第七章体液蛋白质检验ppt课件

.,1,第七章体液蛋白质检验,人类白蛋白分子,.,2,本章内容概要：,第二节体液蛋白质测定,第一节概述,.,3,1、掌握血浆蛋白质的组成、功能及分类；个别血浆蛋白质（前白蛋白、白蛋白）的来源和生理功能；血清总蛋白和白蛋白的测定方法和原理。,2、熟悉急性时相反应蛋白的概念和种类；血清球蛋白和纤维蛋白原的测定方法。,3、了解其他蛋白质的来源和生理功能；尿液蛋白和脑脊液蛋白的检测。,本章教学要求：,.,4,第一节概述,.,一、血浆蛋白质的分类和功能,组成：,种类：1000种500种200种含量：gmgg来源：肝脏是蛋白质主要的加工厂,（一）血浆蛋白质的组成、功能及分类,.,6,营养作用，修补组织蛋白;维持血浆胶体渗透压：主要是白蛋白；作为PH缓冲系统的一部分：酸性或碱性蛋白质；运输作用：作为激素、维生素、脂类、代谢产物、离子、药物等的载体；体液免疫防御系统：作为免疫球蛋白与补体等免疫分子；催化作用：酶的本质；代谢调控作用；作为底物，酶或中间产物抑制或激活组织蛋白酶；参与凝血与纤维蛋白溶解；：除因子外均可。,血浆蛋白质的功能,.,7,血浆蛋白质的分类,7,分离方法,盐析法：白蛋白/球蛋白（pH7.0半饱和的硫酸铵溶液）,电泳法：,醋酸纤维素薄膜电泳：6种,琼脂糖凝胶电泳：13种,聚丙烯酰胺凝胶电泳：30种,SDS聚丙烯酰胺凝胶等电双向电泳：300种,分辨率增高,-,-,-,+,纤维蛋白原,醋酸纤维素薄膜,.,醋纤膜电泳或琼脂糖电泳：5个成分清蛋白1球蛋白2球蛋白球蛋白球蛋白分辨率高时：可有7个成分有1和22中也可有两条聚丙烯酰胺凝胶电泳：可以分出30多种蛋白质,醋纤膜电泳或琼脂糖电泳：5个成分,清蛋白1球蛋白2球蛋白球蛋白球蛋白,2.电泳分类法,是临床实验室常用的血浆蛋白质电泳方法,分辨率高时：可有7个成分有1和22中也可有两条聚丙烯酰胺凝胶电泳：可以分出30多种蛋白质,.,9,3.功能分类法,（1）运输载体类血浆脂蛋白：包括CM、VLDL、LDL、HDL等前清蛋白与清蛋白甲状腺素结合球蛋白皮质素结合球蛋白类固醇激素结合球蛋白视黄醛结合蛋白转铁蛋白触珠蛋白血色素结合蛋白铜蓝蛋白,.,（2）蛋白酶抑制物：包括1-抗胰蛋白酶、1-抗糜蛋白酶、2-巨球蛋白等6种以上（3）血清酶类：血浆固有酶如LCAT等组织细胞少量释放的细胞内酶细胞破裂而进入血循环的细胞内酶（4）蛋白类激素：胰岛素、胰高血糖素、生长激素等（5）凝血蛋白类（6）免疫球蛋白类（7）补体蛋白类,（2）蛋白酶抑制物：包括1-抗胰蛋白酶、1-抗糜蛋白酶、2-巨球蛋白等6种以上（3）血清酶类：血浆固有酶如LCAT等组织细胞少量释放的细胞内酶细胞破裂而进入血循环的细胞内酶（4）蛋白类激素：胰岛素、胰高血糖素、生长激素等（5）凝血蛋白类（6）免疫球蛋白类（7）补体蛋白类,还有许多种类的蛋白质未被认识,还有许多种类的蛋白质未被认识,2.功能分类法,.,1.作为运载蛋白2.组织蛋白酶抑制物3.在血浆中起催化作用的酶4.参与代谢调控作用的蛋白质和肽类激素5.参与凝血与纤维蛋白溶解6.组成体液免疫防御系统（Ig与补体）所有血浆蛋白质能维持血浆胶体渗透压组成血液pH缓冲系统,（二）血浆蛋白质的功能,生物化学,.,12,急性时相反应（acutephasereaction，APR）：血浆蛋白质对急性炎症和组织损伤的非特异性反应。