肿瘤临床分子诊断技术的应用进展.ppt

肿瘤临床分子诊断技术的应用进展,杜珍武phdzhw吉林大学中日联谊医院中心研究室,一、肿瘤发生发展的分子机制二、肿瘤分子诊断内容三、肿瘤治疗的分子监控四、肿瘤的免疫监控,肿瘤临床分子诊断技术的应用进展,一、肿瘤发生发展的分子机制,肿瘤自身原因,外因,内因,无限增殖,转移,空间,资源,免疫监控,攘外,安内,同流和污,视而不见,肿瘤免疫监控失活,功能丧失,肿瘤临床分子诊断技术的应用进展,一、肿瘤发生发展的分子机制,1、肿瘤自身,肿瘤临床分子诊断技术的应用进展,一、肿瘤发生发展的分子机制,1、肿瘤自身,肿瘤临床分子诊断技术的应用进展,一、肿瘤发生发展的分子机制,1、肿瘤自身,肿瘤临床分子诊断技术的应用进展,Self-sufficiencyingrowthsignals,AutocrineloopsOver-expressionofreceptorReceptorisalwaysonDownstreamsignals,一、肿瘤发生发展的分子机制,1、肿瘤自身,肿瘤临床分子诊断技术的应用进展,ExternaltriggersIntracellulartriggersDeathreceptorsCaspasesSensors(8,9)Executioners(3),Evadingapoptosis,一、肿瘤发生发展的分子机制,1、肿瘤自身,肿瘤临床分子诊断技术的应用进展,Insensitivitytoantigrowthsignals,一、肿瘤发生发展的分子机制,1、肿瘤自身,肿瘤临床分子诊断技术的应用进展,Sustainedangiogenesis,VEGFFGF1/2ThrombospondinThalidomideAvastin,一、肿瘤发生发展的分子机制,1、肿瘤自身,肿瘤临床分子诊断技术的应用进展,Tissueinvasionandmetastases,一、肿瘤发生发展的分子机制,1、肿瘤自身,肿瘤临床分子诊断技术的应用进展,Limitlessreproductivepotential,HayflickhypothesisLimitednumberofdoublingsTelomeremaintenanceTelomeraseNotalltumorcellshavethispotentialTumorstemcells,(1)免疫监视系统,要素,识别力,攻击力,组成,分工,快速反应,特异反应,信息传递,肿瘤临床分子诊断技术的应用进展,一、肿瘤发生发展的分子机制,2、免疫监控失调,（1）、免疫监视系统,识别,特异反应,抗原递呈细胞,肿瘤临床分子诊断技术的应用进展,一、肿瘤发生发展的分子机制,2、免疫监控失调,（1）、免疫监视系统,攻击,效应细胞,肿瘤临床分子诊断技术的应用进展,一、肿瘤发生发展的分子机制,2、免疫监控失调,（2）、免疫监视系统与肿瘤发生,证据,体内细胞突变随时在发生，但肿瘤不是随时发生。,免疫缺陷与肿瘤发生,免疫功能与肿瘤发展,肿瘤临床分子诊断技术的应用进展,一、肿瘤发生发展的分子机制,2、免疫监控失调,（2）、免疫监视系统与肿瘤发生,肿瘤监控失常原因,识别问题,肿瘤自身,免疫细胞,隐蔽抗原,来源与正常细胞相同,抗原递呈功能缺失,无视,肿瘤临床分子诊断技术的应用进展,一、肿瘤发生发展的分子机制,2、免疫监控失调,（2）、免疫监视系统与肿瘤发生,肿瘤监控失常原因,杀伤问题,肿瘤自身,免疫细胞,杀伤免疫细胞,抑制因子,功能异常,抑制性免疫细胞,肿瘤临床分子诊断技术的应用进展,一、肿瘤发生发展的分子机制,2、免疫监控失调,肿瘤临床分子诊断技术的应用进展,二、肿瘤的分子诊断内容,诊断,预后评估,判定治疗效果,分子,内容,基因突变,基因表达,有无,类型,位置,效应,有无,水平,效应,临床应用,检测技术,PCR,基因测序,蛋白芯片,核酸杂交,免疫化学,肿瘤临床分子诊断技术的应用进展,二、肿瘤的分子诊断内容,样本,内容,与遗传有关的基因突变,检测技术,PCR,基因测序,蛋白芯片,基因测序,免疫化学,血液,肿瘤组织,血浆DNA变化,血浆变中癌基因表达检测,肿瘤标志物的检测,肿瘤细胞的基因突变,肿瘤细胞的基因表达,肿瘤细胞的蛋白表达,PCR,肿瘤临床分子诊断技术的应用进展,二、肿瘤的分子诊断内容,肿瘤标志物的检测,1978年Herberman在美国国立癌症研究所召开的人类肿瘤免疫诊断会上提出的。由肿瘤组织和细胞产生的与肿瘤的形成、发生相关的物质,这些物质存在于肿瘤细胞的胞核、胞质、胞膜上或体液中；不存在于正常成人组织而见于胚胎组织,或在肿瘤组织中含量超过正常含量。存在于肿瘤患者的组织、体液和排泄物中，能够用免疫学、生物学及化学的方法检测。,肿瘤临床分子诊断技术的应用进展,二、肿瘤的分子诊断内容,肿瘤标志物的检测,理想的TM特异性高，对肿瘤与非肿瘤鉴别的准确性可100%。敏感性高，能在极早期发现肿瘤的存在，不漏诊。