全国艾滋病检测技术规范修订版

全国艾滋病检测技术规范（2009年修订版）,芜湖市第六人民医院金敬富,基本概念,艾滋病(AIDS)又称获得性免疫缺陷综合征，是由人类免疫缺陷病毒(HIV)感染所引起的一种免疫缺陷性疾病。 HIV在病毒分类中属逆转录病毒科慢病毒属中的人类免疫缺陷病毒组。迄今为止，根据血清学反应和病毒核酸序列测定，全球流行的HIV可分为2型：HIV-1型和HIV-2型。在HIV-1型内，根据编码包膜蛋白的env基因和编码壳蛋白的gag基因序列的同源性又进一步分为3个组：组（主要组）、组（外围组）和组（新组或非M非O组），组内又可分为10个亚型。在HIV-1型和HIV-2型之间,其核苷酸序列有45的同源性，并且存在免疫交叉反应。应用免疫印迹法(West blot)可以将二者明确地区别开来。,HIV感染机理,HIV病毒侵入人体后，其表面糖蛋白gp120与细胞表面受体蛋白CD4以高亲和力结合，吸附到宿主细胞上；gp120再与宿主细胞表面辅助受体相互作用，使病毒与宿主细胞膜更接近；gp41产生一系列构象变化，其N端的融合肽片段插入宿主细胞膜，导致病毒包膜与细胞膜的最终融合，病毒RNA进入细胞。在HIV感染后，最先能够监测到病毒RNA、然后是p24抗原，最后是抗体。,全国艾滋病检测技术规范（2009年修订版）,全国艾滋病检测技术规范National Guideline for Detection of HIV/AIDS（2009年修订版） 中国疾病预防控制中心二九年九月,全国艾滋病检测技术规范（2009年修订版）,中国疾病预防控制中心性艾滋病预防控制中心对全国艾滋病检测技术规范（2004年版）进行修改、增补和完善后，制定出全国艾滋病检测技术规范（2009年版），使其既能满足目前艾滋病检测工作的实际需要，又能体现检测技术的发展。,全国艾滋病检测技术规范（2009年修订版）,本次主要对以下几个方面内容进行了修改、增补和完善：（1）在样品的采集和处理中，增加了滤纸干血斑样品、快速检测样品的采集和处理，用于CD4+/CD8+T淋巴细胞测定样品、尿液和唾液样品的采集和处理；（2）在HIV抗体检测中，增加了免疫荧光法和化学发光法，进一步明确了不同情况下的检测策略；（3）在HIV核酸检测中，增加了HIV感染产妇所生婴儿HIV感染早期诊断检测流程和适用于窗口期的集合核酸检测方法,全国艾滋病检测技术规范（2009年修订版）,（4）根据临床治疗需求，增加了HIV-1的耐药检测；（5）进一步完善了艾滋病检测实验室安全防护和艾滋病检测实验室的质量管理，使其更加符合目前艾滋病防治工作的需求，更加具有可操作性；（6）考虑到技术发展和新的需求，增加了HIV-1新近感染检测和HIV-1的分离培养技术。,全国艾滋病检测技术规范（2009年修订版）,修订后的规范共九章，包括：样品的采集和处理、HIV抗体检测、HIV-1抗原检测、HIV核酸检测、HIV-1耐药检测、CD4+ 和CD8+ T淋巴细胞检测、HIV-1的分离培养、实验室生物安全、艾滋病检测实验室的质量管理。,全国艾滋病检测技术规范（2009年修订版）,本规范上报卫生部，经获准由中国疾病预防控制中心发至全国艾滋病检测实验室及有关单位。本规范将为国家、卫生部与财政部等部委下发的关于艾滋病防治工作的各项政策法规的有效实施提供强有力的技术支持，并具体指导艾滋病检测实验室技术人员开展日常工作。本规范起草单位：中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心。,第一章 样品的采集和处理,应制定样品编码的标准操作程序，规定样品编码的原则和方法，为样品制定唯一性编码（编号），保证其唯一性。样品的保存用于抗体和抗原检测的血清或血浆样品，短期（1周）内进行检测的可存放于28， 一周以上应存放于-20以下。用于核酸检测的血浆和血细胞样品4天内进行检测的可存放于4，3个月以内应存放于-20以下。3个月以上应置于-70以下。