分子生物学PCR（课堂PPT）

PCR:polymerasechainreaction聚合酶链式反应,1,PCR技术是一种体外模拟体内DNA复制过程的核酸扩增技术。它是以待扩增的双链DNA为模板，以一对人工合成的寡核苷酸为引物，以四种dNTP为底物，通过耐高温DNA聚合酶的酶促作用，经过“变性、退火、延伸”三步反应的循环快速特异地扩增出特定的DNA片断。,2,PCR技术的基本原理,由“高温变性、低温退火和适温延伸反应”组成一个周期，循环进行，使目的基因得以迅速扩增。,3,模板DNA,PCR循环过程,4,引物1,引物2,PCR循环过程,5,引物1,引物2,Taq酶,Taq酶,PCR循环过程,6,第1轮结束,第2轮开始,PCR循环过程,7,Taq,Taq,Taq,Taq,PCR循环过程,8,第2轮结束,PCR循环过程,9,模板DNA,第1轮扩增,第2轮扩增,第3轮扩增,第4轮扩增,第5轮扩增,PCR循环过程,第6轮扩增,10,PCR的反应动力学,PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应期称平台期。大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。,11,PCR扩增体系,12,PCR反应体系,PCR反应五要素：引物、酶、dNTP、模板和Mg2+标准的PCR反应体系：10扩增缓冲液10ul4种dNTP混合物各200umol/L引物各10100pmol模板DNA0.12ugTaqDNA聚合酶2.5uMg2+1.5mmol/L加双或三蒸水至100ul,13,引物,引物是人工合成的两段寡核苷酸单链，是PCR特异性反应的关键，扩增产物的大小也由特异引物限定。,14,设计引物应遵循以下原则：引物长度：15-30bp，常用为20-27bp左右。在做长片段PCR或做某些特殊的PCR时应使用较长的引物，但最多不超过50个核苷酸。引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，过高或过低均不利于引发。ATGC最好随机分布，避免聚嘌呤或嘧啶核苷酸。避免引物自身互补，形成发夹结构，因空间位阻而影响其与模板结合。两条引物间之间也不能互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带或降低引物有效浓度。,15,引物3端的碱基，应严格要求配对，不可修饰，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。考虑到密码子的简并性，引物3端不终止于密码子第三个碱基。因该位置由于密码子的简并性影响扩增的特异性。引物的5端可以修饰，它对扩增特异性影响不大。如增加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛等；引入点突变、启动子序列等。引物的特异性：引物应该与核酸序列数据库的其它序列无明显的同源性，以减少引物与基因组的非特异性结合。,16,简并引物,如果引物的序列是从基因产物蛋白质的氨基酸序列反推出来的，就必须考虑密码的简并性。需要合成多种序列的引物，彼此间只有一个或几个碱基差异。这样的混合引物称简并引物。,简并性(degeneracy)遗传密码中，除色氨酸和蛋氨酸仅有一个密码子外，其余氨基酸均有多个密码子。,17,例如，序列1：tgaatgcatgcatgc序列2：tgcatgcatgcatgc序列3：tgtatgcatgcatgc若样品并不能明确是1，2还是3，为了能从不确定序列来源的样本中，扩增出同源序列来，你的引物实际上就是针对序列1，2，3设计的混合物。这样不论是1，2还是3，采用你的引物均能有效扩增。,18,套嵌引物,设计多组引物，结合位点依次位于前一组引物之间。增加扩增产物的特异性。,19,引物的溶解与保存：,高浓度贮存分装，避免反复冻融,临用前稀释,20贮存,引物量：每条引物的终浓度0.21umol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。,20,DNA聚合酶,TaqDNA聚合酶,热稳定性,最大特点是热稳定性，耐高温，非常适合PCR过程的反复高温变性要求。,最适温度高,最适温度：74-80oC(PCR延伸：72-）延伸速度：约35-150nt/s.酶分子最长延伸长度：6.7kb,21,Taq酶的功能缺点,具有53聚合酶活性和53外切酶活性，但没有35外切酶活性。因此不能修复错误的碱基配对！,合成超过600bp长度的DNA就有可能出现错配，用于克隆基因时必须测序。,金属离子敏感（尤其是Mg2+）。,22,1.不同的公司或不同批次的产品常有很大的差异，由于酶的浓度对PCR反应影响极大，因此应当作预试验或使用厂家推荐的浓度。2.浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少.,23,底物：dNTP,1.dNTP小量分装，-20冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50200umol/L，不能低于1015mol/L。浓度过高，与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低，抑制TaqDNA聚合酶的活性。浓度过低又会降低PCR产物的产量。尤其是注意4种dNTP的浓度要相等(等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时，就会引起错配。降低合成速度，过早终止反应。,24,模板(靶基因),要求：1.100l反应体系中质粒DNA1-10ng，基因组DNA50-100ng足够。2.纯度要求不太严格，可以是粗品，但不能混有SDS、有机溶剂酚、氯仿等蛋白质变性剂以及任何蛋白酶、核酸酶、TaqDNA聚合酶抑制剂以及能结合DNA的蛋白。,25,模板的种类：DNA或RNA。1.RNA：先通过反转录得到cDNA。2.质粒：线性化的比环状的效果好，但在实际操作中，往往不需要将质粒线性化，而直接用做模板。3.高分子量的脱氧核糖核酸（如基因组脱氧核糖核酸）做模板时，如果用适当的酶先进行消化再作为模板，扩增效果会更好。,26,Mg2+,Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响。Mg2+可以与dNTP结合，易化4种dNTP的协作，而且可以促进和稳定引物-模板的相互作用。因此，Mg2+浓度过高，可出现非特异扩增。浓度过低会降低TaqDNA聚合酶的活性，使反应产物减少。在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200mol/L时，Mg2+终浓度为1.52.0mmol/L为宜。,27,PCR反应条件的选择,基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。标准反应中采用三温度点法对于较短靶基因(长度为100300bp时)可采用二温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94变性，65左右退火与延伸(此温度TaqDNA酶仍有较高的催化活性)。