在体液中的浓度应与瘤体大小、临床分期密切相关，并可据此判断预后。半衰期短，可根据其水平的升降监测治疗效果及肿瘤是否复发或转移。检测方法灵敏可靠，操作简便，价格低廉。,肿瘤临床分子诊断技术的应用进展,二、肿瘤的分子诊断内容,肿瘤标志物的检测,肿瘤标志物的测定：包括测定血液、尿液中蛋白质（包括多肽）、脂类，糖类、核酸物质。,肿瘤临床分子诊断技术的应用进展,二、肿瘤的分子诊断内容,蛋白组学：引领21世纪生物科学,1、蛋白检测,蛋白组学代表着对有机生物、器官和细胞器中所有蛋白的特性、分子量、结构和生物化疗、细胞功能加以明确同时了解这些特性在空间、时间或不同生理状态下的变化,肿瘤临床分子诊断技术的应用进展,二、肿瘤的分子诊断内容,蛋白组学,相同的基因组不同的蛋白组,肿瘤临床分子诊断技术的应用进展,二、肿瘤的分子诊断内容,蛋白组学,在分子水平上描述蛋白和DNA的特性是理清基因功能的关键,基因组学,蛋白组学,肿瘤临床分子诊断技术的应用进展,二、肿瘤的分子诊断内容,2、蛋白组学,肿瘤临床分子诊断技术的应用进展,二、肿瘤的分子诊断内容,蛋白组学,表面增强激光解吸离子化(SELDI),肿瘤临床分子诊断技术的应用进展,二、肿瘤的分子诊断内容,2、蛋白组学,肿瘤临床分子诊断技术的应用进展,二、肿瘤的分子诊断内容,蛋白组学,通过比较蛋白图谱可以容易地找出标志物SELDI技术比2DPAGE速度快，可重复性高这一技术用以发现多种疾病的生物标志物，如卵巢癌、乳腺癌、前列腺和膀胱癌,肿瘤临床分子诊断技术的应用进展,二、肿瘤的分子诊断内容,2、蛋白组学,肿瘤临床分子诊断技术的应用进展,二、肿瘤的分子诊断内容,蛋白组学,FDA于2009年9月11日批准了OVA1试验,首个FDA获准的基于蛋白水平的体外诊断多因素指数检测首个FDA获准的用于卵巢癌术前和术后的预后检测在血标本中检测5个蛋白SELDI技术筛选出2-微球蛋白、转铁蛋白、载脂蛋白A1、甲状腺素运载蛋白CA125预测良恶性可能,肿瘤临床分子诊断技术的应用进展,二、肿瘤的分子诊断内容,蛋白组学,将生物标志物的发现从实验室开拓到临床应用中基于一项前瞻性双盲的临床研究，纳入27个机构共516例患者269例患者只根据手术前信息进行评估247例患者根据手术前信息和OVA1结果进行评估OVA1检测能识别出额外的潜在恶性肿瘤患者能够在盆腔包块中检查出是否罹患卵巢癌，并确定是否需要手术治疗，帮助病人和医护人员确定属于什么类型的手术，以及应该由谁负责实施。,肿瘤临床分子诊断技术的应用进展,三、肿瘤的分子诊断内容,2、核酸检测,血浆DNA(plasmaDNA)又被称为循环DNA(circulatingDNA),是存在于循环血液中的细胞外DNA(cell-freeDNA),它可以以DNA-蛋白质复合物的形式存在,也可以游离DNA片断形式存在。由于健康状态下少量衰老死亡(坏死或凋亡)细胞的DNA的释放,健康人血液中存在一定量的游离DNA。同时,由于健康状态下,循环DNA的生成与清除处于动态平衡状态,因此对于健康人而言,血液中循环DNA的水平能够维持在一个比较恒定的低水平。循环DNA能反映人体内新陈代谢的状况,是健康评判的一个重要指标。近年来的研究表明,人外周血液中的血浆循环DNA量和质的改变与多种疾病(包括肿瘤、复合性严重外伤、器官移植、妊娠相关疾病、感染性疾病、器官衰竭等)关系密切,因此血浆DNA作为一种无创性检测指标,有望成为某些疾病早期诊断、病程监测、疗效及预后评估的一种重要的分子标志物。,（1）、血浆DNA含量检测,肿瘤临床分子诊断技术的应用进展,二、肿瘤的分子诊断内容,（1）、血浆DNA含量检测,血浆DNA浓度检测研究发现，正常健康人群循环系统游离DNA平均约为7ng/ml；肿瘤患者循环系统游离DNA水平明显升高，可达到29ng/ml；术后游离DNA水平迅速下降至18ng/ml，并随病情的好转进一步下降。这种游离DNA的升高可发生在肿瘤早期，出现于临床症状发生之前。由于血清标本来源方便和非侵入性等优点，因此血液中游离DNA定量检测可预测受检者早期肿瘤的发生风险，从而采取有针对性的预防和治疗措施。,肿瘤临床分子诊断技术的应用进展,二、肿瘤的分子诊断内容,（1）、血浆DNA含量检测,肿瘤临床分子诊断技术的应用进展,二、肿瘤的分子诊断内容,（1）、血浆DNA含量检测,肿瘤临床分子诊断技术的应用进展,二、肿瘤的分子诊断内容,血浆DNA基因检测检测DNA甲基化包括P16基因、MGMT基因、DAPK基因、TMS1基因、RASSF1A基因。检测基因突变：K-RAS基因突变、P53基因突变、FHit基因突变。微卫星检测：MSA-2,3,4,5,12,16检测,（1）、血浆DNA含量检测,肿瘤临床分子诊断技术的应用进展,二、肿瘤的分子诊断内容,血浆RNA检测检测HER2/NEU以及HNrnp-b-1基因，文献报道联合两种基因可以发现100%肺癌患者。