【毕业学位论文】阿特拉津高效降解菌及其降解酶粗酶液特性的研究硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 阿特拉津高效降解菌及其降解酶 粗酶液特性的研究 士研究生 ： 应 飞 指导教师 ： 谢 明 申请学位类别 ： 农学硕士 专 业： 农业昆虫与害虫防治 研究方向 ： 生物防治与生物降解 培养单位 ： 植物保护研究所 研究生院 提交日期 2007 年 6 月 s. 2007 摘 要 阿特拉 津是 均三氮 苯类 内吸传 导型 除草剂 ，广 泛用于 玉米 、高粱 、甘 蔗、果 园等 防除一 年 生禾本科 杂草 及阔叶 杂草 ，在农 业生 产中具 有重 要作用 。阿 特拉津 在全 世界大 面积 推广应 用 后 ， 其对农田 及地 下水的 污染 、对后 茬作 物的药 害、 对人类 潜在 的遗传 毒性 等问题 日益 突出。 为 了 利 用安全高 效的 生物降 解技 术控制 和消 除阿特 拉津 在农田 环境 中的残 留污 染，本 研究 分离、 筛 选 对 阿特拉津具有高效降解能力的菌株， 研究了降解菌及其降解酶特性， 为开发和应用酶制剂提供基础。本研究 结果 对控制 农田 污染， 促进 粮食安 全生 产，保 障人 类身体 健康 ，保护 生态 环境均 具 有 重 要意义。具体研究结果如下： 应用摇瓶驯化培养方法，从河北、山东等地农药厂排污口淤泥中分离得到 4 株对 阿特拉津有降解能力的细菌；比较菌株对阿特拉津的降解效率，从中筛选出 1 株 高效降解新菌株 运用形态与生理生化特征以及 16S 列分 析等方法对菌株 行鉴定。其形态及生理生 化特 征：革 兰氏 阴性菌 ，细 胞呈长 杆状 ，无芽 孢， 极生鞭 毛， 具有运 动性 ，氧化 酶 阳 性 ，接触酶 阳性 。该菌 株为 好氧、 氧化 型（非 发酵 型）细 菌， 能利用 葡萄 糖和乙 醇， 不能利 用 甲 醇 和乳酸， 可以利 用氨态氮和硝态氮化合物， 耐 受浓度为 ， 生长温 度耐受范围为 445。精氨酸 脱羧 酶阴性 ，鸟 氨酸脱 羧酶 阴性， 赖氨 酸脱羧 酶阴 性，枸 橼酸 盐阴性 ，硝 酸盐还 原 阴 性 ，尿酶阳性， 七叶灵 （苷） 水解酶阳性， 蛋白胨水 （靛基质试验） 阴性， O硝基苯 D 吡喃半乳糖苷酶（ 性，蔗糖水解 酶阳性，麦 芽糖水解酶 阳性，木糖 水解酶阳性 ，葡萄糖水 解酶阳性， 硫化氢阴性。 株的 16S 因序列与 粒申氏杆菌） 的同源性达到 99%，结合菌株的形态和生理生化特性，综合判定该菌株为 属种类在我国未见报道。 研究明确了颗粒申氏杆菌 株生长的基本规律和基本条件。颗粒申氏杆菌 株在牛 肉膏蛋白胨培养基上生长时， 06h 处于延迟生长期， 620h 以后进入稳定及衰亡期； 菌株 温度的适应范围较广， 在 4 45的条件下均能生长，最适生长温度为 30；菌 株适宜的 为 6 9 之间，最适 7；菌株生长对氧的需求量不高，菌体有高浓度发酵生产的潜力。 通过研究还明确了环境因子对 株降解效 率的影响。利用气相色谱监测底物（阿特拉津） 变化量， 阿特拉津底物浓度对降解率有显著影响， 当阿特拉津浓度较低时 （ 200） ，菌 株 3 天内即可将其完全降解（未检出，检测限为 l） ，随 阿特拉津浓度升高，其完全降解 的时 间也相 应明 显延长 。接 菌量对 降解 效率有 显著 影响， 随着 培养基 中接 种的菌 体 浓 度 的提高，阿特拉津的降解率也逐渐增加，在无机盐液体培养基中，当接菌浓度从 106108其相应的降解率从 高到 解率有显著影响，当7 时，菌株的降解效率较高（ 00%） ， 7 时或 时 ，降解率明显降低 （ 时， 降解效率为 时， 降 解率为 ， 降解最适 。温I 度对降解率的影响明显，菌株降解的最适温度为 2035 ，其降解率均大于 当温度小于20（ 或高于 35时（ ，菌株的降 解力均开始明显下降。 为了明 确菌 株降解 酶的 利用价 值， 本文研 究了 降解酶 粗酶 液的基 本特 性。通 过酶 定位实 验 ，明确了该菌株的阿特拉津降解酶位于细胞内，粗酶液与阿特拉津（底物浓度 50， 酸缓冲液体系 3 度 30） 作用 2h， 其对底物的去除率可达到 结果表明， 菌株 无底物诱导的牛肉膏蛋白胨培养基上连续转接培养 8 代后，该菌 对阿特拉 津的 降解能 力仍 保持在 较高 水平， 底物 诱导前 后该 菌对阿 特拉 津的降 解能 力无显 著 变 化 。