生物治疗及在临床肿瘤治疗中的应用

肿瘤生物治疗及在临床肿瘤治疗中的应用,夏建川,肿瘤生物治疗的概念,肿瘤生物治疗主要通过机体的免疫机制或生物制剂的作用以调节机体自身的生物学反应,从而达到治疗肿瘤的目的。它主要包括肿瘤的基因治疗、免疫治疗和免疫基因治疗。近年来，生物分子靶向药物也纳入生物治疗的范畴。随着分子生物学、肿瘤学和免疫学的发展，肿瘤的生物治疗已成为继手术、放疗、化疗后的第四种肿瘤治疗模式，在临床上已显示出良好的应用前景。,一、基因治疗,基因治疗（genetherapy）应用分子生物学的技术向有功能缺陷的细胞补充相应功能基因，以纠正或补偿其基因缺陷，从而达到治疗的目的。对象：体细胞生殖细胞,基因治疗被认为是多种重要疾病包括肿瘤治疗的希望所在,1990AshantideSilva，USA1999JesseGelsinger，USA2000AlainFischer，France2003AdrianThrasher，UK,JesseGelsinger，1999,AshantideSilva，1990,AlainFischer，2003,（一）基因治疗的曲折发展,2003AdrianThrasher,1990FreshAnderson,1969Conceptofgenetherapy,1999年美国Univ.ofPennsylvania一例患者在接受腺病毒介导的基因治疗过程中死亡。2002-2003年法国Necker-Enfants儿童医院11例SCID患者接受了逆转录病毒介导的基因治疗其中3例治愈后出现白血病样症状。,JesseGelsinger，1999,AshantideSilva，1990,AlainFischer，2003,基因治疗遭遇的挫折,Nature2003,January,421,305,NatureBiotechnology2003,Febuary,vol21,121,TheCauseofLeukemia:InsertionofactivatingretrovirusvectorinPro-oncogeneLOM2Locus.,EX1,Patient5Integration,Patient4Integration,MFGC,MFGC,EX2,EX6,LOM2,全世界基因治疗临床试验共1714项,USA,UA,Australia,Germany,（二）StrategyofGeneTherapy,Totransferarepairgeneintoapatient,theresearchersmustgothroughseveralsteps:Theymustisolatethedisease-relatedgene;Itmustbepackagedinavector,usuallyadisabledvirusthatcannotreproduceandcausedisease,butthatcanactlikeadeliverytrucktotransportthegeneinsidethepatientcells;Onceinsidethebodyscells,thenewgenecanbegintofunctionandrestorehealth.,基因治疗的必要条件,1、发病机制在DNA水平上已经清楚；2、要转移的基因已经克隆分离，其表达产物有详尽的了解；3、该基因正常表达的组织可在体外进行遗传操作理想的基因治疗还必须：1、外源基因可有效导入靶细胞2、外源基因能在靶细胞中长期稳定存留3、导入基因能适量表达4、导入基因的方法及载体对宿主细胞安全无害,腺病毒模式图,利用第2代腺病毒载体（E1区和部分E3区缺失，E2A部分修饰），将人内皮抑素基因（humanendostatingene）的表达盒，插入E1区，构建新型重组人内皮抑素腺病毒。,构建新型重组人内皮抑素腺病毒,FundamentalsofGeneTherapy,TheGeneTherapyofSevereCombineImmuneDeficiency（SCID）,（三）肿瘤基因治疗的研究策略,1、抗肿瘤细胞因子基因治疗通过将抗肿瘤细胞因子基因转入肿瘤细胞或机体特定细胞使其持续高效分泌这种细胞因子以达到杀瘤目的的疗法。