,（1）、血浆DNA含量检测,肿瘤临床分子诊断技术的应用进展,二、肿瘤的分子诊断内容,（2）、基因组检测,科学家们预计，当完成了人类基因组项目之后应该能够发现一些与人体常见疾病和性状相关的遗传信息。但人类基因组图谱公布之后大家突然发现，现实与预期的完全不同，科学家们居然一无所获。但我们真的就不能从人类基因组图谱当中发现一点有价值的东西吗？,肿瘤临床分子诊断技术的应用进展,三、肿瘤的分子诊断内容,4、基因组检测,肿瘤临床分子诊断技术的应用进展,二、肿瘤的分子诊断内容,（2）、基因组检测,Dual-specificityphosphatase6(DUSP6),monocyte-to-macrophagedifferentiationassociatedprotein(MMD),signaltransducerandactivatoroftranscription1(STAT1),v-erb-b2avianerythroblasticleukemiaviraloncogenehomolog3(ERBB3),lymphocyte-specificproteintyrosinekinase(LCK).,结论五个基因指纹与非小细胞肺癌的无复发生存期和总生存期密切相关,肿瘤临床分子诊断技术的应用进展,三、肿瘤的分子诊断内容,4、基因组检测,根据五个基因指纹RT-PCR检测的不同结果，用Kaplan-Meier法分析非小细胞肺癌患者的生存时间Overallsurvivalandrelapse-freesurvivalareshownforthe101patientswithNSCLC(PanelAandPanelB,respectively)andforthe59patientswithstageIorIIdisease(PanelCandPanelD,respectively).Overallsurvivalisalsoshownfortheindependentcohortof60patients(PanelE),forthe42patientsinthiscohortwhohadstageIorIIdisease(PanelF),andforthe86patientsdescribedinanindependentsetofpublishedNSCLCmicroarraydata10(PanelG).,肿瘤临床分子诊断技术的应用进展,二、肿瘤的分子诊断内容,4、基因组检测,70个预后相关基因表达谱监督分析,肿瘤临床分子诊断技术的应用进展,70个预后相关基因与肿瘤细胞生物学各个方面均有关,肿瘤临床分子诊断技术的应用进展,二、肿瘤的分子诊断内容,4、基因组检测,良好预后组患者没有一例复发,MammaPrint:良好预后组(n=23)不良预后组(n=144),StraverMetal,BritCancerResTreat2009,如何评估乳腺癌患者的复发风险,传统病理学标准,细胞增殖Ki-67STK15SurvivinCyclinB1MYBL2,雌激素ERPRBcl2SCUBE2,细胞侵润Stromelysin3CathepsinL2,HER2GRB7HER2,BAG1,GSTM1,参考基因Beta-actinGAPDHRPLPOGUSTFRC,CD68,Paiketal,NEJM2004;351:2817-26,16个肿瘤基因和5个参考基因构成了OncotypeDX基因组，根据这些基因的表达情况计算复发指数：,OncotypeDX21-基因复发指数,肿瘤临床分子诊断技术的应用进展,二、肿瘤的分子诊断内容,（2）、基因组检测,低复发指数（RS）与最小化疗获益相关；高复发指数（RS）与较好的化疗获益相关。OncotypeDX复发指数提供了简洁、定量的个体预后信息，是具有统计学意义、与患者年龄、肿瘤大小和肿瘤分期分级无关的独立指标。,OncotypeDX,肿瘤临床分子诊断技术的应用进展,二、肿瘤的分子诊断内容,（3）、microRNA检测,非编码-RNA：曾经被认为是毫无意义的多余物,tRNArRNAsnRNAtmRNARnasePRNAvRNAsgRNAsMRPRNASRPRNAs端粒酶RNA,转录/染色体结构调节因子转录调节因子蛋白功能调节因子RNA/蛋白定位调节因子,RNA转录,调节RNAmiRNAsiRNApiRNA反义RNA,编码蛋白的mRNA,非编码RNA转录,核仁小RNAs,管家RNAs,非编码-RNA在复杂的基因组学中起重要作用,microRNA（miRNA）是长度在1825个核苷酸左右的内源性非编码小分子RNA。miRNA在进化上高度保守，具有转录后基因调控功能。它由基因组DNA编码，在RNA聚合酶II的作用下被转录。这些小分子通过RNA诱导的沉默复合体（RNA-inducedsilencingcomplex,RISC）靶向到达mRNA，进而行使阻遏翻译或引导酶切的功能。