,第一章 样品的采集和处理,艾滋病检测筛查实验室检测的筛查阳性样品应及时送确证实验室，筛查阴性样品，可根据具体需要决定保存时间，建议至少保存12个月。特殊用途或专项项目的样品根据具体要求确定保存时间。艾滋病检测确证实验室收到的筛查阳性样品，无论确证结果如何，均应将剩余的样品保存至少10年，特殊用途或专项项目的样品根据具体要求确定保存时间。,第一章 样品的采集和处理,样品的运送应符合生物安全要求；要获得相应部门批准并由具有资质的人员专程护送。应采用三层容器对样品进行包装，随样品应附有与样品唯一性编码相对应的送检单。送检单应标明受检者姓名、样品种类等信息，并应放置在第二层和第三层容器之间。第一层容器：直接装样品，应防渗漏。样品应置于带盖的试管内，试管上应有明显的标记，标明样品的唯一性编码或受检者姓名、种类和采集时间。在试管的周围应垫有缓冲吸水材料，以免碰碎。,第一章 样品的采集和处理,第二层容器：容纳并保护第一层容器，可以装若干个第一层容器。要求不易破碎、带盖、防渗漏、容器的材料要易于消毒处理。第三层容器：容纳并保护第二层容器的运输用外层包装箱。外面要贴上醒目的标签，注明数量、收样和发件人及联系方式，同时要注明“小心轻放、防止日晒、小心水浸、防止重压”等字样，还应易于消毒。特殊情况下经有关部门批准可以用特快专递邮寄样品，但必须按三层包装，将样品管包扎好，严禁使用玻璃容器。,A类感染性物质的包装与标签(P.I.602),B类包装,包装材料生产厂家,北京新晔瑞峰&北京培容生物科技有限公司（）北京泉发科技发展有限责任公司 （） 天津津检危险品包装材料科技有限公司,样品的接收,样品包裹必须在具有处理感染性材料能力的实验室内、由经过培训的、穿戴防护衣、戴口罩、防护眼镜的工作人员在生物安全柜中打开，用后的包裹应及时进行消毒。核对样品与送检单，检查样品管有无破损和溢漏。如发现溢漏应立即将尚存留的样品移出，对样品管和盛器消毒，同时报告实验室负责人和上一级实验室技术人员。检查样品的状况，记录有无严重溶血、微生物污染、血脂过多以及黄疸等情况。如果污染过重或者认为样品不能被接受，应将样品安全废弃。并将样品情况立即通知送样人。接收样品时应填写样品接收单。,第二章 HIV抗体检测,HIV抗体检测实验室要求 应符合全国艾滋病检测工作管理办法（2006）中对实验室人员、建筑设施和设备等条件的要求。实验室的质量保证和实验室安全防护,HIV感染的主要检测方法,病毒培养是检测HIV感染最精确的方法。一般采取培养外周血单个核细胞(PBMC)的方法进行HIV的诊断。病毒核酸检测通常是通过检测HIV RNA水平来反映病毒载量，具有很高的灵敏度，使用适时荧光聚合酶链反应(PCR)技术，能够在HIV感染的前2周检测到病毒核酸。病毒核酸检测方法可用于HIV的早期诊断，如窗口期辅助诊断、病程监控、指导治疗方案及疗效测定、预测疾病进程等。目前常用的测定方法有逆转录PCR实验(RT-PCR)、核酸序列扩增实验(NASBA)、分支DNA杂交实验(bDNA)等。使用高灵敏度的适时荧光PCR技术，能够在HIV感染的前2周检测到病毒核酸。,HIV感染的常用检测方法,常用HIV病原学检测方法:病毒分离抗原检测-24抗原的检测核酸检测（ cDNA测定-PCR、 RNA测定-病毒载量）其他方法：逆转录酶测定、原位杂交常用HIV抗体检测方法:ELISA快速HIV检测免疫印记法 （ Western Blot）其他方法：免疫荧光法（IFA）、放射免疫沉淀,HIV感染的主要检测方法,抗体通常是在感染后38周能够被检测出来。95%在三个月可以检测出抗体。窗口期-在窗口期病毒抗体不能被检出，或许可以检测到病毒相关抗原或分离病毒。抗原能够在个体感染后先于血清转化218 d被检测到。因此，在血清转化期通过检测p24抗原有着很大的优势，可以作为早期辅助诊断HIV感染的一种方法。,HIV抗原检测的目的,检测早期感染，缩短窗口期 （可提前1-2周），最早可达9天。 