,-温度与时间的设置,28,变性温度与时间：,变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，93941min足以使模板DNA变性，若低于93则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。,29,退火温度与时间：,退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基因序列的长度。Tm值(解链温度)=4(G+C)2(A+T)退火温度=Tm值-(510)在Tm值允许范围内，选择较高的退火温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合。退火时间一般为3060sec，足以使引物与模板之间完全结合。,30,延伸温度与时间,TaqDNA聚合酶的生物学活性：7080150核苷酸/S/酶分子7060核苷酸/S/酶分子5524核苷酸/S/酶分子高于90时，DNA合成几乎不能进行延伸温度一般选择在7075之间，常用温度为72。反应时间，可据扩增片段的长度而定：一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min足够。34kb的靶序列需34min；10Kb需延伸至15min,31,循环次数,循环次数影响PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般为25-30次，35次左右时，达到平台期。循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。,32,PCR扩增产物分析,1.凝胶电泳分析：PCR产物电泳，EB染色,紫外仪下观察.PCR产物片段的大小应与预计的一致。琼脂糖凝胶电泳：通常应用12%的琼脂糖凝胶，供检测用。聚丙烯酰胺凝胶电泳：610%聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨率高，分离效果比琼脂糖好，条带比较集中，而且DNA回收纯度高。,33,2.酶切分析：根据PCR产物中限制性内切酶的位点，用相应的酶切、电泳分离后，获得符合理论的片段，此法既能进行产物的鉴定，又能对靶基因分型，还能进行变异性研究。3.分子杂交：如Southern印迹杂交：在两引物之间另合成一条寡核苷酸链，标记后做探针，与PCR产物杂交。此法既可作特异性鉴定，还可知其分子量。4.斑点杂交：将PCR产物点在硝酸纤维素膜或尼龙膜薄膜上，再用放射性或非放射性寡核苷酸探针杂交，观察有无着色斑点，主要用于PCR产物特异性鉴定及变异分析。5.核酸序列分析：是检测PCR产物特异性的最可靠方法。,34,设定对照,阳性对照:是PCR反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要的参考标志。,35,PCR反应的关键环节有:模板的制备，引物的质量与特异性，酶的质量及活性PCR循环条件,PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失,注意,36,1、PCR常见问题：出现非特异性扩增带无特异性扩增带,2、出现非特异性扩增带可能原因酶量过多Mg2+浓度过高dNTP浓度过高引物浓度过高，引物设计特异性差模板纯度差退火温度过低循环次数过多,37,3、无特异性扩增条带可能原因阳性对照有扩增条带，说明酶、底物、bf无问题，检查模板与引物，一般是引物的问题。可能退火温度过高没有加酶,38,片状拖带或涂抹带,其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。对策：减少酶量，或调换另一来源的酶。减少dNTP的浓度。适当降低Mg2+浓度。减少循环次数。,39,假阴性,模板：模板中含有Taq酶抑制剂.提取制备模板时丢失过多，或吸入酚.模板变性不彻底.对策：配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。（有时忘加Taq酶）.,40,3.引物：引物的设计、质量、浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。对策为：选定好的引物合成单位。引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致。如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。引物应高浓度小量分装保存,防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分,导致引物降解失效。,41,假阴性,4.Mg2+浓度：浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量，甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。5.反应体积的改变：在做小体积如20ul后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。6.物理原因：如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率.退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。7.靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。,42,假阳性,现象：空白对照出现目的扩增产物。出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，但其条带更整齐，亮度更高引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而可能扩增出的PCR产物为非目的性的序列。引物太短，容易出现假阳性。靶序列或扩增产物的交叉污染：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。二是空气中的小片段核酸污染，可用巢式PCR方法来减轻或消除。,43,PCR污染的对策,实验室分区设置,(一)合理分隔实验室:,将样品的处理、配制PCR反应液、PCR循环扩增及PCR产物的鉴定等步骤分区或分室进行，特别注意样本处理及PCR产物的鉴定应与其它步骤严格分开。实验用品及吸样枪应专用，实验前应将实验室用紫外线消毒以破坏残留的脱氧核糖核酸或RNA。,44,(二)吸样枪:由于操作时不慎将样品或模板吸入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源，因而操作时要十分小心，吸样要慢，吸样时尽量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染(三)预混和分装PCR试剂:所有的PCR试剂都应小量分装，另外，PCR试剂，PCR反应液应与样品及PCR产物分开保存，不应放于同一冰盒或同一冰箱。(四)防止操作人员污染，使用一次性手套、吸头、小离心管应一次性使用。(五)设立适当的阳性对照和阴性对照，阳性对照以能出现扩增条带的最低量的标准核酸为宜，并注意交叉污染的可能性，每次反应都应有一管不加模板的试剂对照及相应不含有被扩增核酸的样品作阴性对照。(六)减少PCR循环次数，只要PCR产物达到基本要求水