【毕业学位论文】（Word原稿）H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白抗原性差异的研究预防兽医学硕士论文

密级 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 型禽流感病毒血凝素蛋白抗原性差异的研究 of 5 of 5 I 摘 要 高致病力 型禽流感的暴发不仅给世界养禽业造成巨大打击，而且给人类健康带来严重威胁，对于该病的防制具有重要的公共卫生学意义。疫苗免疫接种是防制高致病性 型禽流感的重要手段，但禽流感病毒像所有的 毒一样在传播过程中非常容易发生变异，使疫苗株与感染的病毒之间抗原差 异较大 而 不能有效保护家禽 。 已知 禽流感病毒的毒力和抗原性与其 白有密切关系，因此要控制禽流感首先要 对 毒株之间 原性的差异 进行研究 。 为此 ， 本研究选用了 4 个不同年代、不同分离地点的毒株 （ 株 是 04 年分离于广东地区、株 是 96 年分离于广东地区、 株 是 04 年分离于东北地区、 株 是 05 年分离于东北地区） ， 首先经 增了 4 株 型禽流感病毒的血凝素基因（ 将其克隆到 状病毒转座载体上，经酶切鉴定及测序筛选出阳性重组载体，将其转化受态细 胞与杆状病毒穿梭载体（ 行转座，通过蓝白斑筛选和 定获得重组杆状病毒穿梭载体（ 脂质体介导下转染 虫细胞。通过蛋白质电泳、 免疫印迹法 、血凝试验和血凝抑制试验分析表明：分子量约 63组血凝素蛋白在 虫细胞中实现了高效表达，具有良好的血凝活性；而且其血凝活性能够被 流感病毒高免血清所抑制，说明表达的重组蛋白具有与天然蛋白相似的生物活性 。 然后将 所表达 4 种 白定量 ，用佐剂乳化后制成禽流感基因工程亚单位疫苗 分别免疫 1组 3 周龄 。并在免疫后 1和攻毒后 3 周分别翅静脉采血 并 分离血清，将采集的血清分别用 型禽流感病毒的 不同毒株 作为抗原进行交叉血凝抑制反应（ 中和试验 ， 来检测抗体与不同毒株之间的交叉血凝抑制价和中和病毒的能力 ， 并用 A/4 毒株 作攻毒保护试验以 对这 4 株 禽流感病毒的 白 进行比较，从免疫水平上了解血凝素基因的差异；实验结果显示各组 对强毒株的攻毒保护、排毒情况及对不同 分离株的 血凝抑制价有显著差别， 白免疫组对 4 个毒株的血凝抑制价最低 普遍在临界保护值以下 ， 并且 对 株的攻击不能 100%保护并有严重的排毒现象。 白免疫组对 株的攻击能够全保护，但也有一定量的排毒。 只有 白免疫组对同源病毒的攻击产生非常好的保护力也没有排毒现象 ， 而且对 4 种不同抗原都有较高的血凝抑制效价； 从 结果中 可以看出 96 年分离的 株与 04/05 年分离的几个毒株抗原性差异很大。 株的抗原性与 株也不相同，虽然能够有效保护但也会排毒。 关键词 : 禽流感，血凝素基因，杆状病毒表达， 抗原性， 5N1 of in to in 5N1 a to to be a IV as a is to It is IV is to So we of in to I. In we .7 kb 5N1 by . by CR of NA in of 2h A be 5N1 On of in 5N1 we A It PF we to do t ; we A of l PF GD I t be CC C be A t I A of 64/05 t be by D FY C、 YC FY is FY 略 语 全 称 对 照 解 释 AI 流感 流感病毒 苄青霉素抗性 补 二胺四乙酸 HA 凝素 HI 凝抑制 致病性禽流感病毒 丙基 道尔顿 LB 致病性禽流感病毒 OD 密度 丙烯酰胺凝胶电泳 酸盐缓冲液 合酶链式反应 pH of 碱值 糖核酸酶 二烷基磺酸钠 特定病原 （羟甲基）氨基甲烷 43 录 第一章 绪 论 . 1 感病毒的分子生物学 . 2 毒的结构与编码蛋白的功能 . 2 感病毒的复制 . 6 感病毒的遗传与变异 . 7 致病性禽 流感的流行现状、危害及其公共卫生学意义 . 8 5 亚型高致病性禽流感的流行与危害 . 8 5 亚型高致病性禽流感病毒的公共卫生学意义 . 