（如肿瘤坏死因子）。2、修正肿瘤相关基因的功能1）恢复抑癌基因的功能最具代表性的肿瘤抑制基因为p53基因。现已有腺病毒载体携带的p53基因治疗。2）纠正癌基因的过度表达利用反义RNA、核酸或肽核酸等反义技术及RNA干涉技术等特异性地封闭基因表达的特性,抑制一些癌基因的过度表达,以达到治疗疾病的目的。如利用反义癌基因对恶性肿瘤的治疗。,3、自杀基因治疗：这类治疗方案的原理是将编码某种酶的基因（自杀基因）转染到肿瘤细胞中，这种酶能使某种药物转化为对细胞有害的物质，使肿瘤细胞DNA不能复制而死亡，这种药物对正常细胞无毒害作用。例如：5氟胞嘧啶系统。4、药物抗性基因转移治疗：增强肿瘤细胞药物敏感性和提高正常细胞对化疗药物的耐受性。给肿瘤细胞转入某些药物敏感基因可增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性；相反，耐药基因治疗则是对正常细胞进行修饰，使其具有比肿瘤细胞更强的对化疗药物的耐受力。,（四）基因治疗的载体,基因治疗载体可分两大类:病毒性载体和非病毒性载体。1、病毒性载体：逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、痘苗病毒、疱疹病毒等；2、非病毒载体：裸露、阳离子脂质体、包装颗粒等,NIH&FDA:AAVVectoristheMostSafeViralVectorforGeneTherapy,1.Non-pathogenic，2.Inhibitreplicationofpathogenicvirus，3.Inhibitoncogenesis,1、没有致病性,AAV是缺陷型病毒,只能潜伏感染,不能自主复制；2、可特异位点整合,AAV可特异整合于人19号染色体上,从而避免随机整合导致细胞突变的危险。而且染色体的整合可使转导的基因长期稳定表达；3、免疫源性弱,避免了病毒自身蛋白引起的免疫反应；4、感染的宿主细胞包括静止细胞和分裂细胞。AAV载体不能插入较大的外源基因，缺少高效的包装细胞，制备过程复杂，制备滴度低等缺陷。,病毒是一种可利用的基因治疗载体，它们对哺乳动物细胞的感染效率很高，能在靶细胞中高效表达目的基因。目前认为腺相关病毒(AAV)是人类基因治疗研究中最理想的病毒载体之一，它较其他病毒载体有如下的优点:,（五）肿瘤基因治疗的临床应用,肿瘤基因治疗的策略主要包括：抑癌基因替换治疗；抑制细胞表面生长因子受体基因治疗；抗血管生成基因治疗。其中，以p53抑癌基因替换治疗研究开展的临床试验最为广泛。目前发现多数恶性实体瘤含有p53的突变，临床上采用腺病毒转入野生型p53基因可在体内外抑制含有p53的突变癌细胞的生长，在此基础上研究者们开展了相关的临床试验。,1、重组人p53腺病毒注射液（今又生），是一种广谱抗癌药，用于治疗头颈部鳞癌等恶性肿瘤，是经国家药品食品监督管理局批准的世界首个基因治疗药物。2、安柯瑞（重组人5型腺病毒注射液）：它利用肿瘤细胞内P53基因及其通路的变异，能识别肿瘤细胞并将其杀死。适应症：晚期鼻咽癌。3、恩度(针剂)：重组人血管内皮抑制素注射液，作用机理是通过抑制形成血管的内皮细胞迁移来达到抑制肿瘤新生血管的生成，阻断了肿瘤细胞的营养供给，从而达到抑制肿瘤增殖或转移目的。,目前在我国已上市的肿瘤基因治疗药物,二、肿瘤免疫治疗,肿瘤的免疫治疗是以激发和增强机体的免疫功能或通过生物制剂的作用以调节机体自身的免疫反应,从而达到治疗肿瘤的目的。目前临床上有许多肿瘤免疫治疗的新观点，临床方法多种多样，一些临床结果令人振奋，尽管有许多问题仍有待解决，但是可以乐观的认为主动免疫治疗和过继性细胞免疫治疗将以一种更加有效的方式来对抗肿瘤。,（一）肿瘤免疫理论的建立,肿瘤免疫的概念起源于上世纪初。1909年Ehrlich首先提出，免疫系统不仅负责防御微生物侵犯，而且能从机体内清除改变了的宿主成分。