【毕业学位论文】（Word原稿）微生物除草剂菌种的原生质体融合微生物学研究论文

密级 : 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 微生物除草剂菌种的原生质体融合研究 on on y I 摘 要 杂草化学防治是现代农业的发展标志，它节省劳动力、有利于机械化作业、是节本增效的最重要措施。但 农药污染是我国影响范围最大的一种有机污染，我国每年使用农药的面积在 公顷以上，每年使用的农药量在 50吨，其中除草剂年使用量为 吨。平均有 80%的农药直接进入环境，扩散到大气和土壤中，影响地下水和地表水水质。无论是出口农产品，还是国内需求的农产品，农药残留的门槛将愈来愈高，大幅度减少农药的使用是未来农业发展趋势。 发展微生物除草剂，实现杂草生物防治，可以大幅度降低化学除草剂的用量，为生态安全和粮食安全，以及有害生物的可持续控制作出贡献。 突脐蠕孢（ 弯孢 (中国水稻研究所从自然感病的稗草上分离得到的两株病原真菌，它们是稗草生物防治的潜力菌。 稗草致 病力强，但孢子产量低，而 子产量高，但对稗草的致病力弱。本研究根据这两个菌株的特性，采用灭活原生质体融合技术，对突脐蠕孢与弯孢进行原生质体的融合及融合子的筛选，目的是期望培育成功孢子产量高、代谢产毒能力强、适合工业化发酵的优良工程菌株。 论文获得以下主要研究结果： 1采用紫外线诱变处理 和 ，用含制霉菌素和放线菌酮的抗性培养基平板筛选获得具有抗生素抗性的突变菌株。 2确定了原生质体制备与融合的最佳条件： 静置培养 24h 和 静置培养 18h，培养菌丝体；用 2蜗牛酶 2%溶壁酶复合酶酶 解 4h，制备原生质体；选择再生培养基 高原生质体再生率；紫外照射 4活 ， 55水浴 5活 ， 40浓度、 件下促融。 成功获得 3 株融合子 3观察到 融合子在孢子形态和菌落形态上与亲株比较存在明显差异，融合子的生长速度和孢子产量等生物学特性介于两亲株之间。并 利用 法分析鉴定了融合子的 态性，初步鉴定出融合子 有双亲的 带特征。 融合子 稗草根长的抑制效果显著高于出发菌株 ，而与 的效果相当。 关键词 ：突脐蠕孢菌（ 弯孢菌（ 原生质体融合，稗草（ L.) , 生物防治 he of an to of as as of 0080 of 2580% on as as on No or is of of of in of to of of by of s EM to L to of to a M L as as to of of as 1. M L on M L to M L 4 h 8 h of % % 0 h, of e3 L M by 5 as as EG 0% at 1、 F2 c of of NA of of NA c of 2 L to M. L.) , 录 第一章 文献综述 . 1 生质体融合技术发展概况 . 1 生质体融合的程序与方法 . 2 生质体制备及再生 . 2 生质体融合方法 . 3 合子的选择及标记 . 4 生质体融合技术在新菌株培育中的应用 . 6 生物除稗剂的研究现状 . 7 外生物除稗剂的研究进展 . 7 内微生物除稗剂的研究进展 . 9 题意义与目的 . 10 第二章 材料与方法 . 11 料 . 11 种 . 11 养基 . 11 . 11 透压稳定剂 . 11 诱变剂 . 12 菌抗生素 . 12 融剂 . 12 脂 . 12 取试剂 . 12 泳缓冲液 . 12 泳载样缓冲液 . 13 B 染液 . 13 应试剂 . 13 器设备 . 13 法 . 14 性突变株的诱变及筛选 . 14 用双亲灭活的原生质体融合 . 14 用抗性标记进行原生质体的融合 . 16 用 子标记鉴定融合 菌株 . 16 融合子进行生物学检测 . 17 第三章 结果与分析 . 19 性突变株的诱变及筛选 . 19 最适紫外诱变剂量的确定 . 19 菌抗生素最小抑制浓度的确定 . 20 菌的紫外诱变及抗性突变株的筛选 . 