9 流感疫苗研究进展 . 11 病毒灭活苗 . 11 因重组活载体疫苗 . 11 酸疫苗 . 12 单位疫苗 . 13 研究的目的和意义 . 13 第二章 材料与方法 . 15 验材料 . 15 株和细胞 . 15 种和载体 . 15 验动物 . 15 他材料 . 15 要试剂 . 15 要仪器 . 15 验方法 . 16 个 因序列的测定及比较分析 . 16 A 基因克隆以及杆状病毒转移载体的构建 . 17 组杆状病毒穿梭载体的 筛选及鉴定 . 18 A 蛋白的表达 . 19 组蛋白的检测 . 20 苗的制备 . 21 体效价（ 测及抗原相关性分析 . 22 毒中和试验 . 23 苗的免疫保护试验 . 23 第三章 结果 . 24 种 因 的序列测定及比较分析 . 24 A 基因的 增 . 24 基酸序列的比较分析 . 24 组转 移载体的构建及鉴定 . 25 组穿梭载体的构建及鉴定 . 26 V 染后细胞的形态学变化 . 26 达蛋白的分析及 鉴定 . 27 达蛋白的 析 . 27 达蛋白的 测结果 . 27 达蛋白的血凝试验检测结果 . 28 达蛋白的血凝抑制试验检测结果 . 28 苗的制备 . 28 蛋白的浓度测定 . 28 的蛋白的定量 . 29 白的乳化 . 30 疫后抗体消长情况 . 30 毒中和试验 . 31 毒滴定 . 31 和试验 . 31 苗的免疫保护情况 . 32 毒保护试验 . 32 毒情况 . 32 毒量的滴定 . 33 第四章 讨论 . 34 第五章 结论 . 37 参考文献 . 38 致 谢 . 43 作者简历 . 44 附录 . 45 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪 论 1 第一章 绪 论 流感病毒属于正粘病毒科，流感病毒属，是具有囊膜，多形态的 毒。根据其内部核蛋白（ 基质蛋白（ M）抗原性的不同，可分为 A、 B、 C 三型。其中以 A 型流感病毒感染的范围最广，危害最大，常以流行的形式出现，它可以感染人、猪、马、海洋哺乳动物以及各种鸟类（ et 1992），是人和畜禽呼吸道疾病的重要病原。本文中提及的流感病毒主要为 A 型流感病毒。 禽流感（ 由 A 型流感病毒所引起的禽类的感染和 /或疾病综合征（ 尔尼克等 , 1991; 甘孟侯等 , 1995）。 在 1878 年首次在意大利报道该病，当时称之为鸡瘟 （ 1955）首次证明该病病原是 A 型流感病毒。 后传入其他欧洲国家、南美、东南亚、美国及前苏联等国家和地区，现已几乎遍布世界各地。 感染谱很广，可引起大多数家禽、野禽及水禽的感染，其中以鸡和火鸡最为易感，水禽则为流感病毒的自然宿主。由于禽流感病毒（ 型众多，抗原变异频繁，不同血清型毒株间缺乏交叉保护性，在 现的 100 多年来，世界各地都有特定毒株引起 发和流行，给养禽业造成了巨大的经济损失。 1997 年在香港人群中发现了感染 病例，有 18 人直接感染了该病毒，其中 6 人死亡，该事件为全球 越种间屏障直接感染人并致人死亡的首次报道（ et 1998）。自 1997 年香港人感染禽流感事件以来，到目前为止（ 2007 年 5 月），据世界卫生组织报道世界范围内共发生 307 例禽流感病毒直接感染人病例，其中 186 人死亡（ T et 2005）。 2004 年，泰国老虎、猎豹、猫也被首次证实感染 型禽流感病毒，越来越多的迹象表明禽流感病毒突破种间屏障感染哺乳动物的能力正在逐渐增强（ J et 2004; T et 2004）。因此 型禽流感病毒不仅可以对养禽业造成毁灭性的打击，而且给人类健康带来严重威胁。 由于 有重要的经济和公共卫生学意义，对该病的防治显得尤为重要。目前，各国对禽流感的预防和控制采取了不同的措施，其中疫苗免疫是预防和控制 主要手段。但是流感 病毒像其它 毒一样进化非常迅速，在流感病毒的 8 个基因片段中病毒囊膜表面的表面抗原血凝素（ 化最快； 宿主免疫系统主要的靶抗原，它能结合宿主唾液酸之类的细胞受体，使病毒附着于细胞上促进病毒核糖核蛋白复合体通过膜融合释放出来并改变抗原性，以逃脱宿主免疫系统的监视激发病毒的感染（ E, et 1989），可以诱导机体产生中和抗体起到免疫保护作用，因此目前存在的禽流感疫苗主要是针对 流感病毒抗原性的不稳定性给该病的防制带来了极大的困难，需要每年挑选出具有广泛保护性的 毒株作为流感疫苗株。