SDS-PAGE蛋白电泳方法.doc

SDS-PAGE一. 实验原理SDS 是一种阴离子表面活性剂，在蛋白质溶液里加入 SDS 和巯基乙醇后，巯基乙醇能使蛋白质分子中的二硫键还原， SDS 能使蛋白质的氢键、疏水键打开并结合到蛋白质分子上，形成蛋白质-SDS 复合物。在一定条件下，SDS 与大多数蛋白质的结合比例为 1.4:1。由于十二烷基磺酸根带负电，使各种蛋白质的 SDS-复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。SDS与蛋白质结合后，还引起了蛋白质构象的改变。蛋白质-SDS复合物的流体力学和光学性质表明，它们在水溶液中的形状，近似于雪茄烟形的长椭圆棒，不同蛋白质的 SDS 复合物的短轴长度都一样，约为 1.8nm ，而长轴则随蛋白质的 Mr 成正比的变化。基于上述原因，蛋白质-SDS 复合物在凝胶电泳中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只与椭圆棒的长度有关， 也就是蛋白质 Mr 的函数。二. 试剂器材30%凝胶贮液(100mL)：称取试剂Acr 29.2g和Bis 0.8g置于100mL烧杯中，向烧杯中加入约60mL双蒸水，充分搅拌溶解后加双蒸水定容至100mL，置于棕色瓶内4 贮存，每过1-2个月应重新配制；注意：丙稀酰胺具有很强的神经毒性，并可通过皮肤吸收， 其作用有积累性，配制时应戴手套和口罩等。分离胶缓冲液(1.5 mol/L Tris-HCl，pH 8.8，100mL)：称取Tris 18.2g 溶于约80mL双蒸水，用6mol/L的HCl 调整pH值至8.8，加双蒸水定容到100mL，4 贮存；堆积胶缓冲液(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8，100mL)：称取Tris 6.0g溶于约80mL双蒸水，用1mol/L的HCl 调整pH值至6.8，加双蒸水定容到100mL，4 贮存；电泳缓冲液(1L)：称取试剂Tris 3.03g和甘氨酸 14.4g置于500mL烧杯中，向烧杯中加入约400mL双蒸水充分溶解，再加入10%SDS溶液1.0mL，以双蒸水定容至1L (自然pH值为8.3，无需再调)，4 贮存，可重复使用5-6次；2加样缓冲液(10mL)：取下列试剂置于10mL塑料离心管中0.5mol/L Tris-HCl缓冲液(pH6.8) 2.0mL10%SDS溶液 4.0mL甘油 2.0mL巯基乙醇 2.0mL溴酚蓝 0.02g，混匀后1mL分装，-70可贮存6个月；10%AP：称取(NH4)2S2O3 1.0 g，溶于10.0mL双蒸水中，分装成每份1mL，-20贮存；TEMED：分装成每份1mL，4避光贮存；水饱和正丁醇(100mL)：在玻璃瓶中加入50mL双蒸水和50mL正丁醇，振摇。上层相即水饱和正丁醇，室温下可长期保存。染色液(100mL)：称取考马斯亮蓝R-250 0.25g，加入双蒸水40.0mL、甲醇50.0mL和乙酸10.0mL，搅拌溶解后滤纸过滤除去不溶颗粒；脱色液(1L)：分别取甲醇50mL和乙酸75mL，加双蒸水875mL稀释。其他器材：容量瓶(1L、100ml、10ml)、烧杯、离心管(15ml、1.5ml)、移液器、移液器吸头、干燥器、涡旋振荡器和废液缸等。