RhoCmiRNA真核表达载体的构建及其在卵巢癌细胞系中稳定表达.doc

RhoCmiRNA真核表达载体的构建及其在卵巢癌细胞系中稳定表达作者：潘颖,毛丽君,孙艳霞,任淑萍,施恒亮,朱单位：吉林大学第三临床医院妇产科，吉林 长春【摘要】目的 体外合成RNA干涉小分子构建pcDNATM6.2GW/EmGFPRhoCmiRNA真核表达载体，分析其在人卵巢癌细胞SKOV3中稳定表达情况。方法 设计并合成单链oligo，经退火形成双链的DNA oligo，将其与线性的pcDNA6.2GW/EmGFPmiR质粒连接，构建重组质粒pcDNATM6.2GW/EmGFPRhoCmiRNA真核表达载体，经扩增、筛选、鉴定及测序后，用脂质体法将重组质粒转染SKOV3细胞，筛选稳定转染细胞系、观察转染细胞的形态并进一步通过Western印迹法检测细胞内RhoC蛋白表达。结果 重组质粒进行PCR鉴定及DNA序列测定证实DNA oligo已被成功连接到载体中并且序列完全正确；经重组质粒转染的SKOV3细胞24 h后的荧光显微镜下观察到少量细胞带有绿色荧光信号，RhoCmiRNA稳定转染的SKOV3细胞形态变圆，折光性增强，收缩不铺展。Western印迹结果显示，与SKOV3细胞株及pcDNATM6.2GW/EmGFPmiRneg细胞相比，pcDNATM6.2GW/EmGFPRhoCmiRNA细胞中RhoC蛋白表达水平明显降低，表明所设计的RhoCmiRNA能有效抑制SKOV3细胞中内RhoC蛋白表达。结论 该实验成功构建了RhoCmiRNA真核表达载体pcDNATM6.2GW/EmGFPRhoCmiRNA，利用脂质体法将其转染卵巢癌细胞后，能有效地抑制细胞内RhoC蛋白表达，为进一步研究RhoC的功能及探讨以RhoC为靶点的基因治疗提供了研究平台。【关键词】 卵巢肿瘤；RhoC蛋白；小分子干扰RNA(RNAi)；真核表达载体Construction of RhoCmiRNA eukaryotic expression vector and its stable expression in ovarian carcinoma cellPAN Ying，MAO LiJun，SUN YanXia,et al.Department of Gynecology and Obstetrics，ChinaJapan Union Hospital，Jilin University，Changchun 130033，Jilin，China 【Abstract】Objective To construct the eukaryotic expression vector pcDNATM6.2GW/EmGFPRhoCmiRNA and analyse its expression in ovarian carcinoma cell SKOV3.Methods Singlestrand oligo was synthesed and ligated with linear pcDNA6.2GW/EmGFPmiR to construct recombinant plasmid pcDNATM6.2GW/EmGFPRhoCmiRNA，after amplification，screening，determination and sequencing，it was transfected into SKOV3 cells.Screening was conducted to acquire the stable transfection strain and the expression of RhoC was confirmed by Westernblot.Results DNA oligo was successfully ligated with the expressing vector by DNA sequencing.SKOV3 cells were observed with green color after the transfected recombinant plasmid into the cells for 24 h under fluorescence microscope.The expression level of RhoC in SKOV3 cells transfected with pcDNATM6.2GW/EmGFPRhoCmiRNA was significantly decreased compared with that of SKOV3 cells and those transfected with pcDNATM6.2GW/EmGFPmiRneg.Conclusions The eukaryotic expression vector pcDNATM6.2GW/EmGFPRhoCmiRNA is successfully constructed and it can inhibit the expression of RhoC effectively，which provide a research platform for the gene therapy targeting at RhoC and functional research on RhoC. 