谢。例如，硬化的单克隆抗体，为防止其结合Wnt信号辅助受体，增强Wnt信号在啮齿类动物和灵长类动物的骨量增加。整合蛋白受体拮抗剂：整合蛋白介导的破骨细胞的骨表面的粘附，骨吸收的一个重要的初始步骤蛋白酶 - K抑制剂 - 组织蛋白酶K是一种蛋白酶，可能发挥作用，在破骨细胞介导的骨吸收。,DKK-1受体拮抗剂：LRP5和LRP6的（WNT辅助受体），导致受损DKK-1结合的突变与骨量增加。 DKK-1的抗体，这表明，DKK-1抑制剂，专门针对骨同化方法在治疗骨质疏松症的可能有潜在的增加骨密度，骨小梁体积，在啮齿类动物和骨形成。 可溶性激活素受体：激活素增强破骨细胞，骨形成的影响是有争议的。二，可溶性激活受体结合激活素和可能骨形态发生蛋白3，减少骨吸收，增强在啮齿类动物的骨形成。 成骨细胞蛋白酶及其抑制剂：蛋白处理系统的抑制剂，可能取消或提高合成代谢途径。蛋白酶抑制剂的使用将取决于他们的骨骼的特异性和安全性，因为这种抑制剂可诱导细胞毒性作用和细胞内积累的错误折叠的蛋白质。,骨溶解机制,1,2,3,4,5,磨损颗粒,破骨细胞,炎症介质,抑制破骨细胞形成,增强内置物固定,Shanbhag, Rubash et al. CORR, Proceedings of Hip Society, 2006,在参与无菌性假体松动的信号通路,Drees P et al. (2007) Mechanisms of Disease: molecular insights into aseptic loosening of orthopedic implants Nat Clin Pract Rheumatol 3: 165171 doi:10.1038/ncprheum0428,人工关节无菌性松动是影响关节假体寿命的最主要因素。近年来人们认识到,人工关节后期松动除主要与假体长期磨损或离解产生的颗粒（聚乙烯颗粒,金属颗粒,氧化铝陶瓷颗粒,骨水泥颗粒等）所诱导的生物学反应有关,尤其是破骨细胞性骨溶解在关节假体松动中起重要作用。,目前绝大多数学术研究都支持无菌性松动的过程包括: (1)磨损颗粒诱发炎症反应释放炎症因子(IL-1、IL-6、TNF、VEGF等); (2)炎症因子激活破骨细胞(OPG/RANKL/RANK信号传导途径); (3)破骨细胞溶骨。针对无菌性松动的发病机制,药物和基因治疗主要针对:抑制巨嗜细胞对磨损颗粒的炎症反应,减少炎症因子的释放;抑制破骨细胞的激活和骨吸收功能。,人工关节松动的药物和基因治疗进展中国矫形外科杂志2009,磨损颗粒刺激假体周围膜形成并影响假体周围细胞的细胞因子表达，其刺激作用的强弱与颗粒的大小和浓度有关。每克组织超过 1 1010个磨损颗粒是产生假体周围骨溶解的先决条件。在刺激细胞因子产生方面，0.1 1.0 m 大小的颗粒在体积浓度为 10 100 m3颗粒/细胞时具有最强的生物学活性。磨损颗粒一方面刺激巨噬细胞、成纤维细胞和成骨细胞表达 RANKL。另一方面，颗粒可刺激假体周围细胞合成诱导 RANKL 表达的前炎性细胞因子。这种不平衡也可能是导致假体周围组织中破骨细胞过度分化和激活的因素之一。,假体周围微环境持续动态变化的最终结果决定了假体的使用寿命,随着对关节假体周围微环境研究的进一步深入,不断探索新的治疗方法,从而可以更好的预防和治疗人工假体周围骨溶解和假体松动,以避免翻修术给病人带来的痛苦。,OPG/RANK/RANKL系统为治疗开辟新思路,OPG/RANK/RANKL系统的发现及它们在调节骨代谢方面的作用，如OPG、RANKFc、抗RANKL抗体是预防和治疗包括骨质疏松在内的骨溶解疾病的理想靶点。外源性的OPG、抗RANKL抗体、RANKFc及FcOPG融合蛋白等拮抗剂能够有效地抑制RANKL对破骨细胞的作用。,靶向信号传导分子治疗,RANK/RANKL/OPG系统参与了不同疾病的骨吸收导致一系列溶骨性病变。骨代谢疾病中RANKL和OPG的问题，为治疗方案提供了新的靶标，近年来，靶向信号传导分子治疗的概念已深入人心。,Denosumab （狄诺塞麦）的药理特性,完全人单克隆抗体 血清IgG