此时许多蛋白质：如1-抗胰蛋白酶、1-酸性糖蛋白、结合珠蛋白、铜蓝蛋白、C4、C3、纤维蛋白原和C-反应蛋白等浓度显著升高或升高，而少数蛋白质如前清蛋白、清蛋白、转铁蛋白则出现相应下降。急性时相反应蛋白(acutephasereactiveprotein，APP)：对急性炎症和组织损伤起非特异反应从而出现浓度变化的血浆蛋白质。增加的蛋白质称为正向APP下降的蛋白质称为负向APP,1.急性时相反应,（三）影响血浆蛋白质浓度的因素,.,13,机体哪些情况会出现急性时相反应？急性细菌性感染如急性肺炎、链球菌感染性肾炎急性非特异性炎症如风湿性关节炎、类风湿性关节炎、风湿性心脏病等急性心肌梗死恶性肿瘤手术、创伤,.,14,APR的机制,炎症损伤部位释放的细胞因子，包括白介素、肿瘤坏死因子和、干扰素以及血小板活化因子等，引发肝细胞中上述蛋白质合成量的改变。正向APP是机体防御机制的一个部分，如：增加的蛋白酶抑制剂控制组织中的酶活性触珠蛋白保护从破坏红细胞中释放的HbC反应蛋白等可活化补体负向APP多作为营养蛋白，此时合成减少，可为合成正向APPs提供更多的氨基酸原料。,.,15,APR的时相,C-反应蛋白：首先升高1-酸性糖蛋白：12小时内也升高1-抗胰蛋白酶、触珠蛋白、C4和纤维蛋白原然后升高C3和铜蓝蛋白：最后是升高通常在25天内这些APPs达到最高值,.,16,测定APP的临床意义,帮助监测炎症的发生、变化和观察治疗反应，尤其是那些升高最早和最多的蛋白质,.,30,二、血清蛋白质电泳组分的临床分析,血浆蛋白质和血清蛋白质有何不同？血浆：为生理状况血清：为常用检测标本,血浆蛋白质和血清蛋白质有何不同？血浆：为生理状况血清：为常用检测标本,.,31,（一）血清蛋白质电泳的正常组分及其含量,清蛋白：57681球蛋白：1.05.72球蛋白：4.911.2球蛋白：713球蛋白：9.818.2,醋纤膜电泳正常百分含量清蛋白：57681球蛋白：1.05.72球蛋白：4.911.2球蛋白：713球蛋白：9.818.2,醋纤膜或琼脂糖电泳正常区带,区带图谱,扫描图谱,kk,.,.,.,1.肾病综合征,2.肝硬化,正常图谱,典型的-桥,不典型-桥,IgG型,IgA型,3.多发性骨髓瘤,2,典型的异常电泳图谱及其扫描曲线,.,22,（四）球蛋白增多与M蛋白,Ig多克隆性增多：区带呈弥散性升高见于反复或慢性感染、自身免疫性疾病、肝细胞疾病或寄生虫感染。Ig单克隆性增多M蛋白：区带局部有深染窄带浆细胞病、尤其恶性浆细胞病时，异常浆细胞单克隆增殖，产生大量单克隆Ig或轻链或重链片段，病人血清或尿液中可出现结构单一的M蛋白,Ig多克隆性增多：区带呈弥散性升高见于反复或慢性感染、自身免疫性疾病、肝细胞疾病或寄生虫感染。Ig单克隆性增多M蛋白：区带局部有深染窄带浆细胞病、尤其恶性浆细胞病时，异常浆细胞单克隆增殖，产生大量单克隆Ig或轻链或重链片段，病人血清或尿液中可出现结构单一的M蛋白,.,23,二、血浆蛋白质,（一）前白蛋白（PA）（二）白蛋白（ALB）（三）1-酸性糖蛋白（AAG）（四）甲胎蛋白(AFP)（五）结合珠蛋白(Hp)（六）2-巨球蛋白(AMG)（七）铜蓝蛋白(CER/CP)（八）转铁蛋白(TRF)（九）2微球蛋白(BMG)（十）C-反应蛋白质(CRP),.,24,结构：MW=54000，四个相同亚基构成的四聚体。理化性质：p4.7，肝细胞合成，半寿期12小时。测定方法：免疫比浊法免疫扩散技术。,.,25,功能：营养指标，载体功能（甲状腺素维生素）。临床意义：1.作为营养不良的早期指标；2.