动物实验技术2.ppt

动物实验技术,动物的给药途径与方法,动物体液的采集,动物的安乐死,小鼠的解剖,动物的麻醉,第一节动物的麻醉方法,实验动物的麻醉就是用物理的或化学的方法，使动物全身或局部暂时痛觉消失或痛觉迟饨，以利于进行实验。,一、麻醉类型与麻醉方法,将挥发性麻醉剂或气体麻醉剂，由动物经呼吸道吸入体内从而产生麻醉效果的方法。吸入麻醉药物常见的有乙醚、安氟醚、三氟乙烷等。,吸入麻醉,非吸入麻醉,非吸入麻醉是一种既简单方便，又能使动物很快进入麻醉期，而无明显兴奋期的方法。常采用注射法，如静脉注射、肌肉注射、腹腔注射等。注射时一定要控制药物的浓度和注射量。给药几分钟后动物倒下，全身无力，肌张力逐渐减弱，反映消失，呼吸规律，表明已达到适宜的麻醉效果，是手术最佳时期。如果发现动物抽搐、排尿，说明麻醉过深，是死亡的前兆，应立即进行抢救。,麻醉前,全身麻醉注意事项,1.动物应禁食，大动物禁食10h12h。2.不能使用泻剂。因为泻剂可降低血液的碱储，从而增加血流和组织的酸度，在麻醉和失血状况下，易发生酸中毒，从而降低损伤组织的抗感染能力。3.检查麻醉剂质量、数量是否满足要求，麻醉固定器具是否有破损(漏气或堵塞)，对过深麻醉的急救器材、药品，也要准备齐全。4.准确计算麻醉剂量。由于动物存在个体差异，对药物的耐受性不同，体重与所需剂量并不成正比，所以介绍的剂量仅供参考使用。5.应考虑麻醉剂的纯度。麻醉剂的纯度直接影响麻醉效果，往往使用同种同剂量的麻醉剂，国产的产品麻醉效果往往不如进口的，实际使用中要注意增加剂量。,6.根据实验部位和种类，给动物脱毛。7.犬、猪、猴等大动物可在麻醉前给予一些药物以减少动物紧张，减少支气管分泌：阿托品：减少支气管和唾液腺分泌，防止气管阻塞。副作用：加快心率。用量：肌肉或皮下注射0.04mg/kg；安定：产生镇静作用，加强麻醉效果，使骨骼肌松弛。用量：2.5-5mg/kg；吗啡：产生镇静作用。副作用：抑制呼吸中枢。用量：皮下注射1-2mg/kg，肌肉注射10-20mg/kg.,静脉注射必须缓慢，同时观察肌肉紧张性、角膜反射和对皮肤疼痛的反应，当这些活动明显减弱或消失时，要立即停止注射，并进行抢救。,采取保温措施。在麻醉期间，动物的体温调节机能受到抑制，会出现体温下降，影响实验结果。必须保持动物气道的通畅和组织(眼球、舌、肠等器官)的营养。出现麻醉过深情况后，应立刻采取抢救措施。,麻醉时,麻醉后,局部麻醉,局部麻醉常用的方法是浸润麻醉。浸润麻醉是将麻醉药物注射于皮肤、肌下组织或手术野深部组织，以阻断用药局部的神经传导，使痛觉消失。,固定,皮内注射，打一皮丘,换局麻长针头，由皮点进针，放射到皮点周围、肌肉等都浸润到为止。,麻醉方法：,二、麻醉药物与麻醉剂用量,麻醉药物,挥发性麻醉剂,非挥发性麻醉剂,乙醚氟烷甲氧氟烷氯仿,全身麻醉剂,巴比妥类氯胺酮水合氯醛,局部麻醉剂,普鲁卡因利多卡因的卡因,乙醚：强挥发性、易燃。乙醚是最常用的吸入麻醉剂，各种动物适用。机制：抑制中枢神经系统。特点：安全范围大，肌肉完全松弛，对肝肾毒性小，麻醉诱导期和苏醒期较长。副作用：局部刺激大，引起上呼吸道黏膜分泌增加，导致呼吸道阻塞，可用阿托品对抗解救。,全麻药物,巴比妥类：种类很多，有巴比妥钠，戊巴比妥钠，硫喷妥钠，苯巴比妥钠等。适用于各种动物。机理：阻断神经冲动传递到大脑。特点：安全范围广，毒性小，麻醉潜伏期短，麻醉维持时间长。可腹腔或静脉给药。副作用：过量使用可导致呼吸肌麻痹而死亡，同时抑制末梢循环，导致血压降低，并影响基础代谢，导致体温降低。