最近有研究表明，miRNA具有多种生物学功能，如调节细胞发育、分化、增殖、凋亡等。,肿瘤临床分子诊断技术的应用进展,二、肿瘤的分子诊断内容,肿瘤临床分子诊断技术的应用进展,二、肿瘤的分子诊断内容,MiRNA生物合成基本过程,MiRNA调控基因表达两种机制,ChoWC.MicroRNAs:potentialbiomarkersforcancerdiagnosis,prognosisandtargetsfortherapy.IntJBiochemCellBiol2010.ChoWC.OncomiRs:thediscoveryandprogressofmicroRNAsincancers.MolCancer2007;6:60.,肿瘤临床分子诊断技术的应用进展,三、肿瘤的分子诊断内容,（4）肿瘤分子遗传学诊断,肿瘤临床分子诊断技术的应用进展,二、肿瘤的分子诊断内容,（4）肿瘤分子遗传学诊断,BRCA1andBRCA2arehumangenesthatbelongtoaclassofgenesknownastumorsuppressors.Innormalcells,BRCA1andBRCA2helpensurethestabilityofthecellsgeneticmaterial(DNA)andhelppreventuncontrolledcellgrowth.Mutationofthesegeneshasbeenlinkedtothedevelopmentofhereditarybreastandovariancancer.ThenamesBRCA1andBRCA2standforbreastcancersusceptibilitygene1andbreastcancersusceptibilitygene2,respectively.,肿瘤临床分子诊断技术的应用进展,二、肿瘤的分子诊断内容,（4）肿瘤分子遗传学诊断,Clonedin1995(Woosteretal.)Mappedtochromosome13q12-1310,254kb(3,418aa)27exonsClonedin1995(Woosteretal.)Mappedtochromosome13q12-1310,254kb(3,418aa)27exons,肿瘤临床分子诊断技术的应用进展,二、肿瘤的分子诊断内容,（4）肿瘤分子遗传学诊断,肿瘤临床分子诊断技术的应用进展,二、肿瘤的分子诊断内容,（4）肿瘤分子遗传学诊断,肿瘤临床分子诊断技术的应用进展,二、肿瘤的分子诊断内容,（4）肿瘤分子遗传学诊断,肿瘤临床分子诊断技术的应用进展,二、肿瘤的分子诊断内容,（4）肿瘤分子遗传学诊断,ScreeningforBreastCancerMonthlybreastself-examClinicalbreastexamevery6months25AnnualMammogram25,Bi-annual50Discuss+/-ofprophylacticmastectomywithMD,ScreeningforOvarianCancerAtleastannualrectovaginalpelvicexamCA125andtransvaginalultrasoundProphylacticbilateraloophorectomybyage35,肿瘤临床分子诊断技术的应用进展,二、肿瘤的分子诊断内容,（4）肿瘤分子遗传学诊断,肿瘤临床分子诊断技术的应用进展,二、肿瘤的分子诊断内容,（4）肿瘤分子遗传学诊断,乳腺癌基因检测的意义降低风险，安全更放心保乳手术的术式选择：BRCA突变携带者乳腺癌复发或对侧乳腺癌风险可高达70%-80%，因此基因突变携带者不宜做保乳手术，还是以乳腺切除术为好。某些妇女可预防切除另一侧乳腺。关心自己，更关爱家人遗传性乳腺癌并非不可预知，关键在于加强监测、早期诊断、早期治疗。如果检出BRCA突变，可尽早采取有效的防治措施，降低癌症危险度，保障健康人生，同时，可以告知家族成员接受BRCA检测，了解自身癌症风险。,肿瘤临床分子诊断技术的应用进展,二、肿瘤的分子诊断内容,（4）肿瘤分子遗传学诊断,乳腺癌遗传检测适宜人群(如果有以下因素，强烈建议接受乳腺癌BRCA检查)一个或多个直系亲属有乳腺癌史，如母亲或姐妹家族成员里有早发乳腺癌患者，发病年龄早于40岁家族成员里两代以上出现乳腺癌患者家族成员有双侧乳腺癌患者家族成员里有卵巢癌患者家族成员有男性成员乳腺癌患者一个或多个家族成员携带BRCA基因突变，即遗传检测阳性,肿瘤临床分子诊断技术的应用进展,二、肿瘤的分子诊断内容,9种预防癌症的生活方式1、盯住你的身体质量指数BMI：亚洲人最好将身体质量指数（BMI）控制在18.5至22.9之间。BMI计算方式为体重（公斤）身高（公尺）平方。