21 用双亲灭活的原生质体融合 . 21 生质体的制备 . 21 生质体的再生 . 25 生质体的灭活 . 27 生质体融合和再生 . 28 用抗性突变株进行的原生质体融合 . 29 用 子标记鉴定融合菌株 . 29 合子和亲株的 提取和 应 . 29 对融合子进行生物学检测 . 31 落生长速度及形态 . 31 子形态和孢子产量比较 . 33 合子与亲株发酵液对稗草抑制率的比较 . 35 合子与亲株孢子悬液对稗草抑制率 . 35 第四章 讨论 . 38 第五章 结论 . 39 参考文献 . 40 致 谢 . 48 个人简介 . 49 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 1 第一章 文献综述 原生质体融合技术是指将亲株的细胞分别 脱壁形成原生质体，再施以物理、化学或生物手段将两种不同亲株的原生质体融合，使细胞内的遗传物质发生重组交换形成重组子的技术手段。它操作简便，克服传统育种细胞壁和交配系统对育种的障碍，实现种间、属间以至更远缘的杂交。 真菌是与人类关系密切的一类微生物 ,随着原生质体融合技术的不断完善和发展，其越来越多地应用于真菌的育种中。真菌原生质体融合主要集中于产抗生素菌类、酿造菌类、食用菌菌类及其它一些对人类生产生活有益的菌类。真菌原生质体融合最早起源于 1974 年， 等(974)以白地霉 （ 养缺陷突变株为材料成功获得融合子，随着生物学技术的不断完善和发展，原生质体融合技术在真菌育种中发挥了重要作用。 生质体融合技术发展概况 原生质体是保留完整细胞质膜而没有细胞壁的细胞，去壁不完全而带有部分细胞壁的细胞叫球状体。最初 ,人们得到原生质体是通过机械捣碎的方法 ,但由于该方法难以得到大量原生质体 ,因此实际应用较少。原生质体简便、快捷的制备方法得益于大量工业化酶的制备 ,酶解细胞壁可以大量获得原生质体 ,这是原生质体技术建立和发展的基础。 在 1859 年 究某些粘菌的生活史时，发现该菌能够从单核细胞融合产生多核核胞体（ 这是世界上第一次发现微生物细胞融合现象。细菌原生质体的自然形成和自发融合现象首次发现于 1925 年，开始人们猜测可能是染色标片上的赝象 ，在 1944 年用相差显微摄影的活体观察证实了融合事件，随后在拟杆菌属（ 通变形杆菌（ 及碳疽芽孢杆菌（ ，也分别用相差显微摄影证明了原生质体的形成及其自发融 合事件，之后在真菌的一些种中也发现了类似情况。 真菌自发融合主要有以下特点： 融合主要发生在原生质体形成期； 融合频率低，难以计算； 融合子双亲为野生型，具有各自的遗传背景； 到了 20 世纪 50 年代，人们开始关注原生质体技术， 1953 年 次利用融菌酶酶解制备了巨大芽孢菌的原生质体；受细菌原生质体融合的启发，到了 1957 年， 首次用蜗牛酶酶解制备了酵母菌的原生质体； 60 年代捷克的 西班牙的 个研究中心对原生质体技术做了大量基础性工作，前者主要应 用原生质体研究酵母细胞的生活史与细胞分裂，后者主要研究能够有效降解丝状真菌细胞壁的溶菌酶 (牛艳芳， 2004)。 人工诱导原生质体融合的工作最初起源于人工诱导无细胞壁动物细胞融合的尝试。在将动物细胞人工诱导融合成功之后五年左右，这一技术很快扩展到动物种间与属间细胞融合，并进行了某些基因在染色体上的粗定位，进而又扩展到目间细胞融合的成功。 1970 年植物原生质体融合首次获得成功。 1976 年 个研究小组也分别报道了细菌原生质体融合成功的事例。该技术在真菌方面的探索最早始于 1957 年 用蜗牛酶酶解酵母菌细胞壁制备原生质体，1974 年， 等以白地霉（ 养缺陷型突变株为材料，采用离中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 2 心方法进行原生质体融合，其融合率低于 10后，人们又利用一些化学试剂，如a(,进行融合，效果得到改进 。 1976 年 把用聚乙二醇（ 导植物原生质体融合的方法引入到真菌原生质体融合中来，使融合率达到 10量级。 