【Key words】Ovarian carcinoma；RhoC；RNAi；Eukaryotic expression vectorRNA干扰(RNAi)是存在于真核生物体内的一种自我保护现象，能对抗外援导入或病毒基因的mRNA侵害，也能降解自身异常基因的mRNA。高效特异地阻断基因是RNAi的一个重要特征。在小鼠和人的体外培养细胞中利用RNAi技术已成功地阻断了基因表达，实现了细胞水平的基因敲除1。已有研究表明，卵巢癌细胞中RhoC基因过度表达是一种不良的预后指标，提示卵巢癌侵袭性增强，易发生转移，患者的生存率降低2，3。本实验运用体外转录合成的小分子RNAi方法筛选出特异性RhoCmiRNA，通过脂质体转染入人卵巢癌细胞株SKOV3细胞中，观察其对SKOV3细胞中RhoC基因表达的影响，并建立稳定转染卵巢癌SKOV3细胞系，为进一步研究RhoC基因在SKOV3的作用奠定基础。1 材料与方法1.1 细胞和主要试剂 SKOV3（吉林大学中日联谊医院中心实验室冻存）；大肠杆菌top10感受态细胞（东北师范大学分子生物实验室）；质粒pcDNATM6.2GW/EmGFPmiR、通用阴性对照质粒pcDNATM6.2GW/EmGFPmiRneg、Lipofectin 2000试剂盒及灭菌素（均为Invitrogen公司产品）；质粒小提试剂盒和DNA回收凝胶试剂盒（均为联星生物公司产品）；细胞培养用的RPMI1640培养基、新生牛血清（Gibco公司）；壮观霉素（博大泰克公司）；羊抗人RhoC多克隆抗体（Santa Cruz公司）。1.2 设计并合成单链oligo 编码RhoCmiRNA的DNA插入序列两对,使用Invitrogen的RNAi 设计软件进行单链oligo的设计，在给出的10对oligo中选择2对，序列如下：上游引物：5′TGCTGATAGTTCTCAAAGACAGTAGGGTTTTGGCCACTGACTGACCCTACTGTTTGAGAACTAT3′，下游引物：5′CCTGATAGTTCTCAAACAGTAGGGTCAGTCAGTGGCCAAAACCCTACTGTCTTTGAGAACTATC3′。 上游引物：5′TGCTGATGAGGATGACATCAGTGTCCGTTTTGGCCACTGACTGACGGACACTGGTCATCCTCAT3′，下游引物：5′CCTGATGAGGATGACCAGTGTCCGTCAGTCAGTGGCCAAAACGGACACTGATGTCATCCTCATC3′。1.3 RhoCmiRNA质粒构建 将从上海生物公司合成的这2对单链DNA oligo进行退火，形成双链的DNA oligo。4%琼脂糖电泳鉴定退火产物（500 nmol/L），如图1所示，说明得到了退火后的双链DNA oligo。将2对退火产物分别与线性pcDNA6.2GW/EmGFPmiR质粒连接，转化大肠杆菌top10中。挑取单克隆菌落，扩增后提取质粒，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒。PCR反应体系如下：预混的taq酶12.5 μl、正向引物1 μl、反向引物1 μl、质粒DNA 1 μl、去离子水9.5 μl，总体积25 μl。PCR反应条件：95预变性5 min，94变性50 s；50,30 s；72，20 s，循环30次。72，8 min。4保温。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定，凝胶成像系统拍照。进一步DNA测序鉴定。1.Marker；2.阳性对照；3.样本1；4.样本21.4 脂质体法将质粒转染SKOV3细胞 6孔板中，将细胞培养至密度为80%90%，更换新鲜的培养基。取4 μg 重组鉴定质粒加入250 μl培养基中，加入10 μl脂质体，混匀，室温避光静置20 min，慢慢加入细胞板中。37，5% CO2培养24 h后，荧光显微镜下观察到少量细胞带有绿色荧光信号，即为被转染的细胞。将6孔板中被转染的细胞以15的比例于10 cm细胞培养板中传代，加入5 μg/ml灭菌素进行筛选。隔3 d更换含有筛选剂的培养基，并观察细胞生长的状况。到单个带有绿色荧光的细胞生长成一团细胞时，挑取单克隆的细胞，以每孔12个细胞的密度接种至96孔板中培养。