HIV-P24抗原阳性仅作为HIV感染窗口期的辅助诊断依据，不能据此确诊。新生儿的感染辅助诊断：婴幼儿HIV抗体阳性不能用于诊断感染HIV，婴幼儿体内从母亲得到的HIV抗体持续存在时间最长不超过18个月。在18月龄以前可以用多种不同的非抗体依赖性的检验方法对新生儿HIV感染进行辅助诊断，包括：HIV P24抗原检测、病毒分离培养、RNA或DNA测定。,HIV抗体检测的目的,临床HIV疾病的诊断输血和移植安全监测人群流行状况,HIV抗体检测的要点,根据目的选择检测方法及检测策略。严格遵守实验室SOP。(SOP文件包括哪些内容，见规范52面。)。筛查试验阳性，须作确证试验。筛查试验阴性， 不应做确证试验。筛查及确证试验阳性均应做好咨询工作。,HIV抗体检测,以诊断为目的的检测策略常规HIV抗体检测的方法和程序HIV抗体检测分为筛查试验（包括初筛和复检）和确证试验。筛查试验筛查试剂必须是经国家食品药品监督管理局注册批准 、在有效期内的试剂，其中酶联免疫试剂应批批检合格。推荐使用临床质量评估敏感性和特异性高的试剂。筛查样品HIV抗体筛查可采用血清、血浆、滤纸干血斑、唾液和尿液(无法进行确认)样品。,2011 年全国HIV 抗体诊断试剂临床质量评估报告,2011 年全国HIV 抗体诊断试剂临床质量评估报告,2011 年全国HIV 抗体诊断试剂临床质量评估报告,HIV抗体检测,筛查方法（1）酶联免疫吸附试验（ELISA）可使用血液、唾液、尿液样品，ELISA多为单纯HIV抗体检测试剂。HIV抗原抗体联合检测试剂可同时检测血液中HIV-1P24抗原和HIV-1/2抗体。HIV抗原或抗体包被于固相载体，加入待检样品和酶标记的HIV抗原或抗体，加底物显色，用酶标仪测定结果。有效试验的阴性和阳性对照必须符合试剂盒规定。（2）化学发光或免疫荧光试验,HIV抗体检测,（3）快速检测（RT）及其它检测试验这类试验简便快速，适用于应急检测、门诊急诊检测。一般可在1030分钟内得出结果。,快速检测（RT）及其它检测,试剂稳定，可室温长期保存。试验时不需任何设备，迅速、简便、特异性较好，敏感性约相当于中度敏感的ELISA，适用于应急检测、门诊急诊个体检测，尤其是基层单位。,快速试剂的局限性,一般不用于血液筛查有一定的假阳性反应，如作为临床诊断，要复检和确认有一定的假阴性反应（尤其暴露时间3个月）,快速检测（RT）及其它检测,明胶颗粒凝集试验（PA）：是HIV血清抗体检测的一种简便方法。将HIV抗原致敏明胶颗粒作为载体，与待检样品作用。当待检样品含有HIV抗体时，明胶颗粒与抗体发生凝集反应，根据凝集情况判读结果。PA试剂有两种:同时检测HIV-1和HIV-2抗体以及分别检测HIV-1和HIV-2抗体。有效试验必须有阴性和阳性质控。,HIV抗体检测,免疫渗滤试验：斑点ELISA和斑点免疫胶体金（或胶体硒）快速试验：均以硝酸纤维膜为载体，HIV抗原点状固定在膜上，加待检样品。阳性结果在膜上抗原部位显示出有色斑点。反应时间在10分钟以内。有效试验的质控点必须显色。免疫层析试验：以硝酸纤维膜为载体，HIV抗原线状固定在膜上，待检样品（血液或唾液）沿着固相载体迁移，阳性结果在膜上抗原部位显示出有色条带。有效试验的质控带必须显色。,HIV抗体检测,筛查程序（1）初筛试验根据检测目的选用符合要求的筛查试剂对样品进行初筛检测，对呈阴性反应的样品，可出具HIV抗体阴性（-）报告；(如果标本的OD值略低于CUT-OFF值时（CO-10ODCO）判定时需小心) ；对呈阳性反应的样品，需要进一步做复检试验和确证试验。,HIV抗体检测,（2）复检试验对初筛呈阳性反应的样品，应使用原有试剂和另外一种不同原理（或厂家）的试剂，或另外两种不同原理或不同厂家的试剂进行复检试验。如果初筛检测使用抗原抗体联合试剂，则复检必须包括一种抗原抗体联合试剂。如两种试剂复检均呈阴性反应，则报告HIV抗体阴性（-）；如均呈阳性反应，或一阴一阳，需送艾滋病确证实验室进行确证试验（图1）。