2、每天流汗30分钟：这是最经济实惠的防癌方法。运动可以调整血液中睾固酮与雌激素，保护女性对抗与荷尔蒙相关的癌症。3、喝绿茶或咖啡：绿茶含有儿茶素及维生素A、C等抗氧化剂因此有防癌功效，咖啡也可以降低某些癌症发生率。4、新鲜蔬果：建议青少年及成年人，应每天摄食9份蔬果。蔬菜类1份约为生重100公克，水果类约为150公克。5、跳开脂肪诱惑：美国国家科学院报告指出，所有饮食构成要素中，脂肪与癌症关系最强烈，特别是乳癌、大肠癌。6、多吃鸡、鱼，少量吃猪；戒烟、戒酒、戒槟榔7、少盐、不喝含糖饮料：每天摄取的盐不超过6公克，少喝含糖分饮料，喝白开水最理想，天然果汁每天不超过150，并且不吃发霉的谷类及豆类。8、保持轻松的情绪减少压力：心情郁卒容易诱发癌症，许多罹癌的人回顾发病前两、三年，常是身心处于压力的状态。9、喂母乳：建议母亲至少喂6个月母乳。研究指出，喝母乳的宝宝将来罹患血癌风险比较低，妈妈则可得到降低乳癌风险的好处。,肿瘤临床分子诊断技术的应用进展,三、肿瘤治疗的分子监控,1、靶向治疗,随着人类基因组学、药物基因组学及肿瘤分子生物学研究的不断深入和发展，肿瘤治疗性药物的开发从传统的广谱药向特异性更强的靶向药发展。与此同时，传统的标准治疗、同病同治也正逐渐向个体化治疗转变。个体化治疗已经成为肿瘤临床治疗的发展方向和最有效的手段。大量的临床研究和试验结果表明：特异肿瘤分子标志物（靶标）是识别患者个体差异的重要依据，实现对这些肿瘤靶标的检测是个体化治疗的前提和基础。对癌症患者检测相关基因的表达状态，已成为靶向治疗药物治疗肿瘤的必要前提。,肿瘤临床分子诊断技术的应用进展,三、肿瘤治疗的分子监控,1、靶向治疗,肿瘤临床分子诊断技术的应用进展,三、肿瘤治疗的分子监控,非小细胞肺癌靶向治疗敏感性基因检测,肿瘤临床分子诊断技术的应用进展,三、肿瘤治疗的分子监控,临床试验表明易瑞沙和特罗凯仅对10-30%的NSCLC病人有显著疗效。研究发现EGFR基因突变与NSCLC靶向治疗的疗效具有相关性，绝大多数携带EGFR基因突变的病人疗效显著。突变可以增强肿瘤细胞对TKI的敏感性，并且可作为TKI治疗的有效预测指标。因此，检测EGFR基因突变对于指导NSCLC病人临床用药具有重要的参考价值。2010年NCCN非小细胞肺癌临床实践指南明确指出：当K-ras基因如果发生了突变，则不建议病人使用特罗凯（Tarceva/厄洛替尼/Erlotinib）进行分子靶向治疗。因此在应用靶向肺癌治疗之前进行EGFR、K-RAS基因突变检测十分必要,肿瘤临床分子诊断技术的应用进展,三、肿瘤治疗的分子监控,肿瘤临床分子诊断技术的应用进展,三、肿瘤治疗的分子监控,肿瘤临床分子诊断技术的应用进展,三、肿瘤治疗的分子监控,EGFR18基因外显子核苷酸序列检测图谱,肿瘤临床分子诊断技术的应用进展,三、肿瘤治疗的分子监控,EGFR基因19外显子核苷酸序列检测图谱,肿瘤临床分子诊断技术的应用进展,三、肿瘤治疗的分子监控,EGFR基因20外显子核苷酸序列检测图谱,肿瘤临床分子诊断技术的应用进展,三、肿瘤治疗的分子监控,EGFR基因21外显子核苷酸序列检测图谱,肿瘤临床分子诊断技术的应用进展,三、肿瘤治疗的分子监控,非小细胞肺癌靶向治疗敏感性基因检测,棘皮动物微管相关蛋白样4（EML4）编码蛋白N-末端部分融合至间变淋巴瘤激酶(ALK)的细胞内酪氨酸激酶结构域，重排为EML4-ALK，导致异常酪氨酸激酶表达。2007年Soda首次在非小细胞肺癌患者术后标本中检测到EML4-ALK重排融合。此后，美国、日本、韩国及中国香港均有报道，但在未经选择的NSCLC中，EML4-ALK阳性检出率较低，约1.5-6.7%。初步的分组研究表明,在满足：1、EGFR阴性，2、不吸烟或少吸烟，3、肺腺癌的条件中,EML4-ALK融合基因阳性率相对较高，可达到13%-23%。EML4-ALK阳性者的某些特征与EGFR突变者相似，但前者不能从EGFR-TKI靶向治疗中获益，因而对这部分患者的治疗策略需要转变。在刚刚落幕的第46届ASCO年会上，Bang等报告了Crizotinib（PF02341006）治疗晚期NSCLC的临床试验结果，针对ALK基因的小分子抑制剂Crizotinib在期临床试验中就显示出良好疗效。研究者认为，对于携带EML4-ALK融合基因的MSCLC患者，Crizotinib治疗的缓解率高，且安全性良好。目前，Crizotinib相关的多项临床试验正在进行中，我们期待分子靶向治疗的又一新成员早日面世。,肿瘤临床分子诊断技术的应用进展,三、肿瘤治疗的分子监控,非小细胞肺癌靶向治疗敏感性基因检测,非小细胞肺癌临床肿瘤分子研究的最新结果，表明EML4-ALK是对NSCLC基因变异分步检测的进一步丰富和完善，根据针对非小细胞肺癌所开展的靶向治疗EGFR、K-RAS检测项目，结合EML4-ALK融合基因分子检测，对拟行TKI治疗的患者，可以首先检测KRAS突变状态，排除阳性后对KRAS阴性者进行EGFR突变检测；若EGFR突变阳性，选择TKI治疗，阴性则继续行EML4-ALK检测；若EML4-ALK阳性者，可尝试针对ALK的靶向治疗。