分离胶配方(100mL，4块胶)贮液分离胶中丙烯酰胺的终浓度(%)8.09.010.011.012.013.014.015.016.017.018.0凝胶贮液(mL)26.6730.0033.3336.6740.0043.3346.6750.0053.3356.6760.00分离胶缓冲液(mL)25双蒸水 (mL)46.5343.2039.8736.5333.2029.8726.5323.2019.8716.5313.2010%SDS (mL)1.010%AP (mL)0.75TEMED (mL)0.05 (抽气后添加)堆积胶配方(40mL，4块胶)贮液堆积胶中丙烯酰胺的终浓度(%)3.04.05.0凝胶贮液(mL)4.005.366.66分离胶缓冲液(mL)10.0双蒸水(mL)25.3624.0022.7010%SDS(mL)0.410%AP(mL)0.2TEMED(mL)0.04 (抽气后添加)三. 操作步骤样品处理：在密封的螺盖微量离心管中，用2加样缓冲液按1:1稀释蛋白质样品溶液，于100煮沸3-5min，分子质量标准品也经上述处理。凝胶制备：将玻璃板用蒸馏水清洗干净，再用75%的酒精去脂，干燥后固定在灌胶支架上；配制12%的分离胶，加入TEMED前抽真空10min以除去丙烯酰胺溶液中的空气；加入TEMED后轻轻振荡混匀，迅速注入安装好的玻璃板的间隙中，给堆积胶留出约1cm的空间。在丙烯酰胺溶液上覆盖一层水饱和的正丁醇，以防止空气扩散到凝胶中抑制聚合作用，并保证凝胶表面水平；在室温条件下，凝胶应在30min-50min内聚合完成。凝胶聚合后凝胶和上层液相之间可见折射率的变化；倒掉覆盖层并用蒸馏水清洗凝胶顶部数次，并用滤纸条吸净残留的蒸馏水，注意勿破坏凝胶表面；制备堆积胶并迅速注入分离胶上，立即插入干净的梳子，不要混入气泡，以一定的角度将梳子插入堆积胶能减少气泡的产生。堆积胶聚合后小心移去梳子，避免破坏加样孔，用蒸馏水小心清洗加样孔，以除去未聚合的丙烯酰胺。加样：将凝胶固定在电泳装置上，电泳上槽内加入电泳缓冲液没过加样孔，并检查有无渗漏。倾斜整个装置以赶走凝胶下面可能留有的气泡；按预定顺序加样，每孔加入20mL，在对照孔中加入分子质量标准品6-7 mL，如有空置的加样孔，加入等体积的1加样缓冲液。电泳：将电泳装置与电源相连，正极接下槽、负极接上槽进行电泳，样品在堆积胶阶段电压为80V，而在分离胶阶段电压调整为120V。直到溴酚蓝到达分离胶的底部后，关闭电源，断开电极。从电泳装置上卸下玻璃板，用小铲子剥下凝胶后切除一角以标注凝胶方位。染色： 将凝胶浸泡在染色液中，置于摇床上染色4hr，染色液可回收重复利用。脱色：染色结束后，将凝胶浸泡在脱色液中，置于摇床上脱色过夜，其间更换脱色液3次.记录：将显示蛋白条带的凝胶用凝胶成像仪拍照，记录试验结果，并根据分子质量标准品计算目标蛋白的分子量。四. 注意事项：SDS与蛋白质的结合按质量成比例，蛋白质含量不可以超标，否则SDS结合量不足。用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子量时，必须同时作标准曲线，并且SDS-PAGE测定分子量有10%误差。有些蛋白质由亚基(如血红蛋白)或两条以上肽链(-胰凝乳蛋白酶)组成的，它们在巯基乙醇和SDS的作用下解离成亚基或多条单肽链。因此，对于这一类蛋白质，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定的只是它们的亚基或是单条肽链的相对分子量。有的蛋白质(电荷异常或结构异常的蛋白质、带有较大辅基的蛋白质)不能采用该法测相对分子量。SDS-PAGE的有效分离范围丙烯酰胺浓度(%)1512.510+7.5: D* A2 m- s+ 9 A4 d0 ?9 y. C2 g8 c5.08 N3 _! m$ K* ) n5