并提出了细胞免疫直接对抗肿瘤的概念，此后人们认识到癌细胞是改变了的宿主成分。上个世纪末，感染性疾病病原的发现和接种疫苗可以诱导免疫系统产生对抗疾病的保护效应，对医学研究产生了深远的影响。正是以这些理论和原理为背景，产生了最初的理论，提出抗肿瘤保护性免疫反应的存在以及诱导和扩大这种反应的可能性。,六十年代经Thomas、Burnet和Good等人将该观点系统化，提出了免疫监视学说。免疫监视学说的中心思想是：免疫系统具有一个十分完备的监视功能，能准确地分辨“自己”和“非己”的成分；它不仅能清除外界侵入的各种微生物，排斥同种异体移植物，而且还能消灭机体内突变的细胞，防止肿瘤的生长，保护机体的健康。每当免疫监视功能由于这种或那种原因被消弱时，便为肿瘤的发生提供了有利条件；如果机体不具备免疫监视功能，人类的肿瘤发病率会大大的提高。,（二）肿瘤免疫治疗的方法,1、细胞因子疗法(IL-2,IFN-,IL-12,TNF-a)；2、生物分子靶向药物：1）美罗华注射液（利妥昔单抗注射液）利妥昔单抗是一种嵌合鼠/人的单克隆抗体，该抗体与细胞膜的CD20抗原结合。如与B细胞上的CD20抗原结合，可引发B细胞的溶解反应。适用于复发或化疗抵抗性B淋巴细胞型非何杰金氏淋巴瘤的病人。2）抗人细胞表皮生长因子的单克隆抗体（C225）西妥昔单体（cetuximab）为IgG1单克隆抗体，是表皮生长因子受体（EGFR）阻止剂，通过干扰肿瘤细胞表面的EGFR蛋白质的生长，达到抗肿瘤的目的。目前用于治疗晚期结肠癌。,3）抗血管内皮生长因子（VEGF）配体的单克隆抗体（Avastin）:研究发現VEGF在多种肿瘤，如脑瘤、肺癌、乳癌、消化道肿瘤及泌尿道肿瘤等均有过度表达。Avastin通过抑制VEGF的生物学活性，减少肿瘤新血管的形成，从而抑制肿瘤的生长和转移，适用于联合以5FU为基础的化疗方案一线治疗转移性结直肠癌。4）表皮生长因子受体（EGFR）酪氨酸激酶抑制剂（Iressa）；药名吉非替尼，是一种选择性表皮生长因子受体（EGFR）酪氨酸激酶抑制剂，该酶通常表达于上皮细胞来源的实体瘤。适合于接受化疗的局部晚期或转移性非小细胞肺癌。5）表皮生长因子受体（EGFR）抑制剂特罗凯（Tarceva）：它也是一种EGFR酪氨酸激酶结构磷酸化的阻断剂。研究显示，4085%的非小細胞肺癌患者的EGFR呈阳性，Tarceva的作用机理与Iressa相似，都是抑制在肿瘤细胞中过度表达的EGFR酪氨酸激酶結構的活性而达到治疗肿瘤的目的。,6）甲苯磺酸索拉非尼(sorafenib)，多吉美索拉非尼是首个口服多激酶抑制药,靶向作用于肿瘤细胞和肿瘤血管上的丝氨酸和(或)苏氨酸及受体酪氨酸激酶,阻断信号传导,抑制肿瘤生长。2005年底经FDA批准上市,用于进展性肾脏细胞癌和转移性或晚期肝细胞癌的治疗。7）苹果酸舒尼替尼（sunitinib，sutent），索坦/SUTENT舒尼替尼是一种能抑制多个受体酪氨酸激酶的小分子，其中某些受体酪氨酸激酶参与肿瘤生长、病理性血管形成和肿瘤转移的过程，美国FDA2006年1月批准舒尼替尼用于治疗胃肠道间质瘤(GIST)和不能手术的转移肾细胞癌（MRCC）。,3、肿瘤疫苗疗法,肿瘤疫苗治疗肿瘤是利用肿瘤细胞抗原或相应的核酸进行治疗肿瘤的方法。主要包括以下几种：（1）基因修饰的肿瘤疫苗；（2）热休克蛋白疫苗；（3）肿瘤抗原肽疫苗；（4）核酸疫苗；（5）树突状细胞（DC）疫苗（6）DC/肿瘤融合细胞疫苗；（7）CA125的抗独特型抗体ACA125疫苗；（8）预防宫颈癌发生的HPV疫苗。,树突状细胞（DC）源自骨髓中的前体细胞，是已知机体内抗原呈递能力最强的细胞，比普通抗原呈递细胞强1000倍，它能在机体内外捕获抗原后，将信息传递给T、B淋巴细胞，从而引发一系列的特异性免疫应答反应。但该种细胞在机体内含量极低，占正常人外周血白细胞的1左右。近年来，联合应用细胞因子体外培养大量DC获得成功，为其功能及分化状态的深入研究和在肿瘤生物治疗领域中的应用创造了条件。因具有长长的树突状突起和星状多形性而得名。