,氯胺酮：常用其盐酸盐。机制：阻断大脑联络途径。特点：麻醉潜伏期短，麻醉维持期仅10-20min，麻醉浅，安全性高，可重复给药。副作用：兴奋心血管系统，使血压升高，心率加快，偶尔引起呕吐。水合氯醛：作用特点和巴比妥类相似。但安全范围小，麻醉剂量和中毒剂量接近，对皮肤和黏膜有较强刺激。,不同动物的全身麻醉剂量与用法,麻醉深度的判断指标,普鲁卡因：是无刺激性的局麻药物。特点：麻醉速度快，注射后1-3分钟就可产生麻醉。可以维持30-45分钟。对皮肤和黏膜穿透力很弱，需要注射给药才能产生局麻效果。它可以使血管舒张，易被吸收入血液而失去效果。在其溶液中加入肾上腺素（每100ml加入0.1%肾上腺素0.2-0.5ml）可以使麻醉时间延长1-2小时。,局麻药物,利多卡因：效力和穿透力比普鲁卡因强两倍，用于表面、浸润、传导麻醉和硬脊膜外腔麻醉；的卡因：化学结构和普鲁卡因类似，局麻作用比普鲁卡因强10倍，吸收后的毒性作用也相应加强，是一种强效长时间作用的局麻药。,三、复苏与抢救,呼吸停止,心跳停止,主要表现是胸廓呼吸运动停止，粘膜发绀，角膜反射消失或极低，瞳孔散大等。可出现在麻醉的任何一期。,应用5%CO2和60%O2的混合气体间歇人工呼吸，同时注射温热葡萄糖溶液、呼吸兴奋药、心脏急救药。,心跳停止应迅速采取心脏按摩，即用掌心(小动物用指心)在心脏区有节奏地敲击胸壁，其频率相当于该动物正常心脏收缩次数。同时，注射心脏抢救药。,尼可刹米戊四氮美解眠,肾上腺素碳酸氢钠,呼吸和脉搏突然消失，粘膜发绀。心跳停止的到来可能无预兆。通常是由于剂量过大，手术后麻醉剂所致的心脏急性变性，心功能急剧衰竭所致。,症状,方法,药物,第二节动物的给药途径与方法,在动物实验过程中，应根据不同的实验目的、动物种类、药物类型来决定动物的给药途径与方法。,给药方法,注射法,投入法,给药途径,人与实验动物之间药物剂量的换算,人与实验动物对同一药物的耐受性，动物比人大，即单位体重的用药量比人要大。1.一般可按下列比例换算，每单位体重人的药量为1，则小鼠、大鼠为25-50，兔、豚鼠为15-20，狗、猫为5-10。,在新药药效研究中多以下列公式转换人及不同动物之间的药量：,人及不同实验动物之间药物量对应值,一、小鼠的给药途径和方法,1.灌胃（i.g.）,左手固定小鼠，腹部向上。右手持灌胃器，沿体壁用灌胃针测量口角至最后肋骨之间的长度，作为插入灌胃针的深度。然后经口角插入口腔，与食管成一直线，再将灌胃针沿上腭壁缓慢插入食管2cm3cm，通过食管的膈肌部位时略有抵抗感。如动物安静呼吸无异常，即可注入药液。如遇阻力应抽出灌胃针重新插入。,方法,一次灌注0.1mL/10g0.3mL/10g体重。,给药量,注意要点：动物要固定好；头部和颈部保持平展；进针方向正确；一定要沿着口角进针，再顺着食管方向插入胃内；决不可进针不顺就硬向里插，灌胃针可用12号注射针头自制，磨钝针尖再稍弯曲，即成灌胃针，针长5cm7cm，直径0.9cm1.5cm，连接于1mL2mL的注射器上即成灌胃器。,小鼠的灌胃方法,2.皮下注射(s.c),通常选用颈背部皮肤。操作时，先用酒精棉球消毒需注射部位的皮肤，再将皮肤提起，使注射针头与皮肤成一定角度刺入皮下。把针尖轻轻向左右摆动，容易摆动则表明已刺入皮下。然后轻轻抽吸，如无回流物就缓慢注射药物。注射完毕后，缓慢拔出注射针，稍微用手指压一下针刺部位，以防止药液外漏。由于小鼠习惯向前方移动，一手拉住鼠尾，将注射针刺入背部皮下，进行注射。用于大批量动物注射。小鼠皮下一次注射量为0.5mL/只1.0mL/只。