本中心希望在非小细胞肺癌人群分子分型不断完善的基础上，具备不同分子特征的患者得以接受最个体化的治疗。,肿瘤临床分子诊断技术的应用进展,三、肿瘤治疗的分子监控,K-RAS、BRAF基因突变检测,不能应用靶向药物,EGFR检测,突变,无突变,突变,应用靶向药物,Eml4-ALK基因检测,无突变,阴性,阳性,靶向ALK分子治疗,肿瘤临床分子诊断技术的应用进展,三、肿瘤治疗的分子监控,非小细胞肺癌靶向治疗敏感性基因检测,肿瘤临床分子诊断技术的应用进展,三、肿瘤治疗的分子监控,大肠癌靶向治疗敏感性基因检测,针对晚期结直肠癌的分子靶向药物贝伐单抗、西妥昔单抗、帕尼单抗已被批准用于临床，比传统药物更有效，且副作用更小，有效地延长了转移性结直肠癌患者的生存期。2007年及2008年多项期临床研究的回顾性分析显示，西妥昔单抗或帕尼单抗无论单药或联合化疗仅对KRAS基因野生型的结直肠癌患者有效。KRAS基因成为第一个结直肠癌靶向治疗的重要分子标志物。2008年10月，KRAS基因检测被写入最新版(2008年第3版)美国国立癌症综合网络(NCCN)结直肠癌临床实践指南。新指南传递给广大医师和患者两条重要的信息:一是所有转移性结直肠癌患者都应检测KRAS基因状态；二是只有KRAS野生型患者才建议接受EGFR抑制剂，如西妥昔单抗和帕尼单抗(包括单药或与化疗联合)治疗。,肿瘤临床分子诊断技术的应用进展,三、肿瘤治疗的分子监控,大肠癌靶向治疗敏感性基因检测,目前在欧美等发达国家，K-RAS基因检测已经成为大肠癌患者治疗前必做的常规检查，是目前医生了解大肠癌患者癌基因状况最直接、最有效的方法，并且成为能否报销相关抗EGFR治疗费用的依据。K-RAS基因检测可以筛选出对抗EGFR(表皮生长因子受体)靶向药物治疗有效的大肠癌患者，实现肿瘤病人的个体化治疗，从而达到良好的预后。早期检测K-RAS还可以通过该基因的状态了解到病人的复发转移风险，为将来选择最佳治疗做好准备。,肿瘤临床分子诊断技术的应用进展,三、肿瘤治疗的分子监控,大肠癌靶向治疗敏感性基因检测,K-ras基因第2外显子核苷酸序列检测图谱,K-ras基因第2外显子核苷酸序列检测图谱,肿瘤临床分子诊断技术的应用进展,三、肿瘤治疗的分子监控,乳腺癌靶向治疗敏感性基因检测,Her-2属于表皮生长因子受体酪氨酸激酶家族成员，为原癌基因编码的具有受体酪氨酸激酶(RTK)活性的跨膜糖蛋白，参与调控细胞生长、增殖和分化。25%30%的乳腺癌为Her-2基因的扩增/过度表达。赫塞汀是一种人源化的HER-2单克隆抗体，可有效阻碍HER2过度表达导致的肿瘤细胞生长。无论是单独使用、与标准化疗联合、还是在标准化疗之后使用，赫赛汀均能提高治疗反应率、无病存活期以及整体存活期，毒副反应小，患者耐受性好，较好地保证了HER2阳性乳腺癌妇女的生活质量。,肿瘤临床分子诊断技术的应用进展,三、肿瘤治疗的分子监控,乳腺癌靶向治疗敏感性基因检测,Her-2扩增的患者预后更差：Her-2基因是一个重要的临床预后指标。具有Her-2基因扩增的乳腺癌患者无病生存期(DFS)和总生存期(OS)缩短，肿瘤负荷更大，淋巴结转移几率高，复发风险高。指导内分泌治疗药物的选择：相对于无Her-2基因扩增的乳癌患者而言，具有Her-2基因扩增的患者应用他莫昔芬(TAM)治疗后的死亡风险明显增高。提示具有Her-2基因扩增的患者可能不适合应用TAM作为内分泌治疗的选择。对ER阳性的绝经后患者，HER-2阳性者，来曲唑的疗效明显高于TAM。来曲唑对HER-2阳性患者的疗效优于阴性患者；TAM则相反，对HER-2阴性患者的疗效明显高于阳性患者。,肿瘤临床分子诊断技术的应用进展,三、肿瘤治疗的分子监控,乳腺癌靶向治疗敏感性基因检测,Her-2扩增患者辅助化疗药物的选择：Her-2扩增的乳腺癌患者对CMF化疗方案的反应性降低；Her-2扩增的患者，对高剂量强度的蒽环类药物方案敏感；Her-2阳性的乳腺癌患者对紫杉醇化疗的反应性明显高出HER-2阴性的患者。筛选靶向治疗药物Hercepetin的使用者：分子靶向治疗药物Trastuzumab/Herceptin对具有HER-2基因扩增的患者具有良好的治疗效果，而对于17号染色体非整倍体导致的HER-2基因数目相应的增加及不扩增的患者效果不佳。,肿瘤临床分子诊断技术的应用进展,三、肿瘤治疗的分子监控,Her2(-),Her2(+),FISH,肿瘤临床分子诊断技术的应用进展,三、肿瘤治疗的分子监控,甲状腺癌治疗相关基因检测,甲状腺癌发病机制中，基因突变在甲状腺癌的发生过程中占有重要的地位，其中BRAF是甲状腺癌最常见的分子遗传学改变。