,（1）树突状细胞疫苗,树突状细胞（DC）是功能最强的抗原递呈细胞，发挥重要的抗肿瘤功能,DC肿瘤抗原摄取诱导CTLs对肿瘤细胞特异杀伤,2010.4.29美国食品药品管理局批准Provenge(sipuleucel-T)，作为一种治疗晚期前列腺癌患者的免疫活性细胞，这标志着癌症进入一种新的治疗：自身免疫活性细胞治疗。利用前列腺癌组织中高表达的一种抗原，由DC负载这种抗原刺激自体的T淋巴细胞。将这些经体外刺激扩增的免疫活性细胞回输给前列腺癌患者达到治疗的目的。,DendriticCells,HighlyspecializedantigenpresentingcellsActivatenaveTcellsGeneratecell-mediatedimmuneresponse,ImmatureDendriticCell(Periphery),MatureDendriticCell(Lymphoid),人成熟DC的扫描电镜图,2011年诺贝尔生理学医学奖,BruceA.BeutlerJulesA.HoffmannRalphM.Steinman,2011年诺贝尔生理学或医学奖揭晓，美国、法国三位科学家因在免疫学方面的发现获奖。其中一半的奖金归于BruceA.Beutler和JulesA.Hoffmann，获奖理由是在“Toll样受体和先天免疫激活方面的发现”；另一半奖金归于RalphM.Steinman，获奖理由是“发现树突状细胞及其在获得性免疫中的作用”。美籍科学家比尤特勒和卢森堡籍科学家霍夫曼是因为发现“Toll样受体（Toll-likeReceptors，TLRs）及其配体”获得2011年诺贝尔生理学或医学奖,美国食品药品管理局已批准一种自体免疫活性细胞治疗前列腺癌的细胞类药,2010.4.29美国食品药品管理局批准Provenge(sipuleucel-T)，作为一种治疗晚期前列腺癌患者的免疫活性细胞，这标志着癌症进入一种新的治疗：自身免疫活性细胞治疗。Provenge诱导作用是通过抗原提呈细胞(APCs)负载前列腺癌酸性磷酸酶（PAP）抗原，继而激活肿瘤特异的CD8+T细胞，杀灭前列腺癌细胞。这是FDA批准的第一种自体细胞免疫疗法。,Provenge疫苗治疗方案,GM-CSF-PAP治疗机制,受试者：512名总体生存期：对照组21.7个月，治疗组25.8个月。3年存活率：治疗组32%，对照组只有23%。副作用：主要是发烧、发冷、疲劳和疼痛。,治疗结果,DC疫苗的制备,BMDC,GM-CSF,IL-4,TNF,成熟的DC,培养68days,TNF,IL-4GM-CSF,PBDC,加肿瘤抗原,人成熟DC表型的流式细胞检测（可见CD80,CD83，CD86高表达）,DC肿瘤疫苗制备流程,如何获得高纯度的肿瘤抗原？,国家发明专利-人肿瘤细胞的分离纯化方法,未纯化的人肺癌细胞,纯化后的肺癌细胞,从肺癌肿瘤患者胸腹水中分离肺癌细胞,贴壁生长的肺癌细胞,从手术后肾癌组织中分离纯化肾癌细胞,未纯化的人肾癌细胞,纯化后的肾癌细胞,贴壁生长的肾癌细胞,从术后卵巢癌组织中分离纯化卵巢癌细胞,未纯化的人卵巢癌细胞,纯化的人卵巢癌细胞,贴壁生长的卵巢癌细胞,树突状细胞疫苗在实体瘤治疗中的策略（1）,抽病人50ml-60ml外周血,分离单核细胞，体外诱导DC细胞,DC细胞负载自体肿瘤抗原，通过静脉回输给病人或经皮下注射,经肿瘤抗原负载DC细胞能刺激自体T细胞,产生强烈的抗肿瘤免疫应答。,树突状细胞疫苗在实体瘤治疗中的策略（2）,抽病人50ml-60ml外周血,分离单核细胞，体外诱导DC细胞,DC细胞负载自体肿瘤抗原并与自体的淋巴细胞混合，刺激自体T细胞产生细胞毒性T淋巴细胞,将这些细胞毒性T淋巴细胞通过静脉回输给病人,直接杀伤肿瘤肿瘤细胞,（2）树突状细胞与肿瘤细胞融合疫苗诱导机体产生主动抗肿瘤免疫,树突状细胞表达高水平的共刺激分子，能在体内外直接激活初始T细胞，调节免疫应答的起始，促进T辅助细胞和细胞毒性T淋巴细胞(CytotoxicalTlymphocyteCTL)的生成，也能促进B细胞生成抗体。