,3.皮内注射(i.d)常用于观察皮肤血管的通透性变化及观察皮内反应，多用于接种、致敏实验等。皮内注射通常选用背部脊柱两侧的皮肤。先将注射部位及其周围的被毛剪去，酒精棉球消毒局部。然后用左手将皮肤捏成皱襞，右手持有5号针头的注射器，使针头与皮肤呈30角刺入皮下，然后将针头向上挑起并稍刺入，即可注射。注射后，可见皮肤表面鼓起一小丘。注射后5分钟再拔出针头、否则药液会从针孔漏出。通常小鼠皮内一次注射量不超过0.05mL。,小鼠的皮内注射,4.肌肉注射(i.m),因小鼠肌肉较少，一般不作肌肉注射。如实验必须作肌肉注射时，由助手抓住小鼠两耳和头部皮肤，并提起。操作者用左手抓住小鼠一侧后肢，右手取连有6号针头的注射器，将针头刺入大腿外侧肌肉，将药液注入。,小鼠一侧后肢的用药量不超过0.1mL。,5.腹腔注射(i.p),用左手拇指和食指抓住颈背侧的皮肤，手掌成杯状紧握鼠背使得腹部皮肤伸展，同时用小指压住尾根，固定好动物。使小鼠腹部抬高，右手将注射器针头(5号)刺入皮肤。距下腹部腹中线稍向左或右1mm的位置30进针。针头到达皮下后，继续向前进针3mm5mm，以45刺入腹肌，针尖通过腹肌后抵抗力消失。固定针尖，缓缓注入药液。为避免刺破内脏，可将动物头部放低，尾部提高，使脏器移向横膈处。小鼠的一次注射量为0.1mL/10g体重0.2mL/10g体重。,小鼠腹腔注射,6.静脉注射(i.v),小鼠一般采用尾静脉注射法。操作时，先将动物固定在固定器内或扣在烧杯中，使尾巴外露，尾部用4550的温水浸泡半分钟或用酒精擦拭使血管扩张，并可使表皮角质软化，然后将尾部向左或向右拧900，使一侧尾静脉朝上，以左手食指和中指捏住鼠尾上下，使静脉充盈，用无名指从下面托起尾巴，以拇指和小指夹住尾巴的末梢，右手持注射器(连5号细针头)，使针头与静脉平行(小于300)，从尾下四分之一处(约距尾尖2mm3mm)进针，刺入后先缓注少量药液，如无阻力，表示针头已进入静脉，可继续注入。一般推进速度为0.05mL/秒0.10mL/秒。一次注射量为0.05mL/10g体重0.25mL/10g体重。注射完毕后把尾巴向注射侧弯曲以止血。,小鼠的尾静脉注射,8.涂布给药,小鼠常采用浸尾方式经尾皮给药，用以定性地判定药物或毒物经皮肤的吸收作用。,9.呼吸道给药,呈粉尘、气体、蒸气或雾等状态存在的药物或毒气，均需通过呼吸道给药。,10.脚掌注射法,小鼠脚掌注射时一般取后脚掌，一次最大注射量为0.25mL。,7.脑内注射,常用于微生物学动物实验，将病原体等接种于被检动物脑内，观察接种后的各种变化。,二、大鼠的给药途径和方法,1.灌胃,一次灌胃量为12mL/100g体重。注意：抓牢动物后使其头部和颈部保持一直线；一定要沿着口角进针，再顺着食管方向插入胃内；决不可进针不顺就硬向里插，否则会造成功物死亡。,大鼠皮下注射时，通常选在左侧下腹部或后腿皮肤处。一次注射量不超过1mL/100g体重。,2.皮下注射,大鼠皮内注射通常选用背部脊柱两侧的皮肤。一次注射量为0.1mL。,3.皮内注射,肌肉注射一般选择股二头肌肉注射，但应避免伤及坐骨神经，否则会导致后肢瘫痪。大鼠一侧用药量不超过0.5mL。,4.肌肉注射,一次注射量为1mL/100g体重2mL/100g体重。,5.腹腔注射,6.静脉注射,7.脑内注射,8.涂布给药,9.呼吸道给药,10.鼻内给药,三、家兔的给药途径和方法,1.灌胃,一次的最大灌胃量为80mL/只150mL/只。,2.皮下注射,3.皮内注射,4.肌肉注射,5.腹腔注射,6.静脉注射,7.