作为肝功能不全的指标，比Alb更灵敏；3.负性急性时相反应蛋白，急性炎症，恶性肿瘤，肝硬化及肾炎等情况下，PA迅速降低。参考值：0.180.45g/L。,.,26,急性时相反应蛋白,.,27,.,28,.,29,结构：585个aa残基构成的单链多肽，MW=66458，含17个二硫键。理化性质：pI=45.8，肝细胞合成但不储存，半衰期为15-19天，占总蛋白的40%60%，p7.4时带负电。测定方法：色素结合法:溴甲酚绿（BCG），溴甲酚紫（BCP）,盐析等。,（二）白蛋白（ALB）急性时相反应蛋白,.,30,功能：营养作用，载体功能（高亲和力），维持血浆渗透压和正常p值。临床意义：合成受食物影响，敏感性较低。降低:在营养不良，肝功不全，急慢性肝疾病时;增高:少见,假性升高。参考值：35-50g/,.,31,功能：蛋白酶抑制物（具有90的抑制蛋白酶活力）。如糜蛋白酶，弹性蛋白酶，但此抑制作用有明显的p依赖性。临床意义：降低：血浆AAT仅见于胎儿呼吸迫综合症。升高：炎症、术后，某些激素治疗后。参考值：0.831.99g/L,.,32,结构：181个aa残基构成的单链多肽，MW=4万，含45%的糖，其中唾液酸占11%12%。理化性质：pI值2.73.5，肝合成，脓毒症时粒细胞和单核细胞及某些肿瘤组织也可合成。位于1-球蛋白区带。测定方法：免疫化学法（扩散,浊度）,化学法（间接法），ELISA法等,（三）1-酸性糖蛋白（AAG）急性时相反应蛋白,.,33,功能：与免疫防御功能有关，机制不详；抑制血小板凝集影响胶原纤维形成；参与脂类运输。临床意义：升高：急性炎症，组织损伤，风湿，肿瘤，AMI，溃结时；降低：营养不良降低,严重肝损伤和雌激素作用。参考值：.252.0g/L。,.,34,结构：590个aa残基构成的单链多肽，MW=6.5万万，含4%的糖。理化性质：pI值.7-.8，在白蛋白和1-球蛋白之间。胎儿肝卵黄囊合成，成人量微，升高由于肿瘤细胞合成。测定方法：免疫化学法（扩散,火箭电泳）,ELISA等,（四）甲胎蛋白(AFP),.,35,功能：胎儿血浆主要蛋白质，调节肝细胞生长和脑细胞发育；抑制细胞和体液的免疫反应；维持正常妊娠，防止母婴排斥。临床意义：胎儿产前监测（羊水或母血）增高：原发性肝癌患者诊断和鉴别（80%原发增高），其他癌症也可见增高。参考值：20-100g/L(成人)5g/L(新生儿),.,36,结构：两对肽链形成四聚体，有变异体。理化性质：肝合成，pI值为4.1，电泳位a2-球蛋白区带测定方法：电泳法，免疫化学法（扩散,浊度）,化学法等,（五）结合珠蛋白(Hp)急性时相反应蛋白,.,37,功能：与红细胞中释出自由Hb结合,防止Hb从尿中丢失保存铁,急性溶血后一周再生恢复。高效的过氧化物酶。需铁细菌的天然抑菌剂。临床意义：升高：急性时相反应；降低：血管内溶血时；雌激素作用。参考值：0.5-2.2g/L,.,38,结构：MW=6280万,分子量最大，由四个相同的亚基组成，含糖量约。理化性质：肝细胞与单核吞噬细胞系统中合成，半寿期5天。测定方法：免疫化学等,（六）2-巨球蛋白(AMG),不属于急性时相反应蛋白,.,39,功能：与多种分子和离子结合，影响蛋白水解酶活性（主要的蛋白酶抑制剂具有选择性保护某些酶的作用）。临床意义：婴幼儿及儿童比成人高；升高：雌激素，低蛋白血症尤其是肾病综合征时，可显著升高以维持血浆胶体渗透压；降低：胰腺炎及前列腺癌时。