DNA测序技术及展望.ppt

杨倩倩生命科学学院Telmail:yqq,DNA测序技术,第一代测序技术,第二代测序技术,第三代测序技术,DNA测序技术的展望,第一代测序技术,DNA测序即核酸DNA分子一级结构的测定，是现代分子生物学一项重要的技术。,DNA序列测定的意义,生命的奥秘蕴藏于“四字天书”之中,GCTTCTTCCTCATTTTCTCTTGCCGCCACCATGCCGCCACCATCATTTTCTCTTGCCGCCACCATGCTTCTTCCTCATTTTCTCTCCACCATGCCGCCACCACGCCACCATGCTTCTTCCTCATCTCGCTTTCTTGCCGCCACCATGCCGCCACCGCTTCTTCCtTCTCT,第一代DNA测序技术：传统的化学降解法、双脱氧链终止法以及在它们的基础上发展来的各种DNA测序技术。,1963年，Sanger等人第一次完成胰岛素51个氨基酸序列测定70年代后期，Sanger和Maxam-Gilbert等人又建立了Sanger双脱氧链终止法和Maxam-Gilbert化学裂解法第一代DNA测序技术包括：化学降解法、双脱氧链终止法、荧光自动测序技术和杂交测序技术。,1.1化学降解法,基本原理:利用特异的选择性试剂，专一性的随机断裂DNA成不同长短的片段。根据试剂的选择性及片段在高分辨力的聚丙烯酰胺凝胶电泳上的区带位置，判断DNA片段末端核苷酸的种类，从而测出DNA的序列。,将双链DNA样品变为单链每个单链的同一方向末端都用放射性同位素标记,以便显示DNA条带分别用不同方法处理,获得只差一个核苷酸的降解DNA群体电泳，读取DNA的核苷酸顺序,技术路线,Maxam-Gilbert法所用的化学技术,化学降解法刚问世时，准确性较好，也容易为普通研究人员所掌握，因此用得较多。优点：即所测序列来自原DNA分子而不是酶促合成产生的拷贝，排除了合成时造成的错误。缺点：操作过程较麻烦，且用到放射性物质，逐渐被简便快速的Sanger法所代替。,1.2双脱氧链终止法,利用DNA聚合酶和双脱氧链终止物测定DNA核苷酸顺序的方法，是由英国剑桥分子生物学实验室的生物化学家F.Sanger等人于1977年发明的。,F.Sanger（1980年诺贝尔奖获得者）,dideoxychain-terminationmethod,“双脱氧末端终止”的含义,PCR（聚合酶链式反应）原理,反应所需物质：DNA模板、引物、DNA聚合酶、dNTP、缓冲液每个循环包括：变性（90）、退火（54）、延伸（72）,双脱氧链终止法基本原理：DNA聚合酶不能够区分dNTP和ddNTP，ddNTP参入到寡核苷酸链的3-末端，终止DNA链的增长。合成的互补链在不同位置随机终止反应，产生只差一个核苷酸的DNA分子，读取待测DNA的顺序。,Sanger双脱氧末端终止法测序原理,dNTP,反应混合物,Klenow酶,未知序列的单链DNA,CTGACTTCGACAAAGAA,5,3,Sanger法因操作简便，得到广泛的应用。后来在此基础上发展出多种DNA测序技术，其中最重要的是荧光自动测序技术。,荧光自动化测序基本原理：,与链终止法测序原理相同用不同荧光色彩标记ddNTPddATP标记红色荧光ddTTP标记绿色荧光ddCTP标记蓝色荧光ddGTP标记黄色荧光每种ddNTP带有各自特定的荧光颜色,简化为由1个泳道同时判读4种碱基,目前所用自动测序技术的改进同位素标记到荧光标记,平板电泳到毛细管电泳,多色荧光标记毛细管电泳,单色荧光标记平板电泳,同位素标记平板电泳,A,C,G,T,测序图谱,TATTGCATTGTCTGCATTGTCT,DNA测序仪示意图,computeranalysis,凝胶中DNA移动方向,样品槽,激光器,输入光学系统,成象透镜,聚焦透镜,高灵敏度相机,旋光镜/棱镜组件,DNA自动测序结果举例,目前商品化生产的最先进测序仪为ABI3730测序仪，最长可以测1200个碱基,目前所用测序技术的缺点,1、DNA链终止法决定了一个反应所测序列不能太长，目前1000bp左右。2、测序反应费时费力第一个人类基因组测序花了13年的时间，耗费了30亿美元的费用。3、测序准确度不高DNA聚合酶造成的碱基错配，DNA序列判读错误。4、测序基于PCR反应，需要引物，有些些结构复杂的难于进行PCR反应的片段不能测序。,1.3Sanger测序中常遇到的问题分析,通过几十年的逐步改进,第1代测序仪的读长可以超过1000bp,原始数据的准确率可以高达99.999%,测定每千碱基序列的成本是0.5美元,每天的数据通量可以达到600000碱基。