BRAF基因编码蛋白是MAPK信号传导通路RASRAFMEKERK中的重要激酶，15外显子的单个碱基错义突变（T1799A）导致翻译蛋白质600位密码子的缬氨酸（Valine）被谷氨酸（Glutamate）替换，成为活化蛋白质激酶（BRAFV600E）。BRAF激酶的持续活化，导致MEK(细胞外信号调节激酶)持续磷酸化，MAPK信号传导通路持续活化，影响细胞的生长和增殖。BRAFV600E突变主要见于经典型PTC和微小癌，甲状腺非瘤性病变、良性肿瘤和其他类型的分化型甲状腺癌中未发现BRAF变异，因此BRAFV600E可用于甲状腺癌的辅助诊断。针吸活检作为目前甲状腺肿瘤最常用的检查，对15%-20的细胞组织难以明确性质；另一方面，针吸活检诊断明确的甲状腺癌，最终证实只有17%-5l的准确率。因此需要新的方法提高对甲状腺癌诊断的准确性和特异性。进行BRAF基因突变可进一步提高术前细针抽吸活检（fineneedleaspiration,FNA）细胞学检查对甲状腺恶性结节的诊断率。,肿瘤临床分子诊断技术的应用进展,三、肿瘤治疗的分子监控,甲状腺癌治疗相关基因检测,肿瘤临床分子诊断技术的应用进展,三、肿瘤治疗的分子监控,黑色素瘤靶向治疗相关基因检测,BRAF是原癌基因，编码的丝/苏氨酸特异性激酶参与调控细胞内多种生物学事件，如细胞生长、分化和凋亡等。研究发现，约66%恶性黑色素瘤存在BRAF基因突变，其中约80-90%为V600E突变。新一代靶向药物PLX4032可选择性抑制BRAFV600E突变，I期临床试验(87例患者)表明，PLX4032治疗BRAFV600E突变型黑色素瘤的有效率高达81%，可使目标病变体积缩小30%。期临床试验(132例患者)截至2010年9月的数据显示，确证的反应率为52%。,肿瘤临床分子诊断技术的应用进展,三、肿瘤治疗的分子监控,2、化疗药物治疗指导用药药物基因组学(pharmacogcnomics)是20世纪90年代末发展起来的从基因水平研究基因序列的多态性与药物效应多样性之间的关系，研究遗传因素对药物效应的影响，确定药物作用的靶点，从表型到基因型的药物反应的个体多样性。即：研究基因本身及其突变体对不同个体药物作用效应差异的影响，以此为平台指导合理用药，提高用药的安全性和有效性，避免不良反应，减少药物治疗的费用和风险。通过对患者的基因位点进行检测，能进一步确定对特定药物具有很强敏感性或抵抗性的患病人群，从而指导临床开出适合不同个体的处方，使患者既能获得最佳治疗效果，又能避免药物的不良反应，达到个体化用药的目的。,肿瘤临床分子诊断技术的应用进展,三、肿瘤治疗的分子监控,2、化疗药物治疗指导用药（1）、基因表达与用药,肿瘤临床分子诊断技术的应用进展,三、肿瘤治疗的分子监控,2、化疗药物治疗指导用药（1）、基因表达与用药,ERCC1（excisionrepaircrosscomplementgroup1，核苷酸切除修复交叉互补组1）基因编码一种含有297个氨基酸的蛋白质,参与DNA链的切割和损伤修复,其表达产物与DNA修复酶缺乏互补基因F(XPF)形成紧密的异二聚体(ERCC1-XPF),具有损伤识别和切除5端的双重作用,在核苷酸切除修复(nucleotideexcisionrepair,NER)中起到限速或调节的重要作用。铂类抗癌药物的细胞毒性作用主要是通过形成铂-DNA加合物。DNA基因修复主要是由NER和链间交联完成的,而ERCC1是他们中一个关键因素,是参与NER过程并与顺铂耐药紧密相关的关键因子。研究表明ERCC1表达与化疗疗效呈负相关,这与ERCC1在DNA修复中的作用相关,尤其是ERCC1能使顺铂诱导的DNA络合物的清除增加,从而降低疗效。美国国家癌症综合治疗联盟（NCCN）的非小细胞肺癌的临床治疗指南（第二版，2009）中明确指出：“在接受铂类化疗药物治疗前进行ERCC1mRNA的表达水平的检测可提高治疗的有效率和患者的生存率”。,肿瘤临床分子诊断技术的应用进展,三、肿瘤治疗的分子监控,2、化疗药物治疗指导用药（1）、基因表达与用药,肿瘤临床分子诊断技术的应用进展,三、肿瘤治疗的分子监控,2、化疗药物治疗指导用药（1）、基因表达与用药,抗有丝分裂药物是化疗药物的重要组成部分，根据与微管的结合部位不同可分为三类：紫杉烷类（如紫杉醇、紫杉萜）；长春碱类（如长春新碱、长春瑞滨）以及秋水仙素类。紫杉醇通过与微管蛋白结合，形成稳定的微管束，抑制真核细胞的有丝分裂。它使肿瘤细胞停止在G2期和M期,抑制细胞复制,阻止癌细胞增殖。细胞的微管蛋白分，两个亚型，是细胞骨架的重要组成部分，是有丝分裂时纺锤体的组成的单位，也是抗微管蛋白的主要作用靶点。-微管蛋白基因（tubulinbeta-3chain，TUBB3基因）编码的3型微管蛋白与抗微管与抗微管化疗药敏感性的关系最密切。