1.5 细胞内RhoC蛋白表达 采用Western印迹法，严格按试剂合操作说明进行。2 结果2.1 重组质粒的PCR鉴定及DNA序列测定 将重组质粒进行PCR鉴定，经1.5琼脂糖凝胶电泳后，在200300 bp处出现一条目的片段，表明DNA oligo已被成功连接到载体中，并且测序结果表明与设计的序列完全一致（见图2）。2.2 间接免疫荧光检测细胞形态 重组质粒用脂质体法转染SKOV3细胞，24 h后，荧光显微镜下观察到少量细胞发出绿色荧光信号。RhoCmiRNA稳定转染SKOV3细胞形态变圆，折光性增强，收缩不铺展（见图3）。2.3 Western印迹法检测RhoC蛋白表达 与SKOV3细胞株及pcDNATM6.2GW/EmGFPmiRneg细胞相比，pcDNATM6.2GW/EmGFPRhoCmiRNA细胞中RhoC蛋白表达水平明显降低，这一结果说明所设计的RhoCmiRNA能有效抑制SKOV3细胞中内RhoC蛋白表达（见图4）。3 讨论 Rho，主要包括3个亚家族（RhoA，RhoB，RhoC），在细胞的信号转导通路中起着重要作用4，在肌动蛋白骨架的构建、增殖、黏附变形、游走，细胞周期调控及基因转录等许多基础生命活动中起关键作用5。近年研究发现，Rho亚家族蛋白的异常表达在肿瘤的发生发展中发挥重要作用6，尤以RhoC研究更深入，RhoC与下游的效应分子作用，通过多种信号转导通路参与肿瘤的恶性转型、浸润转移及血管生成7等多方面过程，因此，RhoC有望成为判断恶性肿瘤侵袭转移潜能及预后的新指标8，对其进一步研究也将成为非常有希望的肿瘤基因治疗的新靶点911。 RNAi能够使细胞内同源mRNA特异性降解，进而使该基因表达沉默。本研究构建的RhoCmiRNA表达载体转染卵巢癌SKOV3细胞后，其转录产物在切割酶Dicer的作用下产生发卡状的RhoCmiRNA，进而特异性导致RhoC mRNA降解，达到降低RhoC基因产物的目的。 Horiuchi2的研究显示RhoC在卵巢良性肿瘤、卵巢癌及癌旁组织中有表达，卵巢癌中RhoC mRNA水平明显高于卵巢良性肿瘤中的水平，且恶性程度高者RhoC mRNA水平明显高于恶性程度低者，伴有转移的卵巢癌RhoC mRNA水平明显高于原发性卵巢癌，该结果提示RhoC的表达水平可反映肿瘤的转移潜能。韩志强3等用RTPCR和Western印迹研究RhoA、RhoC及ROCK1在卵巢癌细胞中表达情况，结果表明仅RhoC的表达水平与癌细胞侵袭力呈正相关。综上所述，RhoC在卵巢癌的发展、侵袭及转移中起着关键作用。本研究成功构建了真核重组表达载体pcDNATM6.2GW/EmGFPRhoCmiRNA，为进一步研究RhoC的功能及探讨以RhoC为靶点的基因治疗奠定了基础。【参考文献】1 Miliner J.RNA interference for treating cancers caused by viral infectionJ.Expert Opin Biol Ther，2003；3:45967.2 Horiuchi A，Imai T，Wang C,et al.Upregulation of small GTPases RhoA and RhoC，is associated with tumor progression in ovarian carcinomaJ. Lab Invest，2003；83(6)：86170.3 韩志强，张阿丽，吴明富.RhoA、RhoC及其效应分子ROPCK1的表达与卵巢癌细胞系恶性行为相关性的体外研究J.中华肿瘤杂志，2004；26(7):3858.4 Van Aalst L，D′souzaSchorey C.Rho GTPases and signaling networksJ.Genes Devel，1997；11:2295322.5 Qiu RG,Chen J,Kirn D,et al.An essential role for Rac in Ras transformationJ.Nature(Lond)，1995；374:4579.6 Pruittl K，Der CJ.Ras and Rho regulapion of the cell cgcle and oncugenesisJ.Cancer Lett，2001；71(1)：110.7 Ikoma T，Takahash T，Nagano S,et al.A definitive role of RhoC in metastais of orthotopic lung cancer in miceJ.Clin Cancer Res，2004；10(3):11922000.8 Kteer CG，Griffith KA，Sabet MS,et al.RhoCGTPase is a novel tissue biomarker associa