温度对粗 酶 液降解活 性 的影响明 显 ，降解酶 适 宜的温度为 2535， 35时粗酶 液 对阿特拉 津 的降解率为 酶与底 物作用 ， 高温会使酶的降解活性骤然下降 （ 40酶对 底物的降解 率为 。 粗酶液降解活性的影响明显，当 为 5的活 性随 的升高而上升， 为 酶的活 性最高 （ 酶与底物作用时间 。 由此看 来， 该菌株产酶稳定（组成型酶） ，降解酶对温度、 适应范围较广，对底物的降解效率高，该降解酶具有较好的开发应用潜力。 关键词 ： 降 解菌，阿特拉津，生物降解，除草剂，生物修复 s of in it of of of is of of of In of a as of of of by on 000 as of in to 6s or in it is in pH in 0 as of to pH on of of 00% to of of ) a 00% of 109 000, 030, 80 r/ of pH 5 0 in pH As pH in pH 0. of to be in of in 目 录 第一章 绪论 . . 11 除草剂阿特拉津生物降解的研究进展1. . 解菌 株的分离、筛选及其降解效率1. . 解菌 的生长特性和营养需求1. . 特拉 津的微生物代谢途径1. . 特拉 津降解酶及其降解基因1. . 式菌 株 . 解菌 的生态学1. . 解菌 的应用及其效果评价1. . 究热 点分析及展望1. . 152 本研究的目的和意义1. . 153 本研究的主要内容及技术路线1. . 要研 究内容1. . 术路 线第二章 阿特拉津高效降解菌的分离与筛选 .料与方法 . 17 料与 仪器 . 17 壤中 降解菌的驯化与分离 . 18 效降 解菌的筛选 . 19 效降 解菌的降解动态 . 20 果与分析 . 20 机盐 培养基上降解菌的分离 . 20 肉膏 蛋白胨培养基上降解菌的分离 . 22 外分 光光度计定性分析体系 . 22 株降 解能力的定性分析 . 22 相色 谱定量分析体系 . 23 菌降 解能力的定量分析 . 25 株 阿特拉 津降解的动态 . 26 论与讨论 . 27 第三章 阿特拉津高效降解菌的鉴定 .料与方法 . 28 料与 仪器 . 28 态特 征鉴定 . 29 落培 养特征及生理生化特征鉴定 . 30 株 16S . 32 果与分析 . 35 态特 征 . 35 落培 养特征及生理生化特征 . 36 株 16S 析 . 38 论与讨论 . 43 第四章 菌株 长的基本条件 .料与方法 . 45 料与 仪器 . 45 株的 生长曲线测定 . 45 株生 长的温度测定 . 46 株生 长的 . 46 株生 长的通氧量测定 . 46 果与分析 . 46 落数 标准曲线 . 46 株的 生长曲线 . 46 株生 长的温度 . 47 株生 长的 . 48 株生 长的通氧量 . 49 论与讨论 . 49 第五章 环境条件对 株降解效率的影响 .料与方法 . 50 料与 仪器 . 50 落数 标准曲线 . 50 物浓 度对降解效率的影响 . 51 菌量 对降解效率的影响 . 51 . 51 度对 降解效率的影响 . 51 果与分析 . 51 落数 标准曲线 . 51 物阿 特拉津浓度对降解率的影响 . 52 菌量 对降解效率的影响 . 53 . 53 度对 降解效率的影响 . 54 论与讨论 . 55 第六章 株降解酶粗酶液的基本特性 .料与方法 . 56 料与 仪器 . 56 酶液 的制备 . 57 解酶 的定位 . 57 白含 量的测定 . 57 度对 酶促降解的影响 . 58 . 58 特拉 津降解酶的诱导性测定 . 59 V 果与分析 . 59 解酶 的定位 . 59 白含 量标准曲线 . 59 度对 酶促降解的影响 . 60 . 61 特拉 津降解酶的诱导性 . 61 论与讨论 . 62 第七章 全文结论与讨论 .考文献 .谢 .者简历 .I 英文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 461,3,5461,3,5基阿特拉津 4,6基 ,5461,3,5461,3,5异系数 磷检测器 t 顷 d 钟 克 g h 时 密度 R 关系数 升 L 菌落数 U 活性单位 第一章 绪论 第一章 绪 论 草剂阿特拉津生物降解的研究进展 阿特拉津 （ 学 名 称 2461,3,5分子式 ，又名莠去 津， 属均三 氮苯 类除草 剂， 广泛用 于玉 米地、 高粱 地、甘 蔗田 、果园 、苗 圃、林 地 防 除 一年生禾 本科 杂草， 对多 年生杂 草也 有一定 的抑 制作用 。