,第二代测序技术,第一代测序技术在分子生物学研究中发挥过重要的作用，如人类基因组计划(HGP)主要基于第一代DNA测序技术。,随着人类基因组计划的完成，人们进入了后基因组时代，即功能基因组时代，传统的测序方法已经不能满足深度测序和重复测序等大规模基因组测序的需求，这促使了新一代DNA测序技术的诞生。新一代测序技术即第二代测序技术。,测序设备发展现状,第一代（稳定需求）ABi3130 xL3730 xL3500 xL,第三代HelicosBiosciencesHelicosGeneticAnalysisSystemPacificBiosciencesRSSystem,第二代（高速发展）RocheGenomeSequencerFLXSystemGSJuniorSystemIlluminaGenomeAnalyzerIIxMiSeqHiSeq1000HiSeq2000LifeTechnologies(ABi)5500SOLiDSystem5500 xLSOLiDSystemIonTorrentPGMDanaherMotionPolonatorG.007CompleteGenomics无锡艾吉因生物信息技术有限公司AG-100深圳华因康基因科技有限公司Pstar-1中科院北京基因组所/半导体所BIGIS-1BIGIS-4,测序设备的垄断和高速度换代,第二代测序技术将片段化的基因组DNA两侧连上接头，随后用不同的方法产生几百万个空间固定的PCR克隆阵列。每个克隆由单个文库片段的多个拷贝组成，然后进行引物杂交和酶延伸反应。所有克隆在同一平面上，反应大规模平行进行，每个延伸反应所掺入的荧光标记的成像检测也能同时进行，从而获得测序数据。DNA序列延伸和成像检测不断重复，最后经计算机分析获得完整的DNA序列。,第二代测序技术的特点,高通量准确度高成本低覆盖度高产出巨大,第二代DNA测序技术平台,Roche,454GSFLXIllumina,SolexaGenomeAnalyzer/Hiseq2000ABI,SOLiD,Next-generationsequencingtechnology,2005,2006,2007,Birthday,Principle,焦磷酸测序Pyrosequencing,合成法Sequencing-by-Synthesis,连接法Sequencing-by-Ligation,2.1454测序技术,原理：在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和双磷酸酶的作用下，将每一个dNTP的聚合与一次化学发光信号的释放偶联起来，通过检测化学发光信号的有无和强度，达到实时检测DNA序列的目的。,454流程,1、文库制备：基因组DNA/cDNA片段化处理至300-800bp，经末端修复与特异性接头连接等修饰后变性处理回收单链的DNA。,2、EmulsionPCR：单链DNA文库被固定在DNA捕获磁珠上，乳化，形成油包水的混合物，每个独特的片断在自己的微反应器里进行独立的扩增，回收纯化,3、测序反应：携带DNA片段的磁珠被放入PTP板中供测序反应使用。,4、数据分析：GSFLX系统在10小时的运行当中可获得100余万个读长，读取超过4-6亿个碱基信息,454技术的主要缺点是无法准确测量同聚物的长度。例如当待测序列中出现Poly(A)时，测序反应中会一次多加上一个T，而加入T的数目只能从荧光信号的强度来推测，有可能造成结果不准确。因而，454技术主要的错误不是来自核苷酸的替换，而是来自插入或缺失。454技术最大的优势在于较长的读取长度，使得后继的序列拼接工作更加高效、准确。,454生命科学公司在2005年最早推出了第二代测序平台GenomeSequencer20，并测序了支原体Mycoplasmagenitalium的基因组；2007年推出性能更优的第二代基因组测序系统一GenomeSequencerFLXSystem(GSFLX)。罗氏在2005年便与454公司洽谈并购事宜，2007年完成并购，紧接着公布了DNA双螺旋的发现者之一沃森（JimWatson）的个人基因组，测序总花费不到一百万美元。,2.2Solexa-IlluminaGenomeAnalyzer,核心技术：“DNA簇”和“可逆性末端终止”。,原理：合成测序，将基因组DNA的随机片段附着到光学透明的玻璃表面（即Flowcell），这些DNA片段经过延伸和桥式扩增后，在Flowcell上形成了数以亿计Cluster，每个Cluster是具有数千份相同模板的单分子簇。