脑内注射,一次给药量为1.0mL/只3.0mL/只。,一次注射量约0.1mL。,一次注射量为0.2mL只0.3mL/只。一般注射量为0.5mL/只1.0mL/只。,家兔耳缘静脉注射,第三节动物血液的采集方法,采血部位不同,眼部采血,尾部采血,耳部采血,心脏采血,大血管采血,心脏采血,不同动物采血部位和采血量,采血量采血部位动物种类少量尾静脉大鼠、小鼠耳缘静脉兔、犬、猫、猪、山羊、绵羊眼底静脉丛兔、大鼠、小鼠舌下静脉犬腹壁静脉青蛙、蟾蜍冠、脚蹼皮下静脉鸡、鸭、鹅中量后肢外侧皮下小隐静脉犬、猴、猫前股内侧皮下头静脉犬、猴、猫耳中央动脉兔颈静脉犬、猫、兔心脏豚鼠、大鼠、小鼠断头大鼠、小鼠翼下静脉鸡、鸭、鸽、鹅颈动脉鸡、鸭、鸽、鹅大量股动脉、颈动脉犬、猴、猫、兔心脏犬、猴、猫、兔颈动脉、颈静脉马、牛、山羊、绵羊摘眼球眶动脉和静脉大鼠、小鼠,不同动物的最大安全采血量和最小致死采血量(mL),动物种类最大安全采血量最小致死采血量小鼠0.10.3大鼠1.02.0豚鼠5.010.0家兔10.040.0犬50.0300.0猴15.060.0,采血场所有充足的光线；室温夏季最好保持在2528，冬季2025为宜；采血用具和采血部位一般需进行消毒；若需抗凝血，应在注射器或试管内预先加入抗凝剂；所需采血量应控制在动物的最大安全采血量范围内。一次采血过多或连续多次采血都可能影响动物健康，甚至导致贫血或死亡，必须予以注意。,采血时应注意,一、眶静脉丛(窦)采血,小鼠为眶静脉窦，大鼠为眶静脉丛。若手法得当，体重20g30g小鼠每次可采血0.2ml0.3ml，体重200g300g大鼠每次可采0.4ml0.6ml。左右眼交替使用，反复采血。,大鼠眶静脉丛采血,（一）大鼠、小鼠血液的采集,二、眶动脉和眶静脉取血,常用摘眼球法取血，多用于小鼠，所采血液为眶动脉和眶静脉的混合血，当采血量时较大常用此法。可避免断头取血时因组织液混入所导致的溶血现象。一般可取约为小鼠体重4%5%的血液量，是一种较好的取血方法。但易导致动物死亡，只能一次采血，如需反复采血样时，则不能采用。,眶动脉和眶静脉取血,三、尾静脉采血,需少量血液时，常采用尾静脉采血，主要用于大、小鼠。,剪尾时首先把动物固定或麻醉后，露出尾巴，将尾巴置于4550热水中，浸泡数分钟，也可用酒精或二甲苯反复擦拭，使尾部血管扩张，擦干，剪去尾尖(小鼠约1mm2mm，大鼠5mm10mm)，血自尾尖流出，让血液滴入盛器或直接用吸管吸取。也可用试管等接住，自尾根部向尾尖按摩，血液会自尾尖流入试管。切开尾静脉法时，可用锐利刀片切开尾静脉一段，用试管等接住血液。每次可取血0.2ml0.3ml，切割后用棉球止血。该法用于大鼠较好，可在较长的时间间隔内连续采血，进行血常规检查。,剪尾或切开尾静脉,小鼠剪尾采血法,固定动物，消毒，擦干。在尾尖部向上数厘米处用拇指和食指抓住，对准尾静脉用注射针刺入后立即拔出。采血后用局部压迫、烧烙等方法进行止血。,针刺尾静脉,四、阴茎静脉采血,五、心脏采血,新生大鼠,成年大鼠,六、大血管采血,大、小鼠颈静脉采血,大、小鼠腋下动(静)脉采血,（二）、兔、豚鼠的血液采集方法,一、耳中央动脉采血法1.固定：负责固定的人从背面用左手固定其背部,用食指和中指夹住豚鼠的颈部，同时用右手的无名指和小指夹住右后腿,用食指和大拇指抓住右前腿；用同样的方法固定左前后腿。用左右手的中指压住肩胛骨处的脊柱,使豚鼠成为“万岁”的姿势,颈部不能活动。家兔的固定比较简单，固定好其一兔耳即可。2.用酒精棉球擦拭耳缘，使血管充盈，然后用消毒纱布擦干。