这就需要了解毒株之间抗原性的差异， 与其他表达系统相比杆状病毒表达系统作为一种真核表达系统能够在外源基因表达后对其进行糖基化、磷酸化和蛋白切割加工修饰，其表达产物的生物学特性与天然产物相似 (,et 1999)。因此 本实验选用 4 个不同年代、不同分离地点的毒株用杆状病毒表达系统表达它们的 白来免疫 ，用其血清与 型的不同毒株做血凝抑制试验。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪 论 2 感病毒的分子生物学 毒的结构与编码蛋白的功能 流感病毒为多形性，有球形和长丝状两种形态。病毒粒 子一般呈球形，直径为 80120均为 100 感病毒具有囊膜，在囊膜表面有许多放射状排列的纤突，病毒粒子的中心有一直径为 4060电子密度高的锥状核心。 A 型流感病毒为单股、负链、分节段的 毒。流感病毒基因组共有 8 个节段，通过对某些 A 型流感病毒全基因组的序列测定和比较发现，在这些已测出的序列中可发现一些共同的特点： 8 个基因片段的 3末端和 5末端都有高度保守的相同核苷酸序列，所有片段 5末端的前 13个核苷酸都相同，序列为 3 ，所有片段的 3末端的 12 个核苷酸都相同，序列是 3在这些共有序列中，可反向互补，成一个锅柄状结构。遗传学和生化试验证实 3和 5末端保守序列对于病毒转录和复制是至关重要的，锅柄环状结构是病毒 合酶结合所必需的核苷酸识别位点（ u, et 1982）。 5和 3末端中除共同序列以外的其余序列对每个基因节段来说是特异的，但对于流感病毒的同一基因来说也是高度保守的。病毒基因组末端的非编码区序列（包括共同的序列和基因特异的序列）包含了病毒 毒复制和装配 所有的必需信号。当这些非编码区位于一个外源流感病毒基因的两侧时，这种基因也能被复制、转录并装配到流感病毒粒子中。在每个基因节段靠近 5末端的 1521 个核苷酸处有一个保守区，序列为 U），它是在病毒合成 产生 A）的信号。 流感病毒的基因组 8 个基因片段共编码 10 种蛋白，根据其表达和存在位置的不同可划分为三个组分，即表面蛋白、内部蛋白和非结构蛋白。血凝素（ 神经氨酸酶（ 离子通道表面蛋白，内部蛋白包括三种聚合酶蛋白 由 因编码的、新发现的 及核蛋白（ 基质蛋白 1（ 非结构蛋白 2（ 非结构蛋白 1（ 量产生于感染细胞中，是唯一不包装到病毒颗粒的蛋白（图 1 图 1 型流 感病毒结构模式图 he of 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪 论 3 其中血凝素（ 神经氨酸酶（ 2 种主要的糖蛋白，也是病毒表面抗原，根据 的不同， A 型流感病毒又可区分为不同亚型，如 前已鉴定 16 种 et 2005）和 9 种 型。 1) 聚合酶蛋白（ 流感病毒的聚合酶由三种成分组成，它们是 三种蛋白质是病毒粒子中分子量最大的蛋白质。 片段 1 编码，长度为 2341 2320大约 759 个氨基酸残基，其功能是在病毒 录的起始阶段，识别宿主 端的 型帽子结构并与之结合，同时还具有限制性内切酶活性，参与切割宿主 子结构作为合成病毒 引物。片段 2 编码，长度为 2341 2320碱基，共含 757 个氨基酸残基，主要负责病毒 成的启动并使之逐渐延长，同时负责 合成和延伸。 由 阅读框编码的 87 残基蛋白，在细胞的线粒体中大量存在，与流感病毒介导的细胞凋亡有关（ W et 2001）。人工突变干扰 表达，人单核细胞凋亡的程度要比暴露于 测是由于 坏细胞内部的能量加工厂 线粒体，杀死免疫细胞（单核细胞），从而使机体无法对流感病毒感染作出反应并抵抗病毒攻击。 发现无疑又给流感病毒感染及不同亚型在不同宿主表现的毒力差异提供又一种解释方式或研究思路。 