在多种肿瘤细胞系的研究和临床研究中，都显示TUBB3mRNA表达水平与抗微管类化疗的疗效密切相关。,肿瘤临床分子诊断技术的应用进展,三、肿瘤治疗的分子监控,2、化疗药物治疗指导用药（1）、基因表达与用药,胸苷酸合成酶（ThymidylateSynthetase，TYMS）是DNA合成的关键酶，在DNA合成与修复中起重要作用,是叶酸代谢循环中起中心作用的酶类之一，也是以5-氟尿嘧啶(5-FU)为基础化疗的靶酶。5-Fu在体内须转化为相应的核苷酸类似物才能发挥细胞毒作用，其主要机制为转化为一磷酸氟代脱氧尿苷(FdUMP),后者与TYMS、5,10-亚甲基四氢叶酸形成三联复合物，并抑制TYMS，阻碍dTMP的从头合成；并且以FdUTP或FUTP的形式掺入到DNA或RNA分子中,破坏其结构和功能。临床研究表明，在包括直肠癌、肺癌、乳腺癌、头颈鳞状细胞癌等多种肿瘤患者中，TYMS基因低表达水平的患者接受氟类化疗的效果较好。所以，检测肿瘤患者中TYMS的基因表达水平可以预测氟类药物的疗效。,肿瘤临床分子诊断技术的应用进展,三、肿瘤治疗的分子监控,2、化疗药物治疗指导用药（1）、基因表达与用药,核苷酸还原酶(ribonucleotidereductase,RR)是RNA合成的前体,它能使核糖核苷酸还原成为脱氧核糖核苷酸,后者是DNA合成和修复所必需的,是DNA合成通路中的限速酶,其包括2个亚单位:RRM1和RRM2。RRM1基因编码核糖核苷还原酶M1亚单位，是肿瘤抑制基因，能抑制肿瘤转移。吉西他滨（Gemcitabine,GEM）是嘧啶类抗代谢药,属细胞周期特异性药物,作用于DNA合成期即S期,使DNA合成发生障碍。RRM1是盐酸GEM耐药的一个重要预测指标。美国国家癌症综合治疗联盟（NCCN）的非小细胞肺癌的临床治疗指南（第二版，2009）中明确指出：“在接受吉西他滨药物治疗前进行RRM1mRNA的表达水平的检测可提高治疗的有效率和患者的生存率”。,肿瘤临床分子诊断技术的应用进展,三、肿瘤治疗的分子监控,2、化疗药物治疗指导用药（1）、基因表达与用药,依托泊苷用药检测（TOP2A基因）依托泊苷（etoposide）为细胞周期特异性抗肿瘤药物，是DNA拓扑酶（Topo）抑制剂。其抗癌机制是作用于DNA拓扑异构酶，形成药物-酶-DNA稳定的可逆性复合物，阻碍DNA修复。Topo抑制剂通过直接作用Topo或仅与双链DNA中的一条链结合以影响Topo功能。研究表明Topo酶活性的降低或表达水平降低都会造成Topo抑制剂药物耐药。研究报道：高表达的Topo使用依托泊苷效果较好，低表达的Topo对依托泊苷药物耐药。,肿瘤临床分子诊断技术的应用进展,三、肿瘤治疗的分子监控,2、化疗药物治疗指导用药（2）、基因突变与用药与顺铂化疗耐药相关突变点XRCC1突变点检测XRCC1是碱基切除修复和单链断裂修复系统中的重要成分。目前XRCC1基因中已识别的氨基酸突变中与铂类药物敏感性的研究主要集中在第194(ArgTrp)和第399(ArgGln)密码子这两个位点。王中华等发现在XRCC1Arg194Trp基因表达中，携带Arg/Arg基因型的患者对铂类药物化疗失败的风险是至少携带一个Trp等位基因患者的3倍；携带XRCC1399Arg/Gln或Gln/Gln基因型的患者对铂类药物化疗失败的风险是XRCC1399Arg/Arg携带者的2.7倍。,肿瘤临床分子诊断技术的应用进展,三、肿瘤治疗的分子监控,2、化疗药物治疗指导用药（2）、基因突变与用药与顺铂化疗耐药相关突变点XPD突变点检测XPD也称之为ERCC2，在DNA损伤修复中起着重要作用。XPD的多态性可以改变DNA修复能力，与铂类药物的敏感性密切相关。Hemminki等报道,携带312Asn/Asn的个体修复嘧啶二聚体的能力比野生基因型低50%。并进一步发现XPD312SNP变异数目与化疗具有很好的相关性，即含有变异型等位基因的个数越多，其中位生存时间越短。GSTP1突变点检测谷胱甘肽-S-转移酶（GSTP1)催化谷胱甘肽与多种毒性复合物(包括铂类制剂)结合,形成低毒高水溶性物质排出细胞外。GSTP1-105基因型对胃癌病人接受含顺铂药物化疗敏感性产生影响,其中GSTP1-105Val/Val基因型的病人化疗有效率(67%)及中位生存时间(15个月)明显长于基因型为Ile/Ile和Ile/Val(21%和6个月)的病人,认为GSTP1-105的基因多态性检测可以预测胃癌病人对含顺铂化疗的敏感性及预后。,肿瘤临床分子诊断技术的应用进展,三、肿瘤治疗的分子监控,2、化疗药物治疗指导用药（2）、基因突变与用药与5-氟尿嘧啶化疗耐药相关突变点亚甲基四氢叶酸还原酶基因(MTHFR)突变点检测MTHFR是叶酸代谢过程中的关键酶，可将还原型叶酸转变成5-甲四氢叶酸（5-MTHF），从而使FdUMP、TS与还原型叶酸组成的三元复合物减少，削弱5-Fu的