3.在中央动脉末端，沿着与动脉平行的方向刺入动脉，刺入方向应朝向近心端。不要在近耳根部进针,因其耳根部组织较厚,血管游离，位置较深，不清晰，易刺透血管造成皮下出血。一般用6号针头采血。取血完毕后注意止血。此法一次可抽取lOml15ml。4.家兔外周血液循环对外界环境刺激极敏感，耳中央动脉易发生痉挛性收缩。因此，抽血前必须让兔耳充血，并赶在动脉扩张，而未发生痉挛性收缩前立即抽血。否则，会导致管壁变形,针头易刺破管壁，形成血肿。,兔耳中央动脉采血,二、耳缘静脉采血法：1.家兔用圆筒型固定器固定。豚鼠的固定方法如上。2.采血姿势与耳缘静脉注射给药相同。选静脉较粗、清晰的耳朵，拔去采血部位的被毛，消毒。为使血管扩张，可用手指轻弹或用二甲苯涂擦血管局部。用6号针头沿耳缘静脉远心端刺入血管。3.取血后，用棉球压迫止血。此法一次可采血5ml-10ml。,兔耳缘静脉采血,三、心脏采血家兔、豚鼠的心脏采血亦较常用。一般不需开胸,基本方法同小动物的心脏采血，且更易掌握。1.将兔仰卧固定,在左侧胸部心脏部位去毛，消毒。2.用左手触摸左侧第34肋间,选择心跳最明显处穿刺。一般由胸骨左缘外3mm处将注射针头插入第34肋间隙。当针头正确刺入心脏时，由于心搏的力量,血会自然进入注射器。3.抽血后拔出注射针，穿刺部位用消毒纱布盖好。经67天后,可以重复进行心脏采血。,兔的心脏采血,四、兔的颈动（静）脉采血1.用戊巴比妥纳将兔麻醉，仰卧位固定。2.以颈正中线为中心广泛剃毛，消毒。3.从距头颈交界处5cm6cm的部位剪开皮肤，暴露气管，即可看到平行于气管的白色迷走神经和红色的颈动脉，颈静脉位于外侧，呈深褐色。4.分离一段颈动脉或颈静脉（分离时注意不要损伤迷走神经和营养气管的小血管），结扎远心端，并在近心端放一缝线，在缝线处用动脉夹夹紧动脉。5.在结扎线和近心端缝线之间用眼科剪刀作T或V形剪口，并将尖端呈斜形的塑料导管经切口处向心脏方向插入1cm2cm。结扎近心端缝线，将血管与塑料管固定好，将塑料管的另一端放入采血的容器中。缓慢松开动脉夹,血液便会流出。,兔颈动脉采血,常用抗凝剂：肝素：抑制凝血酶活力，阻止血小板凝集。纯品肝素1mg125U，10U-20U抗1ml血凝集，但通常应用2-3倍剂量。用法：可配成1%肝素溶液，用时取0.1ml于试管内，100烘干，每管可抗凝5-10ml血。或用1%肝素溶液湿润采血注射器。肝素可改变蛋白质等电点，当用盐析法分离蛋白作分类测定时，不可用肝素抗凝。,枸橼酸钠：使凝血必需的钙离子失活。常用3-5%水溶液，碱性较强。草酸盐合剂：草酸铵1.2g，草酸钾0.8g，福尔马林1.0ml，加蒸馏水至100ml。使凝血必需的钙离子失活。每毫升血加草酸盐合剂0.1ml。氟化钠：每毫升血加6mg。,其他体液采集,1、胸水、腹水采集：穿刺。2、消化液采集：唾液，胃液，胰液，胆汁。3、精液采集：中、大动物用假阴道，小动物穿刺附睾来采集精液。4、脑脊液采集：手术或小脑延髓池抽取。5、骨髓采集：大动物活体穿刺，小动物处死后取股骨或胸骨骨髓。,6、尿液采集：代谢笼收集导尿管采集膀胱穿刺压迫排尿,第四节动物的安乐死方法,尽量减少动物的痛苦，避免动物产生惊恐、挣扎、喊叫；注意实验人员安全，使用挥发性麻醉剂时，务必远离火源；方法容易操作；不影响动物实验的结果；尽量缩短致死时间，即安乐死开始到动物意识消失的时间；判定安乐死时，不仅要看呼吸是否停止，而且要看神经反射、肌肉松弛等状况。,安乐死是动物实验中常用来处死实验动物的一种手段，是从人道主义和动物保护角度，在不影响