如果抗原抗体联合试剂检测呈阳性反应，而抗体试剂检测为阴性反应，则应考虑进行HIV-1 p24抗原或核酸检测，必要时进行随访。艾滋病检测筛查实验室复检判定为阳性反应的样品，确证实验室可以直接进行确证试验。,HIV抗体检测,（3）初筛和复检流程,HIV抗体检测,注意事项不要使用过期试剂(优先使用效期短的试剂)；超过有效期的试剂灵敏度明显下降，超过时间越长下降越明显。在同一次试验中不同批次试剂不得混用；使用试剂前放置30分钟平衡至室温；试剂存放：试剂在室温放置24小时后灵敏度开始下降，放置时间越长、室温温度越高灵敏度下降越明显；仔细操作，避免污染；加热、紫外线、强酸和强碱改变结合物酶活性；不要让任何金属因素接触到酶结合物或底物溶液；使用完全清洗和去离子水漂净的玻璃/塑料器皿，最好是一次性的；,HIV抗体检测,实验过程中任何一步缩短时间灵敏度都明显下降，如果同时缩短每一步反应时间灵敏度下降更显著洗板后和加样前，不要使板孔暴露在空气中时间过久，避免酶标板变干。未用完的酶标板需密闭于原铝箔袋内，防止受潮且保存于2-8冰箱内； 尽量保持前后孔温育时间一致，手工操作中，加样板过多造成加样后放入孵箱前等待时间过长(特别是室内温度较高时)；全自动酶标仪也存在同样的问题，孵浴时间差距较大。标本较多时，请分批操作。移液器应精确、经过校准；严格按照说明书操作，计算临界值；,HIV抗体检测,洗板是ELISA操作的重要环节，手洗条件一致性较差，对结果影响较大，全自动洗板机使用不当也会影响结果，血清中残留的的纤维蛋白丝或洗涤液析出的结晶易使洗板机针小孔处于阻塞状态，造成未结合标记酶洗脱不彻底，抽吸不完全；洗板不畅，导致洗板效果差。导致“花板”造成假阳性或假阴性；洗液量不足，保证洗液注满各孔 。采用手工洗板,孔与孔之间液体交叉。采用半自动洗板机洗板时，洗液量不足，导致洗板不彻底；反应板过多造成洗板等待时间长。及时更换吸水纸，尤其是拍过酶标记物的吸水纸一定要弃去，否则可能影响试验结果。严格按照说明书建议的洗板次数.,HIV抗体检测,显色一般来说，显色时间过短，结果偏低；显色时间过长，空白增高或者非特异性显色增加。 显色剂配制后放置时间过长或使用过期显色剂；尤其是国产试剂。尽量临用时配置。坚持不用过期显色剂，肉眼可见浅蓝色的TMB显色剂不用；,HIV抗体检测,处理试剂和样品操作时带一次性防护手套，操作结束请洗手；不要用嘴吸吸管取样品和试剂；HIV Ag阳性对照试剂盒一般已灭活，但依然要以感染性废弃物处置；针对检验样品，因已知的检验方法不能保证其中没有传染性物质存在，对这些标本依照常规的传染性标本操作处理；与样本、试剂和洗液直接接触的任何设备，应认为是被污染的，均需要消毒处理；,HIV抗体检测,避免样品和含有样品的溶液溅出，小范围溅出立即进行消毒处理和清洗；稀释液、显色液、终止液应避免与皮肤和粘膜接触（毒性、刺激性或烧伤）；有些试剂以叠氮钠为防腐剂，叠氮钠可与实验室管道形成叠氮铜活叠氮铅。这类叠氮物具有爆炸性，为了预防这类叠氮物的形成，含有叠氮物的溶液灭活后经下水道处理时，应用大量的水冲洗管道。,HIV抗体检测,常见问题：显色淡，灵敏度偏低试剂盒在运输途中时间太长，温度太高试剂盒未充分平衡培养箱温度不足37保温时间不足洗涤时冲击力太大、浸泡时间过长、洗涤次数增加移液器吸液量不足，吸嘴内壁挂水太多或内壁不清洁漏加试剂或底物作用时间不足,HIV抗体检测,背景深，全部呈有色洗涤不充分，洗后未拍干，样品中其它成分残留或酶标记物残留 样品污染培养箱温度超过37或反应时间过长吸嘴重复使用，未洗净或消毒不彻底酶等试剂混用一次实验的标本量过多，加样时间太长，导致实际反应时间延长,HIV抗体检测,出现白板，阳性对照不显色显色液变质洗涤液配制有误-按说明书所示稀释倍数配制未加酶结合物 终止液误作洗涤液稀释或当底物液使用,HIV抗体检测,常用筛查检验方法的局限性低滴度的HIV抗原或抗体在感染的初期不能被检出，阴性结果还不能完全排除HIV感染。