导原生质体融合的成功， 推动了真菌原生质体融合的发展。 1979 年匈牙利的 et 1979）首先报道了融合育种提高青霉素产量，从而开创了原生质体融合在真菌育种中的应用。随后一些新的方法和技术不断在原生质体融合中引进。 生质体融合的程序与方法 真菌原生质体融合技术包括三个关键程序：（ 1）足够数量的原生质体的分离和再生。（ 2）诱导原生质体融合。（ 3）融合子的筛选。 生质体制备及再生 1）液体培养基悬浮培养菌丝； 2）取出一定量菌丝离心并用缓冲液洗涤菌丝； 3）加入酶液酶解； 4）用尼龙 膜过滤除去菌丝碎片； 5）离心收集原生质体并用高渗缓冲液洗涤； 6）用液体再生培养基悬浮原生质体； 7）将悬浮原生质体涂高渗再生平板。 真菌原生质体分离常用的酶包括纤维素酶（ 新生酶（ 34）、溶壁酶（ 蜗牛酶（ 崩溃酶（ ，酵母类常以蜗牛酶为主，再配合其它酶辅助组成混合酶。食用菌类不同种之间有差异（ 刘祖同， 2002），其它丝状真菌在制备原生质体过程中通常选取上述酶中的 2混合使用。酶的浓度通常在 W/V)。酶解温度范围控制在 25酶解时间在一定程度上取决于酶的浓度和菌丝生长状况，通常选取 酶液 一般保持在 个别情况下如林肯链霉菌的原生质体制备过程中采用 罗立新， 2004）。用 磷酸缓冲液配制合适 的酶液。酶液中需要添加渗透压稳定剂防止原生质体膜破裂。真菌原生质体制备过程中选取的常用为硫酸镁和氯化钾等，浓度。 真菌的菌龄在原生质体的分离和再生中也是重要影响因子，酵母菌龄选择在对数生长期，而丝状真菌的 菌龄则不易判断，可根据菌丝球大小、紧密程度、菌丝量来选择最佳生长时期，有的采用生长不同时期 来判断是否为最佳生长时期。一些物质可影响菌丝对酶的影响敏感程度，所以可以用来提高菌丝产原生质体的数量。如在丝状真菌酶液中加二硫苏糖醇（ 甘氨酸，在灵芝原生质体制备中加巯基乙醇，酵母类通常用巯基乙醇对酶解前的菌丝进行预处理。 原生质体再生是指酶解后形成的原生质体在适当的培养条件下重新生长细胞壁的过程，影响再生率的因素很多，包括菌龄、酶及酶解条件、渗透压稳定剂及再生培养基 ( 郝勃 ,1997;002)。真菌原生质体的再生率在 80%之间，不同属、种的真菌在不同的培养条件下再生率差别显著，而较高的再生率是原生质体融合成功的关键。 再生培养基是在菌丝体正常生长的培养基中添加营养因子和渗透压稳定剂。有液体再生培养基、固体再生培养基和半固体再生培养基。培养方法包括液体培养、固体培养和双层培养。双层培养通常是在培养皿下层铺固体培养基，上层铺原生质体和半固体培养基混合液。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 3 用于再生培养的渗透压稳定剂有 无机离子和蔗糖、山梨醇、甘露醇、肌醇和琥珀酸等有机物质，研 究发现 存在可以显著提高原生质体的再生率，对真菌采用蔗糖等有机物质的效果优于无机离子。一些促进细胞壁再生的物质如纤维二糖、菌丝壁的碎片也常作为辅助物质加入再生培养基中（ 2000）。 生质体融合方法 酶解后相邻的原生质体能发生自融合，这就给基因的交流提供了可能性。自融合的频率较低，大约在 10间，因此要通过生物、化学或物理的方法促使融合。原生质体融合方法有以下几种。 (1) 仙台病毒促融法 最早的人工促进融合的方法， 1960 年，日本学者冈 田善雄（ 察到仙台病毒（ 引起细胞融合的现象，并对影响融合的相关因子进行了详细研究。其它一些致癌、致病病毒如天花病毒、疱疹病毒等也都可以诱导细胞融合。但病毒诱导细胞融合存在病毒制备困难、操作复杂、灭活效价差异大等原因，影响了病毒作为诱导剂的发展。 (2)化学促融法 20 世纪 70 年代后，化学融合剂得到了广泛发展，主要包括盐类、葡萄糖、聚乙烯醇、合成磷脂、聚乙二醇（ 二甲基亚砜（ 。其中效果显著的是聚乙二醇（ ， 1974年，匈牙利科学家 先报道 使真菌融合，以后酵母、霉菌也相继成功取得融合子。这也是目前原生质体融合的主要方法 (et 001)。 (3)合法 是由 1974 年创立的 , 聚乙二醇 (一种多聚化合物 ,其相对分子量在 20000 之间 ,小分 子量的 大分子量的 融合效 率低 ,大 分子量的 造成较多的多体融 合 ,因 此融合用的 常选择分子量 1000 度则选择在 25% 导融合的机理尚不太清楚，初步认为 结合溶液中的水分子，使原生质体处在脱水状态并发生凝集，不同程度的凝集使得原生质体细胞膜与膜之间紧密结合并发生变形。相互紧密接触的大分子蛋白质与脂类发生移动和重排，导致细胞膜局部融合形成细胞质桥，随着融合区域的逐渐增大，最终两个原生质体融合（ 罗立新， 2004）。 处理方法有很多种 ,可以单层的覆盖在培养皿上处理 ,也可以悬浮在离心管中。处理时间通常在 10钟 ,取决于原生质体的浓度和 分子量大小。但是最初的 理后融合原生质体很难被培养液洗脱 ,后来经修改应用高浓度钙盐溶液和用高 的缓冲液稀释。 合的一般程序为： 1）将亲株原生质体以 1： 1 混合均匀； 2）用渗透压稳定剂洗脱混合液，离心得原生质体沉淀； 3）加入合适浓度及分子量的 液，在 25温 204）离心并用渗透压稳定剂洗涤； 5）用渗透压稳定剂悬浮原生质体并涂再生培养基平板（ 2002）。 除了 子量大小、纯度、使用浓度外， 度、 和一些辅助物质都能影响 在保护细胞的同时促进融合，用量在 10。 一般在 上，在融合 溶液中添加伴刀豆球蛋白（ 二甲基亚砜（ 胰蛋白酶等都能在一定程度上提高融合频率。陈五岭（陈五岭等， 1998）等证明了氦氖激光对原生质体融合有促进作用，此外中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 4 还有人证明螯合剂的存在也促进 原生质体的融合。 导原生质体融合的方法操作简便，不需要特殊仪器，不受亲本原生质体种类及大小的限制，因此在细胞融合中被广泛使用。其缺点是对原生质体有一定毒性，影响到原生质体的再生。 (四 ) 电融合法 20 世纪 80 年代，德国科学家 创立了电融合技术，以双相电泳和电子击穿细胞质膜的联合作用使得不同的细胞发生融合。 电融合的优点是省去融合后的洗涤过程， 且融合频率高，对细胞无毒害。然而 电融合小室限制了原生质体的数量 ,尽管可以用连续的小室来解决 ,但长时间的电脉冲的刺激会影响到原生质体再生形成菌落 （ et 1983） 。 电融合法在真菌中最早广泛应用于酵母类的原生质体融合。近些年来又逐渐用于曲霉和食用菌类。 1991 年 余柏松 （ 余柏松 等， 1991）通过 生米卡链霉菌原生质体电融合 得到融合子。 1991年 施晓明 、 刘祖同 进行了 黑曲霉 (生质体电 融合（ 施晓明 ， 1991） ， 1994年 余荔华 、 刘祖同 实验了 米曲霉与黑曲霉原生质体种间电融合 （ 余荔华 ， 1994） ， 1995 年 、 刘祖同 等对 食用菌灭活原生质体 进行 电融合 （ 曾 容 ,1995）。 邱景芸 等于 1995 年 进行了 凤尾菇和桃红平菇种间原生质体电融合 （ 邱景芸 ， 1995）。 合子的选择及标记 原生质体在人工诱导下发生了广泛的融合，在融合过程中，即包括了两种不同原生质体融合，也有同种原生质体的融合，还有一部分未融合的原生质体。同种原生质体融合的多核原生质体和未融合的原生质体是我们需要排除的干扰部分。 为了顺利筛选到融合子，需要对融合的亲本进行遗传标记。常用的亲本标记方法有自然性状标记、颜色标记、营养缺陷型标记、抗药性标记和单亲或双亲灭活标记。 (1) 自然性状标记 真菌不同种、属其外部形态有较大差异，如菌落颜色、孢子形状大小、孢子颜色、菌丝粗细等，如果两亲株在菌落形态上有显著差异的话，我们可以通过观察外部形态来初步判断融合子。程骥等（程骥等， 2003）在选择黑暗链霉菌与卡那链霉菌的融合子时，通过比较孢子颜色、孢子形状、孢子大小和菌落颜色判定三种 44 株融合子，通过发酵测定其生物效价均比亲株有所提高。食用菌 中也常将锁状联合作为标记选择融合子。 (2)营养缺陷型标记 营养缺陷型标记是较为常用而准确的标记方法。通过物理化学诱变的方法使原生质体丧失合成某种物质的能力，在基本培养基上不能生长。两亲本分别带有不同的营养缺陷型标记，仅当亲本发生融合互补时，融合子才能在基本培养基上正常生长。如翁艳军等（翁艳军等， 2003）在青霉素产生菌的原生质体融合中采用营养缺陷型标记，取两亲本孢子悬液在 管下照射，影印法筛选营养缺陷型菌株，再通过生长谱测定法测出缺陷型菌株，其中一株为 另一株为过 合后，在基本培养基上筛选最终得到生物效价高的融合菌株。 营养缺陷型标记缺点在于进行诱变筛选常常使一些优良性状丢失和目标产物生成量下降，再生率也有所降低，且存在回复突变现象。 (3) 抗药性标记 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 5 抗药性标记是利用亲本细胞对某种药物的敏感性差异的一种筛选融合子的方法。 1984 年， 用抗药性标记对融合子进行选择，他们通过诱变得到 啶黄抗性， 啶黄敏感两株亲本，融合处理后在含有吖啶黄的基本培养基上选择融 合子。徐京宁也通过抗药性标记进行了林可链霉菌原生质体的融合。抗药性标记需要掌握药物的合理浓度，浓度过高会使融合频率降低，浓度过低则会使亲本生长影响融合子的检出（章文贤 ,2001;曹军 ,2001;罗立新， 2004）。 (4)荧光染色标记 荧光染色标记是利用一些荧光染料直接对原生质体进行标记。荧光染料是一类含有苯环的化合物，它们能够进入活体细胞和蛋白质或 合，在不同波长的激发光源下呈现不同颜色，通过荧光显微镜观察到细胞呈现不同颜色。荧光素类如 异硫氰酸荧光素 ( 488氩离子激光激发能产生绿色 的发射光，是微生物融合中常用的荧光染料。此外也有若丹明类荧光染料。 燕克勤 等（ 燕克勤 等， 1997）在紫孢侧耳与糙皮侧耳的原生质体融合中，采用 异硫氰酸荧光素 (记的紫孢侧耳单核原生质体与未标记的糙皮侧耳单核原生质体经 在倒置显微镜下 ,用显微操纵仪直接吸取一方带有荧光另一方不带荧光的原生质体对 ,经培养后 ,根据 “ 锁状联合 ” 这一形态特征挑选出融合子 ,融合率为 0 外，在金针菇、香菇的原生质体融合中也都有使用荧光染色（ 成亚利等， 1997）。 绿色荧光蛋白（ （ 2002）是一种能产生绿色荧光的蛋白质，人们通过转基因的方法使其在细胞中表达，从而使细胞呈现绿色荧光，因此它可以用来标记细胞融合， (999)于 1999 年将其应用到柑橘类植物细胞的融合中。 (5)灭活标记 灭活标记是通过物理、化学方法使原生质体存活率降低，如使用 射，高温处理，化学试剂碘乙酰胺处理。原生质体经过处理后其细胞内某些成分被破坏，或重要代谢途径被抑制阻断，从而不能在再生培养基上正常生长。人们通常 认为射线有破坏细胞核的作用，而温度可以使核糖体 16S 小亚基受损，碘乙酰胺处理则抑制巯基酶的活性（ 岑沛霖， 2001）。 单株亲本灭活后与未灭活的亲本发生融合，通过遗传重组使受损部位得到恢复，再同其它标记结合起来就能方便筛选融合子。王澄澈等（王澄澈等， 2000）利用香菇双核野生型菌株经 60高温灭活原生质体 ,与 理筛选到脯氨酸营养缺陷型凤尾菇单核体菌株 ,通过 学融合的方法筛选到不同的融合子 ,经传代培养得到综合两亲本特性的子实体。 对两亲本分别采用不同的灭活方法灭活，由于所破坏的部位不同，因此融合子通过 互补作用能恢复生长。 李祥锴 等（ 李祥锴 等， 2001） 分别以紫外线、热灭活林肯链霉菌 947 和 9502 原生质体 ,然后进行灭活双亲的原生质体融合 ,从 16 株融合子筛选到林肯霉素高产株。 孙剑秋等（孙剑秋等， 2002）以紫杉醇产生菌树状多节孢的诱发突变株 出发菌株 ,4热灭活 5分钟 ,05S,灭活双亲经 融合频率达到 10选得到融合株 (6) 分子标记 不同种类细胞含有的蛋白质、 有特异性，这些特异性的分子就可以作为菌株的分子标记，利用这些特异性分子标记来检测融合子。常用的分子标记有同工酶标记， 记， 记等。