菘蓝叶片的离体培1.doc

菘蓝叶片的离体培养 学院：农学院 班级：生物技术2012-3 姓名：康莎莎 学号：20126268指导教师：倪苏 刘凡 摘要：本实验以菘蓝幼嫩叶片为外植体，为研究不同外源激素种类、组合及其不同浓度对菘蓝叶片丛生芽诱导的影响，通过对离体消毒的菘蓝叶片采用四种不同激素配比的培养基进行比较培养.结果表明，在MS培养基的基础上添加6-BA+NAA都能成功诱导出丛生芽；但当添加激素为2,4-D+KT的培养基中，2,4-D对菘蓝叶片的愈伤组织的形成具有 一定的抑制作用,并且对于丛生芽的形成也有较强的抑制作用。但是对于其最强抑制诱导丛生芽和愈伤组织的浓度还有待进一步试验。 关键词：菘蓝叶片；离体培养；激素配比；愈伤组织；芽 菘蓝(Isatis indigotica Fort)为十字花科(Cruciferae)菘蓝属植物。以根入药，药材名板蓝根1。原产中国。主产河北省安国，江苏省如皋、南通2。其根(板蓝根)、叶(大青叶)均可药用。具有清热解毒、凉血的作用，对于医治发烧、发斑、风湿感冒、咽喉肿烂、肝炎、腮腺炎等多种疾病，均有较好的疗效3。以往对菘蓝的研究多集中于其根板蓝根化学成分和药理作用4-6。但板蓝根作为一种用量极大且长期销售不衰的药材，市场需求特别大。迫切需要快速生成大量且无病毒植株来满足市场需求，因此人民逐步将植物组织培养这一新技术应用于菘蓝。有关菘蓝的植物组织培养，前人已经做了一些阶段性研究7,8。如余绍华用菘蓝嫩叶、叶柄和嫩茎的组织培养为外植体3，陈秋芳、孟玉玲等以叶片为外植体，陈薇等以下胚轴为外植体建立了菘蓝的快速繁殖体系9-11，张胜珍研究了菘蓝叶片原生质的游离、纯化12，张菊红等应用正交设计方法13，对愈伤组织的诱导和分化培养基进行了优化筛选。本实验，将对离体消毒的菘蓝叶片采用四种不同激素配比的培养基进行比较培养，观察不同激素配比对菘蓝叶片愈伤组织的形成和芽的分化的影响，对其诱导分化的速度和诱导率进行分析，从而为进一步优化现有对菘蓝的组织培养技术提供重要的参考依据；同时也为菘蓝的优质育种、转基因及遗传研究等工作奠定基础。1材料与方法1.1供试材料菘蓝幼叶：由四川农业大学植物生理系提供。1.2试验方法 1.2.1 培养基配制 培养基设计如下：所有MS培养基均附加5.0g/L、蔗糖30g/L、肌醇100mg/L，并调节至PH=5.8。每500ml培养基分装于16个瓶子中（一共有4组，即64瓶），配制并分装好的培养基必须在高压蒸汽灭菌锅中121高温湿热灭菌20分钟后放置于常温下备用。培养基配方下表1。编号不同激素组合1 MS + 6-BA 2.0mg/L + NAA 0.1mg/L2 MS + 6-BA 2.0mg/L + NAA 0.5mg/L3 MS + 2,4-D 1.0mg/L + KT 0.5mg/L 4 MS + 2,4-D 2.0mg/L + KT 0.5mg/L 1.2.2材料处理 选取生长健康的菘蓝幼叶，用剪刀剪取3-4cm的幼叶，用纱布包好放入烧杯中流水冲洗30min左右。在已灭菌的超净工作台中，用75%的酒精消毒10s,然后用无菌水漂洗2-3次；再用0.1%的升汞进行消毒8min,每隔1min轻轻震荡一次，到时间后用无菌水漂洗5-6次，消毒完后将材料放在已消毒的无菌皿上待用。1.2.3接种 在超净台上将处理好的菘蓝叶片切割成约1cm2大小的小片，并用灭菌的滤纸吸干叶片表面多于的水分，用灭好菌的镊子将叶片块正面向上接种到培养瓶中，。每瓶中2-3块为宜，然后盖上封口薄膜。1.2.4诱导培养及数据记录接种好叶片的培养基在1500xl-1800xl的光照（14小时/天），252的条件下培养。在10-20天后有愈伤组织出现，观察其各指标（见表2），并记录各数据。2结果与分析 2.1不同浓度激素配比对菘蓝叶片离体培养丛生芽及愈伤组织的影响编号诱导数污染数污染率不定芽数不定芽诱导率愈伤组织数愈伤诱导率143818.60%1534.89%2148.84%21400535.71%750%3330026.06%3296.97%4271555.56%001244.44% 表2 通过记录不同培养机中菘蓝叶片的存活率以及死亡率原因，发现1号组和4号组都被污染了，而4号组污染率最高，并且几乎全为真菌感染，追溯其原因得知是第4组同学在接种菘蓝过程中，在材料处理步骤中未能按照实验要求准确完成，造成整个小组实验结果受到极大影响，特别是菘蓝的存活率。