高灵敏度的ELISA试剂引起假阳性率高。,HIV抗体检测,（4）筛查/复检试验结果的报告HIV抗体筛查试验用附表1进行报告，阴性反应报告为“HIV抗体阴性（-）”；阳性反应报告为“HIV抗体待复检”。 HIV抗体复检试验用附表2 进行报告，两次检测均阳性或一阴一阳报告为 “HIV抗体待查”。 “HIV抗体待确证”；两次检测均阴性报告为“HIV抗体阴性（-）”。 HIV抗体复检报告需由1名检验人员和1名审核人员签字。,HIV抗体检测,送检确证试验样本的一般要求1各筛查实验室检测阳性标本送确证，必要时采集第二份血样，为未经检测的标本，每管标本血清（血浆）量不得少于500微升。送检样本管壁上必须有受检人的姓名，并与送检单上的姓名保持完全一致。对于确实无法获得姓名的特殊标本，样本管上的编号必须与送检单上的编号一致。,HIV抗体检测,2送检标本时必须同时附有送检单。送检单应采用芜湖市疾病预防控制中心统一规定的送检单格式。送检单上的各项信息要尽可能详细，要有姓名、身份证号码、性别、年龄（不得擅自改为出生年月）、电话、现住址、户籍所在地、送检人群、国籍或民族、职业、婚姻状况、文化程度。特别是酶标反应光密度值大于临界值6倍的强阳性标本送检时，送检单上一定要有姓名、性别、年龄、地址和送检人群的详细资料。确实无法获得相关信息的要在备注栏中说明原因。,HIV抗体检测,送检单中地址一栏按照省市（地区）县乡（镇、街道）行政村（居民委员会）自然村门牌号的顺序填写，中间不得省略。对于非本省户籍的外来人员，在填写地址时要注明其户籍所在地。婚姻状况分为已婚、未婚和离异，不得随意填写；年龄要填写清楚，不得写“成”；严禁在送检人群中填写“高危人群”、“性乱人群”等笼统不规范的用语。,HIV抗体检测,确证流程使用HIV-1/2混合型试剂进行检测，如果呈阴性反应，则报告HIV抗体阴性（）；如果呈阳性反应，则报告HIV-1抗体阳性（）；,HIV抗体检测,如果不是阴性反应，但又不满足阳性判断标准，则报告HIV抗体不确定（）。结合流行病学资料，可以在4周后随访检测，如带型没有进展或呈阴性反应，则报告阴性；如随访期间出现阳性反应，则报告阳性；如随访期间带型有进展，但不满足阳性标准，应继续随访到8周。如带型没有进展或呈阴性反应则报告阴性；满足HIV抗体阳性诊断标准则报告阳性，不满足阳性判断标准可视情况决定是否继续随访。随访期间可根据需要，检测病毒核酸或P24抗原作为辅助诊断。如果出现HIV-2型的特异性指示条带，根据实际情况需用HIV-2型免疫印迹试剂再做HIV-2的抗体确证试验或HIV-2核酸检测，以进一步明确HIV-2感染状态，疑难样品送国家艾滋病参比实验室进一步分析。,HIV抗体检测,HIV有3种抗原，即核心抗原（core antigen, gag，包括P55、P24和P17）、包膜抗原（envelope antigen, env，包括Gp160、Gp120和Gp41）、逆转录酶抗原（endonuclease polymerase antigen, pol，包括P66、P51和P31）。HIV感染窗口期后，在感染者血清中可检测出多种结构蛋白引起的相应抗体，均为IgG抗体。,HIV抗体检测,HIV抗体检测,HIV抗体确证报告由检测者，复核人员和签发人员签字后，按原送检程序反馈一式三份（确证实验室一份、送检单位一份、患者一份）。如确证对象户口不属于本辖区，确证报告应同时抄送感染者户口所在地的省艾滋病确证中心实验室。其它系统确证的地方人员，也应及时向当地卫生行政部门和省艾滋病确证中心实验室报告。,HIV抗体检测,省艾滋病确证中心实验室难以确证的样品，送国家艾滋病参比实验室确证。同一受检对象的样品在不同实验室得到不一致的确证结果时，由国家艾滋病参比实验室予以仲裁。,HIV抗体检测,除上述常规检测程序以外，对HIV高流行地区高危人群的VCT检测，可采用替代策略。 HIV感染产妇所生儿童HIV抗体检测策略及流程,HIV抗体检测 质量