阿 特拉津 可在 苗前或 苗后 使用， 但 其 在 土壤中的 残留 期较长 ，并 具有生 物活 性，容 易对 一些后 茬敏 感作物 ，如 小麦、 大豆 、水稻 等 产 生 药害；阿 特拉 津在土 壤中 水溶性 好， 易被雨 水、 灌溉水 淋溶 至深层 土壤 ，或是 随地 表水径 流 进 入 到河流、湖泊 ，造成地下 水和地表水 资源的污染 ，对人类健 康、野生动 物以及自然 环境构成 威胁（ et 2000； et 1999； 1993） 。阿特 拉津还可通过挥发和浮尘进入大气，并通过干沉降和湿沉降返回地面（ et 1990； et 1995） ，对生态 环境的影响具有全球性。 阿特拉津在 土壤中有较 长的持留期 。研究报道 ，当土壤中 可溶性阿特 拉津的含量 为 30时， 其在土壤中的半衰期为 15 100d（ et 1999） 。 在阿特拉津污染的水田时发现， 切断污染源 1 年后在农田灌溉水中仍能检测出阿特拉津的残留，在作物生长期内也可以检测出作物体内的 阿特 拉津残 留（ 王立仁 等， 2000） 。河北 宣化农 药厂 排污口 下游 的官厅 水库 及其下 游 永 定河中均检出阿特拉津及其代谢物 晋 等， 2002） 。 1992 年张家口 市洋河下游农灌区 因宣 化农药 厂排 放的废 水中 含有高 浓度 的阿特 拉津 和乙草 胺， 造成农 作物 大面积 死 亡 ， 其中水稻占 95%（李萃义 焦晓娟， 1996； 叶常明等 ， 1999） 。 1997 年 ， 因条 子河上游吉林省四平市四平联 合化 工厂生 产阿 特拉津 排放 的废水 ，辽 宁省铁 岭市 昌图县 发生 全国特 大水 田污染 事 故 ， 受污染面积达 公顷 （王立仁 等， 2000） 。 利用多介质环境模型对白洋淀地区的土壤、 地下水和玉米中 30 年阿特拉津的含量进行了预测，结果表明，在阿特拉津开始施用 10 年 后，在地下水中的浓度将超过美国环保局规定的 3 饮用水 标准； 5 年后在玉米籽粒中的含量将接近加拿大规定 最高允许 浓度（叶常明 等， 2000） 。 阿特拉津对人和动物有直接的不良影响。阿特拉津可使人体内 9 酶的活性 升高，干扰人体内分泌平衡 （ et 2000） ， 阿特拉津 可能对人体具有致癌性 （ et 1980） ，长期接触阿特拉津会导致乳腺癌和卵巢癌的发生（ 1992; 1999） 。美 国 阿特拉津列为可能的致癌物，并规定饮用水中阿特拉津的浓度不超过 3。阿特拉 津对人体淋巴细胞具有弱毒性， 但不会引起染色体畸变的反应 （ et 1998） ， 但在一些试验中阿特拉津也呈现出一定的遗传毒性（ et 1995）, 低 剂量（ g/）的阿特拉津具有内分泌干扰作用 ,是近期的发现， 最令人担忧， 已被列为环境荷尔蒙的可疑物质 （ et 2000; et 2000） 。在 水蚤 胚 胎 形成期 ， 低 浓度（ ）阿特拉 津 的暴露可 使 它的雄性 后 代的出生 率增加（ et 1999） 。 低剂量阿特拉津的长期暴露对非洲爪蟾性别的发育产生干扰 （ B et 2002） 。阿特拉津能抑制弹琴蛙（ 蚪红细胞生成，造成细胞供氧不足，1中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 能量利用率降低， 进一步抑制蝌蚪生长， 延迟发育， 而变 态时个体的大小会影响成体的捕食能力 ，可能通过此种途径引起此类种群的衰减 （苑宇哲 等， 2004） 。 阿特拉津 还能抑制小鼠 （ et 1999） 和鱼（ et 1991； et 1996）等水 生动物红细胞生成，降低血液的携氧能力。 阿特拉 津在 土壤和 水体 中阿特 拉津 的降解 主要 是由微 生物 来完成 的。 微生物 可利 用阿特 拉 津作为碳 源、 氮源， 使阿 特拉津 发生 脱烷基 、脱 甚 至 三 氮环开 裂， 释放出 生彻 底矿化降解（ et 1993; 1995; et 1995） 。生 物降解（ 术报 道始见于 20 世纪 80 年代 。 20 世纪 90 年代欧