利用带荧光基团的四种特殊脱氧核糖核苷酸，通过可逆性终止的“边合成边测序”技术对待测的模板DNA进行测序。,图2.Solexa测序技术流程,Solexa技术的需要的样品量低至100ng，文库构建过程简单，减少了样品分离和制备的时间，读取长度可以达到275bp。主要的错误来源是核苷酸的替换，而不是插入或缺失，目前它的错误率大约在1-1.5%之间。每个循环获得20.5-25Gb的测序结果，耗时约9.5天。在合成中每次只能添加一个dNTP，因此很好地解决了同聚物长度的准确测量问题。,SequencingbyOligonucleotideLigationandDetection基本原理：连接反应进行测序，以四色荧光标记的寡核苷酸进行多次连接合成，取代传统的聚合酶连接反应。步骤包括：,文库准备,扩增,微珠与玻片连接,连接测序,2.3SOLiD测序技术,图3.SOLiD测序技术流程,SOLiD流程,1、SOLiD基因组文库的构建,SOLiD流程,2、油包水PCR,SOLiD流程,3、含DNA模板P1磁珠的固定,SOLiD流程,4、SOLiD双碱基编码原理及测序流程,SOLiD流程,4、SOLiD双碱基编码原理及测序流程,SOLiD流程,5.数据分析原理,SOLiD流程,SOLiD技术与Solexa技术类似，后续的序列拼接工作也比较复杂。SOLiD技术每个循环的数据产出量为10-15Gb，耗时约为6-7天。SOLiD技术每个循环可以测两个上样玻片，读取长度可达250bp，而且由于采用两碱基测序，该技术的准确率能达到99.94%以上。,超高通量是SOLiD系统最突出的特点，目前SOLiD3单次运行可产生50GB的序列数据，相当于17倍人类基因组覆盖度。,第三代测序技术,第三代测序技术是以单分子测序为特点的测序技术。生物科学公司(BioScienceCorporation)的HeliScope单分子测序仪(HeliScopeSingleMolecularSequencer)太平洋生物科学公司(PacificBiosciences)的单分子实时DNA测序技术SingleMoleculeRealTime(SMRT)DNAsequencingtechnology牛津纳米孔技术公司(OxfordNanoporeTechnologiesLtd)的纳米孔单分子测序技术等。,目前,我国也启动了第三代测序技术的研究。2009年12月,中科院北京基因组研究所与浪潮成立“中科院北京基因组研究所浪潮基因组科学联合实验室”,利用各自的优势联合研发国产第三代测序仪,第一台样机预计2013年问世,届时有望缓解测序仪核心技术受制于国外公司的现状。,第二代的高通量测序技术已经得到了很好的发展和应用,但是由于其测序速度、成本、准确度等关键问题的解决仍存在困难,研究者们很快将目光转向了更高更新的测序解决方案。单分子测序也就应运而生。,第三代测序技术非常惊人！1、它实现了DNA聚合酶内在自身的反应速度，一秒可以测10个碱基，测序速度是化学法测序的2万倍。2、它实现了DNA聚合酶内在自身的processivity（延续性，也就是DNA聚合酶一次可以合成很长的片段），一个反应就可以测非常长的序列。二代测序现在可以测到上百个碱基，但是三代测序现在就可以测几千个碱基。这为基因组的重复序列的拼接提供了非常好的条件。3、它的精度非常高，达到99.9999%。4、可直接测RNA序列。5、可直接测甲基化的DNA序列。,2008年4月，HelicoBioScience公司的Timothy等人在Science上报道了他们开发的真正的单分子测序技术，对一个M13病毒基因组进行重测序，被称为真正的单分子测序，它跨过了前述3种高通量测序依赖的基于PCR扩增的信号放大过程，达到了读取单个荧光分子的能力。,斯坦福大学的科学家利用Heliscope单分子测序仪,用了48000美元的试剂和4个星期的时间，对一名白人男子的基因组进行了测序。测序的覆盖度达28倍，覆盖了90%的人类参考基因组。序列读长24-70bp,平均读长为32bp,并鉴定出280万个SNP位点和752个拷贝数变异。,3.1HeliScope单分子测序仪,Pacificbioscience在Science上报道了他们的基于SMART技术的单分子测序技术,该技术利用单分子技术和DNA聚合酶,在聚合反应的同时就可以读取测序产物,目前一期的读取速度为3bp/s,但他们声称在2013前实现三分钟读完人类基因组。Pacific技术目前在研究大肠杆菌基因组时的评价读长为586个碱基,