参考值：1.31-2.93g/L,.,40,结构：MW=12-16万,1046个aa残基构成的单链多肽，含糖约，每分子铜蓝蛋白可结合个铜原子。理化性质：肝合成,巨噬细胞和淋巴细胞合成少量；pI值为4.4，具遗传基因多态性。测定方法：免疫化学（扩散或比浊）等,（七）铜蓝蛋白(CER/CP)急性时相反应蛋白,.,41,功能：具氧化酶活性且起抗氧化剂作用，铜的无毒代谢库临床意义：增加感染,创伤,肿瘤;降低-营养不良，严重肝病及肾综;协助诊断Wilson病（肝豆状核变性）参考值：0.21-0.53g/L,.,42,结构：MW=7.7万,单链糖蛋白，含糖约。理化性质：肝细胞合成，pI值为5.5-5.9,半寿期7天，可逆结合多价离子如Fe、Cu、Zn、Co等，一分子TRF可结合两个三价铁。测定方法：免疫扩散法，放免法和免疫比浊法等。,（八）转铁蛋白(TRF/Tf)急性时相反应蛋白,.,43,功能：运输铁。临床意义：血TRF浓度受铁供应调节，缺铁TRF升高，铁治疗后恢复。可用于贫血的诊断（缺铁性低色素性贫血TRF升高，再障时TRF正常或者降低）和对治疗的监测。降低:急性时相反应、慢性肝病、营养不良及蛋白丢失时；升高：妊娠或雌激素会使其降低;缺铁性低色素贫血。参考值：2.5-4.3g/L(成人)1.30-2.75g/L(新生儿),.,44,结构：MW=11800，100个aa残基构成的单链多肽，分子中含一对二硫键，不含糖。理化性质：pI值为5.7，淋巴细胞合成，存在细胞表面，特别是淋巴和肿瘤细胞。释放入血循环。半衰期107分钟，几乎由肾小管回收。测定方法：放射免疫化学等。,（九）2微球蛋白(BMG),.,45,功能：分子量小，可自由通过肾小球滤过膜，在肾小管几乎全部重吸收，可监测肾小管功能；是HLA（人类白细胞抗原）链的轻链部分。临床意义：增高：肾功能衰竭，炎症及肿瘤时。参考值：1.02.5mg/L（血浆）,.,性质：因在急性炎症病人血清中出现，可结合肺炎球菌细胞壁C-多糖的蛋白质而命名。结构：MW11.5-14万，分子含个相同的亚基，亚基间靠非共价键连接成圆盘状多聚体。理化性质：肝合成，pI值为6.2，电泳位于区带。测定方法：半定量沉淀法（早），免疫化学法。,（十）C-反应蛋白质(CRP)急性时相反应蛋白,.,47,功能：结合多糖，磷脂和核酸；激活补体，抗凝。临床意义：第一个认定的急性时相反应蛋白,是急性时相反应的一个敏感指标，在、创伤、感染、外科手术、肿瘤浸润时含量迅速升高，达到正常的2000倍。CRP是非特异性指标，需结合临床病史。参考值：8.0mg/L（血浆）,.,48,急性时相反应蛋白分类：,升高：其他种蛋白质。,降低：前白蛋白、白蛋白、转铁蛋白,.,49,第二节体液蛋白质测定,总蛋白测定,个别蛋白质的测定,蛋白分离测定技术,发展趋势:,测定体液标本:,血浆：普遍,尿液，脑脊液和胸腹水等：有选择性的组织病变检查,.,50,免疫化学法特异定量个别蛋白质,体液蛋白质的测定方法概括：,常规：免疫浊度法、免疫扩散法，免疫电泳法，微量：放射免疫测定（RIA），酶免疫测定法（ELA/ELISA）,.,51,电泳测定：,定量化学测定TPr，Alb,电泳组成图谱半定量定量,染料结合法，UV法，折光法等,.,52,一、血清总蛋白测定,假设：,、纯多肽链，含氮量平均为16%、各种蛋白质与化学试剂反应性一致，仅为相对定量,.,53,测定依据：蛋白质测定一般利用蛋白质以下的结构或性质,1、元素组成测定：含N稳定；2、重复的肽链结构：具有多个肽键；3、酪氨酸和色氨酸与Folin-酚试剂反应显色或UV吸收；4、与色素结合的能力：与染料以离子键或共价键连接；5、沉淀后借浊度测定：光度计测定；6、光折射测定：折射仪测定。