片段 3编码， 度为 2233 2211碱基，由 716 个氨基酸残基组成，在 录和复制过程中，与 起随链的延长而移动，主要参与 复制，推测其可能在 解旋酶的角色（ M et 2000）。这三种蛋白质在氨基酸序列上有一共同点，即都含有一特异的亲核序列区，其作用是使这几种蛋白质在胞浆合后能顺利进入细胞核。聚合酶复合体在病毒粒子中所处的位置目前已经清楚，三种蛋白质位于病毒 末端，外被核蛋白，形成病毒核糖核蛋白复合体（ K et 1997）。 2) 血凝素（ 血凝素是构成流感病毒囊膜纤突的主要成分之一，由 段 4 编码， 段 4 长度为 17421778码 562566 个氨基酸残基的多肽链，大小约为 75糖蛋白。 为319326 个残基， 为 221222 个残基。 典型的 I 型糖蛋白，即羧基端在囊膜内，氨基端在囊膜外。它含有 4 个结构域：信号肽（前导序列）、胞浆域、跨膜域和胞外域，是流感病毒所有蛋白中最重要的一个，具有凝集多种动物红细胞的性质 。 主要功能是结合宿主唾液酸之类的细胞受体，使病毒附着于细胞上，帮助病毒穿透宿主的细胞膜并改变抗原性，以逃脱宿主免疫系统的监视（ 1998），是流感病毒抗原变异和病毒致病力的主要决定因素。宿主免疫系统主要的靶抗原，可以诱导机体产生中和抗体，进而起到免疫保护作用，抵抗感染和疾病。 翻译后的加工处理主要有 3 个过程：裂解酶的裂解、糖基化和脂肪酸的乙酰化。首先合到宿主细胞膜上脱掉信号肽成为 由细胞内类似胰酶的裂解酶裂解成 者由二硫键连 接在一起， 裂解是病毒感染的先决条件，对病毒的感染性和毒力都很重要；然后 运送到高尔基复合体中，完成糖基化；最后在胞浆中完成脂肪酸的乙酰化，运送到细胞膜，嵌入胞膜的脂质双层，在病毒出芽释放时被带到病毒囊膜上。目前已经知道血凝素的三级结构是由三个 子聚合在一起形成的三聚体的头茎结构。头部由 单中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪 论 4 位组成，为受体结合位点（ 抗原决定簇；茎部由 部分 羧基端主要由疏水氨基酸组成，可锚定在病毒囊膜脂质双层中；氨基端多由 亲水性氨基酸残基构成，可伸出脂质双层进入病毒粒子。 迄今为止，己经发现 16 个 型的流感病毒，虽然它们在血清学上存在着明显的差异，然而序列比较表明，其半胱氨酸残基在所有亚型的序列中都很保守，表明它们来白一个共同的祖先，并且具有相似的结构。氨基酸序列比较发现，相同亚型的不同毒株之间 列同源性在 90%以上，不同亚型毒株同源在 2580%之问，其中 型 的差异最大，仅有 25%的同源性， 型间的同源性较高为 80%。对于 体而言，除 的受体结合位点高度保守外， 有很高的变异率。 3) 核蛋白（ 由片段 5 编码的结构蛋白，分子量为 60一种单体的磷酸化多肽。在流感病毒的8 个基因中， 因最为保守。 有型特异性，根据其抗原性的不同，可将流感病毒分为 A、B、 C 三个型。 两种形式，一种是可以移入核内的磷酸化形式（ 另一种是留在细胞质内的非磷酸化的形式（ 核蛋白是一种多功能的蛋白质，除了参与形成 合体、保护 受 用外，病毒复制过程中，对病毒基因组 细胞核内外的运输和蛋白的定位有着重 要作用（ B et 2000）。 是细胞毒性 T 淋巴细胞识别的主要抗原，至少具有 3 个独立的抗原位点，但是抗 抗体不能给宿主提供免疫保护。 4) 神经氨酸酶（ 由 段 6 编码的表面糖蛋白，分子量为 200 糖蛋白，即氨基端在囊膜内，羧基端在囊膜外，是病毒粒子表面的另一种重要的抗原。 一种糖苷外切酶，可以从糖苷键上除去唾液酸（ N乙酰神经氨酸），因此 从病毒和感染的细胞上除去唾液酸残基。这一功能对病毒粒子的释放以及防 止病毒粒子聚集是很重要的（ et 987; et 998）。 与病毒的宿主特异性及病毒的毒力有关。 活性可被抗体和特异抑制物阻断，从而限制病毒的复制，主要表现为 有吸附、融合、复制、装配和出芽功能。 病毒粒子表面并不是随机分布，而是呈不连续的斑片状。 因在翻译后不需要切割，不需除去信号肽，起始密码子翻译的 直存在，羧基端也不经过加工。 一级结构包括 4 个结构域：氨基端胞浆尾、非极性跨膜区、茎部、头部。其中， 氨基端胞 浆尾包括6 个氨基酸残基 常保守，在所有的