王淑珍等（王淑珍等， 2003）利用 记对灵芝和糙皮侧耳原生质体融中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 6 合子基因组进行了分析，证明两亲本的核物质在融和子中发生了重组，而融合子在 平上更接近于灵芝。分子标记能够对融合子进行精细准确的鉴定分析，并可以验证其它标记筛选的结果，越来越多地被人们所采用。 生质体融合技术在新菌株培育中的应用 原生质体融合技术作为一种相对独 立的生物工程技术，是其它生物工程技术不可替代的。因为用常规的物理化学诱变方法进行育种时，虽然能够使微生物发生突变，偶尔可以筛选到个别正突变的菌株，但当菌株的性状达到一定水平之后，再重复使用常规的诱变育种就会受到极大的限制，而使用基因工程进行育种往往要求较高的设备条件，难以广泛开展。因此原生质体融合技术在基因工程育种中占有不可替代的地位，被广泛应用于真菌、细菌、以及植物的选育中。 （ 1）抗生素高产菌株的选育 利用原生质体融合技术不但可以用于提高抗生素的产量，同时可以用于融合子产生新的抗生素研究，特别是在链霉菌 育种中（ 2001）。贺敏霞等（贺敏霞等， 1989）通过诺卡氏菌原生质体融合重组研究发现 3 株融合子产生亲株没有的抗生物质，还得到 1 株甾体转化活力明显高于亲株的融合子。林容团等（林容团等， 1990）以天然无抗菌活性的变青链霉素菌 1326 与链霉菌 1254 营养缺陷型突变株进行种间原生质体融合，筛选得到 5 株抗菌活性较稳定的融合菌株。曾红梅等（曾红梅 1995）通过原生质体融合的方法提高了农抗武夷菌素的效价。陈五岭等 (陈五岭等 ,1998)通过比较 光和聚乙二醇（ 红霉素链霉菌 (龟 裂链霉菌（ 活原生质体的诱导融合，筛选得到几株红霉素产量明显高于亲株的融合子。王金盛等 (王金盛， 1999)以小诺霉素（ 生菌棘胞小单胞菌（ 出发菌株，通过单亲灭活原生质体融合，链霉素产量为筛选条件选出融合株，得到 量高于亲株的融合子。 （ 2）酵母菌工程菌构建 庞小燕等 (庞小燕 ,2001)以酒精酵母和热带假丝酵母为亲株，通过原生质体融合技术获得了即具有糖化酶活性又能高产酒精的稳定的酵母融合株。高玉荣（高玉荣， 2001）利用发酵能力强的葡萄酒酵母和降酸能力强、发酵性能好的粟酒裂殖酵母进行融合，获得稳定性强融合子，用原生质体融合技术培养选育出的优良菌株降酸率可达 比葡萄酒酵母降酸性能提高 20。1994）等将能够分解纤维素的 从葡萄糖产酒精的 行融合，得到两株具有很强将纤维素转化为酒精的能力。文铁桥等（文铁桥， 1999）通过 导典乙 酸灭活呼吸缺陷克鲁维酵母原生质体与酿酒酵母原生质体融合，获得 45发酵产酒率达 高温酵母菌株 （ 3）其它有益菌的选育 原生质体融合技术广泛应用于产酶菌株的选育，主要是淀粉酶、蛋白酶和纤维素酶的产酶菌株，通过融合提高菌种的产酶活力、改变菌种酶分泌的种类或使产酶菌株获得新的优良性状。日本 学以柠檬酸生产菌株黑曲霉（ 纤维素酶生产菌株绿色木酶（ 亲株进行原生质体的融合，筛选得到一类融合子能够在甘蔗渣固体培养基上生长并产生柠檬酸。 融合子兼具了绿色木酶产纤维素酶的能力和黑曲霉产柠檬酸的能力。曹军等（曹军， 2001）中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 7 以栖土曲霉种内非营养缺陷型进行原生质体融合，融合子为一杂合二倍体，产角蛋白酶活力较亲株明显提高。 周德明（周德明 ,2001）采用原生质体融合技术将球形红假单胞菌和酿酒酵母构建成高效降解工程菌，用于废水处理的比降解率明显提高。裘娟萍等（裘娟萍，王普 ,2001）以红发夫酵母（ 出发菌株经诱变产生总色素产量高的突变株，再同野生型进行原生质体融合，融合子总色素产量比亲株提高 169 。程树培等（程树培，邓良伟 ,1997）将光合细菌与酵母菌进行融合，用于连续发酵豆制品废水处理。 (2004)用紫外诱变根霉（ 子筛选营养缺陷型突变株，选择其