近年来，随着对DC摄取、递呈抗原机理的不断认识,DC培养方法的不断成熟和完善，针对肿瘤的免疫原性弱的免疫特点而设计的DC/肿瘤融合细胞疫苗已成为该领域的热点之一。,肿瘤细胞表面抗原的多样性,肿瘤细胞模式图,肿瘤抗原免疫原性弱，难以激活有效的机体免疫,人乳腺癌细胞电镜扫描图,分化成熟的DC模式图,StrategyofFusion,DC与肿瘤细胞融合,自体DC/肿瘤融合细胞疫苗,原代肿瘤细胞,成熟DC细胞,自体DC/肿瘤融合细胞疫苗,PBMNC（50-60ml）,融合,TNF,IL-4GM-CSF,肿瘤细胞纯化技术,术后肿瘤组织,自体DC/肿瘤融合细胞疫苗治疗策略（1）,抽病人50ml-60ml外周血,分离单核细胞，体外诱导DC细胞,DC/融合细胞疫苗经皮下注射,DC/融合细胞疫苗能刺激自体T细胞,诱导产生的抗肿瘤免疫应答。,制备DC/肿瘤融合细胞疫苗,自体DC/肿瘤融合细胞疫苗治疗策略（2）,抽病人50ml-60ml外周血,分离单核细胞，体外诱导DC细胞,DC/肿瘤融合细胞与淋巴细胞混合，刺激产生细胞毒性T淋巴细胞,细胞毒性T淋巴细胞通过静脉回输给病人,直接杀伤肿瘤细胞,制备DC/肿瘤融合细胞疫苗,（1）抗原激活的杀伤细胞(TAK)；（2）肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL）；（3）细胞毒性T淋巴细胞(CTL)；（4）激活的杀伤性单核细胞(AKM)；（5）自然杀伤细胞(NK)；（6）细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)。,2、肿瘤过继性细胞免疫治疗向肿瘤患者输入具有抗肿瘤活性的免疫细胞，直接杀伤肿瘤或激发机体抗肿瘤免疫效应，从而达到治疗肿瘤的目的。主要包括以下几类：,过继性细胞免疫治疗的过程,（1）CIK细胞治疗肿瘤,“CIK细胞”是将人的外周血单个核细胞在体外用多种细胞因子（如抗CD3McAb,IL-2,IFN-,IL-1等）共同培养一段时间后获得的一群异质细胞，由于该种细胞同时表达CD3和CD56两种膜蛋白分子，故又被称为NK细胞样T淋巴细胞，兼具有T淋巴细胞强大的抗肿瘤活性和NK细胞的非MHC限制性杀瘤优点。目前，CIK细胞被认为是新一代抗肿瘤过继免疫治疗的方案之一.,自体CIK细胞的制备,PBMNC0.5-3107（50ml）,24个175cm的培养瓶,IFNIl-2CD3mAbIL1,12-14days11.51010,经淋巴细胞亚群检测，CIK细胞的中CD3CD56双阳性细胞的数量达到42.35%，,（2）自体DC细胞激活的CIK细胞治疗肿瘤,通过体外诱导有功能的自体DC细胞，将这种有功能的自体DC细胞激活自体CIK细胞，产生一种更强的抗肿瘤的效应细胞（DC-CIK细胞），从而发挥其抗肿瘤作用。实验证实，DC-CIK细胞能促进IL-12和INF-的分泌，提高细胞毒性，增强对肿瘤细胞的杀伤作用，,自体DC-CIK细胞的制备,CIK细胞,成熟DC细胞,DC细胞刺激的CIK细胞（11.51010）,PBMNC0.5-3107（50ml）,共培养,TNF,IL-4GM-CSF,IFNIl-2CD3mAbIL1,DC刺激的自体CIK细胞的表型,自体CIK、DC-CIK在恶性肿瘤治疗中的策略,抽肿瘤患者外周血（5060ml）,体外诱导CIK、DC-CIK细胞(1x1010以上),回输CIK、DC-细胞给患者(至少4次),杀伤残留的肿瘤细胞，抑制肿瘤的复发和转移,（3）自然杀伤细胞（NKcells）治疗肿瘤,NK细胞来源于造血细胞，其发育成熟依赖骨髓及胸腺微环境。具有抗细菌和病毒感染的作用，近来发现它们无需抗原预先作用，就可以直接杀伤肿瘤细胞。因此，在机体免疫监视和早期抗感染免疫过程中起重要作用。,自体自然杀伤细胞（NKcells）,PBMNC（30-40ml外周血）,12个175cm的培养瓶,诱导NK培养试剂IL-2,NK细胞数量可达23109,培养12-14天,