,.,54,方法：,1.凯氏定氮法参考方法2.双缩脲法(推荐)3.酚试剂法4.散射比浊法5.染料结合法6.UV法.折光测定法,.,55,1.凯氏定氮法参考标准方法(0.05mgN0.3gpro),消化用浓硫酸将蛋白质消化为硫酸铵；（耗时）蒸馏用碱性溶液碱化消化液并蒸馏挥发；吸收用酸性溶液（硼酸）吸收气态氨（使H+）滴定用已标定的无机酸滴（使H+恢复），计算总氮量定蛋白（总氮量-非蛋白氮）6.25=蛋白含量,纳氏试剂：碘化汞和碘化钾的碱性溶液与氨反应生成淡黄棕色胶态化合物，其色度与氨氮含量成正比。,原理：,.,56,评价：,优点：准确度高，精密度高，灵敏度高，是公认的参考方法。缺点：操作复杂，费时，不适合常规检测，血清各蛋白含氮量会有所变化尤其是疾病时。,应用：标准蛋白的标定及校正其它常规方法,.,57,2.双缩脲法,原理：,蛋白质中的肽键（-CONH-）在碱性溶液中能与Cu2+作用而产生紫红色络合物，其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质的分子量及氨基酸成分无关。,条件：至少含两个肽键（-CONH-）基团才能和Cu2+形成络合物,氨基酸及二肽无反应,三肽以上才能反应。,双缩脲生成,.,58,评价：,优点：简便，准确，重复性好，10g-120g/L线性好，特异性与精密度好，批内CV%2%，显色稳定。缺点：灵敏度较差，对蛋白质含量低的体液标本不适合。,应用：常规推荐方法。手工或上机使用。,.,59,3.酚试剂法,原理：,蛋白质分子中的酪氨酸残基和色氨酸残基能够和酚试剂中的磷钨酸-磷钼酸反应生成蓝色化合物，,Lowry改良法：在酚试剂中加入Cu2+（75%呈色），提高了呈色的灵敏度，为双缩脲法的100倍左右。,.,60,评价及应用：,优点：操作简单，改良法灵敏度高（10g-60g），适合测定蛋白含量少的标本。缺点：各种蛋白质酪氨酸和色氨酸比例不同，只适合测定单一蛋白质。受一些药物干扰。,.,61,4.比浊法,原理：,评价及应用：,优点：简便不需特殊仪器。缺点：浊度形成的干扰因素多（加试剂方法，反应温度，蛋白絮状沉淀等）,某些酸类（磺基水杨酸等）和血清蛋白质结合产生沉淀，测其浊度，与标准对比，可求蛋白含量。,.,62,5.染料结合法,在酸性环境下，带正电的蛋白质（-NH3+)与染料的阴离子产生颜色反应，使染料的吸收峰改变，可既而用分光光度法比色测定。,原理：,常用染料：氨基黑，考马斯亮蓝等,评价及应用：,优点：操作简便，重复性好，灵敏度高，且干扰因素少。缺点：特异性不高；不同蛋白质和染料的结合力不一致，标准物不易确定。,.,63,6.紫外分光光度法,蛋白质分子中的酪氨酸和色氨酸等芳香族氨基酸可使蛋白质溶液在280nm处有一吸收峰。可用于测定蛋白质但需避免核酸干扰。（1）Lowry-Kalcker公式蛋白质浓度（mg/ml）=1.45A280-0.74A260（2）Warburg-Christian公式蛋白质浓度（mg/ml）=1.55A280-0.76A260,原理：,.,64,评价及应用：,优点：敏感而简便，可保留蛋白生物活性，常用与较纯的酶和免疫球蛋白。需紫外分光光度计及石英比色皿。