鸡新城疫血凝和血凝抑制实验

.,1,鸡新城疫的实验室诊断及免疫效果的评价,目的1、掌握鸡新城疫的临诊要点。2、了解和掌握鸡新城疫的实验室诊断和免疫监测技术。,.,2,内容1、鸡新城疫的临诊要点。2、鸡新城疫的实验室诊断。NDV的分离及鉴定；NDV毒力的鉴定3、鸡新城疫的免疫效果评价,.,3,鸡新城疫的免疫监测血凝试验(HA)和血凝抑制试验(HI),.,4,血凝试验（HA）和血凝抑制试验(HI),HA和HI的原理HA试验：许多病毒表面有血凝素，能与各种动物的红细胞表面受体结合，而出现红细胞凝集现象，简称为病毒的血凝现象。2.HI试验：病毒的红细胞凝集现象，可以被特异性免疫血清所抑制，称HI试验。,.,5,一、鸡新城疫的血凝试验(HA),【材料】新城疫病毒鸡胚接种尿囊液1份0.5鸡血球悬液1管生理盐水或PBS1瓶96孔微量血清盘1块微量加样器1支,.,6,一、鸡新城疫的血凝试验(HA),【方法与步骤】（一）制备鸡红细胞悬液：1.用注射器抽取抗凝剂。2.用上述注射器，采用无菌法抽取健康的未免疫鸡的静脉血。3.混匀，加生理盐水适量，洗涤离心，共离心三次（第一、二次2000转/分5分钟、第三次3000转/分5分钟）洗去血清及白细胞。取纯红细胞0.6ml，加生理盐水稀释99.4ml，即成1%的鸡红细胞悬液。,.,7,一、鸡新城疫的血凝试验(HA),（二）加样,1.在96孔微量反应板上进行，自左至右各孔加50L生理盐水。2.于左侧第1孔加50L病毒液，混合均匀后，吸50L至第2孔，依次倍比稀释至第11孔，吸弃50L；第12孔为红细胞对照。3.自右至左依次向各孔加入0.5%鸡红细胞悬液50L，在振荡器上振荡，室温下静置后观察结果。,.,8,一、鸡新城疫的血凝试验(HA),【病毒血凝试验的操作方法（单位：L）】,以100%凝集的病毒最大稀释度为该病毒血凝价，即为一个凝集单位,.,9,一、鸡新城疫的血凝试验(HA),【结果判定】置于振荡器上振荡1分钟，静置后30min开始观察结果，待对照孔红细胞已沉淀即可进行结果观察。红细胞全部凝集，沉于孔底，平铺呈网状，即为100%凝集（+），不凝集者（-）红细胞沉于孔底呈点状。以100%凝集的病毒最大稀释度为该病毒血凝价，即为一个凝集单位。从表4-1看出，该新城疫病毒液的血凝价为1:128，则l:128为1个血凝单位，1:64、l:32分别为2、4个血凝单位，或将128/4=32，即1:32稀释的病毒液为4个血凝单位。,.,10,二、鸡新城疫的血凝抑制试验(HI),【材料】除血球凝集试验所用材料外，血清取鸡免疫血清。,.,11,鸡群卵黄抗体的制备,1.取鸡蛋卵黄20ml，加入等量生理盐水，振荡，摇匀。2.加入等量氯仿40ml，振荡30分钟。3.取振荡的卵黄液30004000rpm30分钟。4.取上清液作为抗体检测材料,.,12,二、鸡新城疫的血凝抑制试验(HI),【方法】1.根据HA试验结果，确定病毒的血凝价，配制出4个血凝单位的病毒液。2.在96孔微量反应板上进行，用固定病毒稀释血清的方法，先在第1孔加50L生理盐水。3.自第3孔至12孔各加50L4个血凝单位的新城疫病毒液。4.第孔加被检鸡血清50L，吹吸混合均匀，吸50L至第2孔，依此倍比稀释至第10孔，吸弃50L，稀释度分别为：1:、1:4、1:8；第12孔加新城疫阳性血清50L，作为血清对照。振荡混合均匀，置室温中作用20min。5.自第l孔至12孔各加0.5%鸡红细胞悬液50L，振荡混合均匀，室温下静置30-40min后观察结果,.,13,二、鸡新城疫的血凝抑制试验(HI),【病毒血凝抑制试验的操作方法（单位：L）】,以100抑制凝集（完全不凝集）的被检血清最大稀释度为该血清的血凝抑制效价，即HI效价。,.,14,二、鸡新城疫的血凝抑制试验(HI),【结果判定】以100抑制凝集（完全不凝集）的被检血清最大稀释度为该血清的血凝抑制