由表中可以看出1号与2号培养基所诱导的不定芽数与愈伤组织数较高，并且2号两者的诱导率都较高；3号培养基只有极少数的不定芽生成，并且其愈伤组织诱导率最高，高达96.97%，但是其生长状况并不良好；4号培养基中未能诱导出不定芽，但诱导出一定的愈伤组织，但是其生长状况不良好。2.2不同不同浓度激素配比对菘蓝叶片离体培养生长状况的影响 通过观察不同组合培养基中菘蓝叶片的生长状况（如表2与图1）。通过整体对比可以看出：1号组 与2号组培养基的激素配比最适合诱导丛生芽，2号组与3号组最适合诱导愈伤组织。通过2号组与1号组相比诱导出较多的丛生芽，并且丛生芽多而繁、高而细；1号组每个培养基中诱导出的不定芽数目较少，并且长势并没有2号组的良好，总的来说2号组的比3号组长势要好。一方面表明2号组（MS + 6-BA 2.0mg/L + NAA 0.5mg/L）的培养基更有利于诱导出丛生芽，诱导出的丛生芽健壮、个体较大；另一方面表明随着NAA浓度的下降，丛生芽诱导数量及生长状况有下降趋势。通过3号组与4号组对比，3号培养基也有丛生芽诱导出，但是数量极其地少，并且要在肉眼仔细观察的情况下才能观察到，其主要表现在于诱导出了较多的愈伤组织，但是整体长势不良好；而4号组培养基只有叶片卷曲，少数膨胀，有些边缘发黑，愈伤组织很少。从而表明3号组培养基诱导出的愈伤组织生长情况要比4号组的好，说明在一定范围内2,4-D浓度升高会抑制愈伤的诱导。 3结论与讨论 植物组织培养技术是快速获得无毒植株的重要方法，是植物生物工程技术研究的基础，而植物组织培养是一个复杂的技术体系，与植株本书的激素水平和培养基中的生长调节剂浓度密切相关。在组织培养中，人们常用生长素(IAA)和细胞分裂素(6-BA)诱导已分化的细胞进行脱分化。2,4-D一般有利于愈伤组织的形成，但对芽的分化有强烈的抑制作用14。本实验的观察结果也不例外，在加入2,4-D的培养基上，不能或者只能诱导出极少数不定芽。NAA和2,4-D都是生长素类物质。单纯的NAA和6-BA组合，都可以诱导不定芽的分化。胡东楠等认为：随着培养基中6-BA与NAA的相对比例的升高，不定芽分化率也会增高。在本试验中，当MS + 6-BA 2.0mg/L + NAA 0.5mg/L时分化率较高，而MS + 6-BA 2.0mg/L + NAA 0.1mg/L时分化率较低一些，但是差异并不是很明显，却与理论结果不相一致。可能是由于污染了的菘蓝叶片对试验有一定的影响，还需进一步试验才能的出准确的结论。同时也得出，2,4-D在同等的含KT的培养基上，低浓度的2,4-D更加有利于愈伤组织的诱导，因此2,4-D对愈伤组织有一定的抑制作用。 试验结果表明，菘蓝叶片不易通过愈伤组织产生不定芽，可以不经过愈伤组织阶段直接诱导产生丛生芽，在诱导丛生芽时，不但要考虑诱导污染率的问题，同时也应该考虑诱导分化刑天发育程度。在以菘蓝叶片为外植体诱导丛生芽时，得出在相同浓度的6-BA+NAA培养基中，0.5mg/L的NAA有助于丛生芽的诱导并且诱导效果好，生长健壮。2,4-D在的含相同浓度KT的培养基中，2,4-D浓度对菘蓝叶片愈伤组织的形成有一定的抑制作用，并且对于丛生芽的形成也有极强的抑制作用。但对于其最强的抑制诱导丛生芽和愈伤组织的浓度还有待进一步试验。 参考文献：1 张丽琼,周琼,柳林. 不同培养基对菘蓝叶片组织培养的效应J 广西热带农业2007年第6期(总第113期)第30-31页2 百度百科 菘蓝 3 余绍华. 菘蓝的组织培养J 四川师范学院学报1991;12(4):3583614刘云海,秦国伟,丁水平,等.板蓝根化学成分的研究（）J.中药草,2002，33(2)5刘海利,吴立军,李华,等.板蓝根的化学成分研究J.沈阳药科大学学报,2002,19(2)6姚振生，药用植物学M.北京：中国中医药出版社,2003,2667彭菲,王凤翱,菘蓝子叶和下胚轴组织培养再生植株的研究J,湖南农学院学报，1994,20（5）：450-456.8傅翔,张汉明,丁如贤,等.激素对菘蓝器官分化的影响J.中药材,1997,28(10):618-620.9陈秋芳,群策,秦广雍.菘蓝叶片离体培养与试管无性系的建立J.河南农业科学,2007,38（12):98-100.10孟玉玲,菘蓝子叶直接诱导丛生芽J.中药草,1995,20(1):5211陈薇,杜利云,寸守酰等,.菘蓝下胚轴组织离体培养J.药学实践杂志2,000,18（5）：337-33912张胜珍,客绍英,马作东,等.菘蓝叶肉原生质体游离与纯化研究J.中药材,2009,5（32）：664-66