缺点：各种蛋白质中芳香族氨基酸含量和比例不同；在280nm测定易受游离色aa和酪aa以及尿酸和胆红素的干扰；导致准确性和特异性受影响。措施：在220-225nm波长区域，用0.15mol/l的NaCl稀释1000-2000倍可消除干扰。,.,65,7.折光测定法,溶解在溶液中的固体可增加溶液的光折射率，在固定波长和温度下，光折射率和血清中蛋白质含量成正比。,原理：,评价及应用：,优点：简便、快速，易掌握，重复性较好，适合临床急诊，体检筛查和胸腹水蛋白质测定。缺点：准确性较差，易受高血脂症，高胆红素血症以及溶血等因素影响，会由于A/G比值变化而产生误差。,.,66,参考范围：成人6080g/L,临床意义：,总蛋白升高：,总蛋白降低：丢失过多消耗增加白蛋白合成减少水肿,真性升高：MM、巨球蛋白血症、自身免疫性疾病等,假性升高：机体明显失水，总蛋白含量相对升高，A/G几乎不变,.,67,二、血清白蛋白测定,方法：,1.染料结合法(推荐)2.盐析法3.电泳法4.免疫化学法,.,68,1.染料结合法(推荐),原理:血清ALB可通过离子键或疏水键与包括染料在内的各种有机离子结合,而GLB很少结合外源性染料,可在不分离ALB与GLB的情况下直接测定ALB。,染料,BCG,BCP,优点,缺点,易于和非人源性白蛋白结合与白蛋白结合特异性较差,与非人源性白蛋白结合力弱与白蛋白结合特异性好,在30秒内测可提高特异性,.,69,应用及评价:,严格控制反应时间的BCG法既适合手工也适合自动化分析。临床上推荐使用。,.,70,原理:盐析是由于加入大量的中性盐破坏了蛋白质的水化膜、中和其所带的电荷从而使蛋白质分子聚集而沉淀析出。各种蛋白质的亲水性和带电荷不同，故盐析时所需盐浓度与pH不同。GLB在生理pH下带电荷及水化膜比ALB少，可被较低浓度中性盐沉淀。,2.盐析法,中性盐：硫酸铵、硫酸钠等,.,71,应用及评价:,操作繁琐，不宜自动化，基本不用,.,72,3.电泳法,操作：,醋纤膜电泳,染色,晾干,透明,光密度仪扫描,洗脱,比色,染色,分离,测得蛋白组分百分比,计算得出各种蛋白质含量,半定量,定量,.,73,评价及应用：,优点：电泳特异性好，可了解血清蛋白质全貌,缺点：电泳技术繁琐，不易自动化；白蛋白与染料亲和力高会导致结果偏高,.,74,4.免疫化学法,原理及特点:,应用：特异性高,但成本较高,费时,生化检验用的不多.,.,75,参考范围:成人3555g/L.,临床意义：,白蛋白升高：,白蛋白降低：丢失过多消耗增加白蛋白合成减少水肿先天性ALB缺乏病,真性升高：未见,假性升高：机体明显失水，或治疗输入过多白蛋白,.,76,三、血清球蛋白测定,方法：,间接法:TP-ALB=GLB,直接法:乙醛酸比色法(GLB中的色氨酸远大于ALB中的色氨酸含量),色氨酸+乙醛酸紫色化合物,H+,Hopkins-Cole反应:,参考范围:成人2030g/L.A/G：1.52.5A/G1,比例倒置，清蛋白降低亦可因球蛋白增高引起，见于严重肝功能损伤及M蛋白血症，如慢性重度以上持续性肝炎、肝硬化、原发性肝癌、多发性骨髓瘤、原发性巨球蛋白血症等。,.,77,临床意义：,球蛋白升高：,球蛋白降低：合成减少、低或无-球蛋白血症,真性升高（常见）：自身免疫性疾病、感染反应、MM、巨球蛋白血症。,假性升高（少见）：机体明显失水。,.,78,四、血浆纤维蛋白原测定,血浆纤维蛋白原：,结构特点：凝血因子，肝合成，MW=3.4万，大分子糖蛋白，pI5.3，22