高效液相色谱常见故障

高效液相色谱仪常见故障的断定及解决(一)高效液相色谱仪保留时间变化 1.柱温变化柱恒温，必要时需配置恒温箱 2.等度与梯度间未能充分平衡至少用10倍柱体积的流动相平衡柱 3.缓冲液容量不够用25mmol/L的缓冲液 4.柱污染每天冲洗柱 5.柱内条件变化稳定进样条件,调节流动相 6.柱快达到寿命采用保护柱 (二)高效液相色谱仪保留时间缩短 1.流速增加检查泵,重新设定流速 2.样品超载降低样品量 3.键合相流失流动相PH值保持在37.5检查柱的方向 4.流动相组成变化防止流动相蒸发或沉淀 5.温度增加柱恒温 (三)高效液相色谱仪保留时间延长 1.流速下降管路泄漏,更换泵密封圈,排除泵内气泡 2.硅胶柱上活性点变化用流动相改性剂,如加三乙胺,或采用碱至钝化柱 3.键合相流失同前(二)3 4.流动相组成变化同前(二)4 5.温度降低同前(二)5 (四)高效液相色谱仪出现肩峰或分叉 1.样品体积过大用流动相配样,总的样品体积小于第一峰的15% 2.样品溶剂过强采用较弱的样品溶剂 3.柱塌陷或形成短路通道更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件 4.柱内烧结不锈钢失效更换烧结不锈钢,加在线过滤器,过滤样品 5.进样器损坏更换进样器转子 (五)高效液相色谱仪鬼峰 1.进样阀残余峰每次用后用强溶剂清洗阀,改进阀和样品的清洗 2.样品中未知物处理样品 3.柱未平衡重新平衡柱,用流动相作样品溶剂(尤其是离子对色谱) 4.三氟乙酸(TFA)氧化(肽谱)每天新配,用抗氧化剂 5.水污染(反相)通过变化平衡时间检查水质量， 用HPLC级的水 (六)高效液相色谱仪基线噪声 1.气泡(尖锐峰)流动相脱气,加柱后背压 2.污染(随机噪声)清洗柱,净化样品,用HPLC级试剂 3.检测器灯连续噪声更换氘灯 4.电干扰(偶然噪声)采用稳压电源,检查干扰的来源(如水浴等) 5.检测器中有气泡流动相脱气,加柱后背压 (七)高效液相色谱仪峰拖尾 1.柱超载降低样品量,增加柱直径采用较高容量的固定相 2.峰干扰清洁样品,调整流动相 3.硅羟基作用加三乙胺,用碱致钝化柱增加缓冲液或盐的浓度降低流动相PH值,钝化样品 4.同前(四)4同前(四)4 5.同前(四)35.同前(四)3 6.死体积或柱外体积过大连接点降至最低,对所有连接点作合适调整,尽可能采用细内径的连接管 7.柱效下降用较低腐蚀条件,更换柱,采用保护柱 (八)高效液相色谱仪峰展宽 1.进样体积过大同(四)1 2.在进样阀中造成峰扩展进样前后排出气泡以降低扩散 3.数据系统采样速率太慢设定速率应是每峰大于10点 4.检测器时间常数过大设定时间常数为感兴趣第一峰半宽的10% 5.流动相粘度过高增加柱温,采用低粘度流动相 6.检测池体积过大用小体积池,卸下热交换器 7.保留时间过长等度洗脱时增加溶剂含量也可用梯度洗脱 8.柱外体积过大将连接管径和连接管长度降至最小 9.样品过载进小浓度小体积样品既使日常精心维护的液相色谱仪，随着使用时间的增加或使用者经验不足也会出现一些问题或故障。1.保留时间变化保留时间的变化有三中情况：波动、缩短、延长。保留时间出现波动时，应检查柱温是否处于恒温状态，如果设置为室温，气温的变化会引起保留时间的波动，应该设置为恒定温度;等度和梯度间还没有充分达到平衡状态时，应该用十倍以上柱体积的流动相去平衡色谱柱;缓冲液浓度太低时，应换用25mmol/L的缓冲液;色谱柱被污染或已经接近柱寿命时，应更换保护柱或换新色谱柱。保留时间缩短时，流速增加，应检查流速的设定;柱温高时，应检查柱的设置;进样量太大时，减少样品用量或降低样品浓度;流动相的组成发生了改变，比如流动相中易挥发有机相蒸发，两相之间互溶不好，会导致流动相不均匀或某一相出现部分沉淀;流动相的PH值应保持37.5范围内，否则会引起柱键合相的流失。保留时间延长时，流速减小，应检查流速的设定和管路是否有泄露;柱温低时，检查柱温的设置;流动相的组成发生了改变，比如流动相中易挥发有机相蒸发，两相之间互溶不好，会导致流动相不均匀或某一相出现部分沉淀;检查流动相的pH值是否37.5范围内，否则会引起柱键合相的流失。2.峰拖尾色谱柱超载时，要减少进样量或稀释样品或使用高溶量的色谱柱;色谱柱性能不佳时，更换色谱柱;死体积或柱外体积过大时，将连接降至最低，并对所有连接点作合理的调整，尽可能采用细内径的连接;加入硅羟基，其作用是纯化色谱柱，增加缓冲液的浓度，降低流动相的pH值，纯化样品;出现峰干扰时，应清洁样品，调整流动相。3.峰展宽进样体积过大时，用流动相配样;样品过载时，进小浓度、小体积样品;在进样阀中造成峰扩展时，进样前后排出气泡，以降低扩散;流动相粘度过高时，提高柱温，并采用低粘度流动相;等度洗脱，保留时间过长时，要增加流速或改用梯度洗脱;柱外体积过大时，1将连接管径和连结管降至最小。4.基线噪声流动相或检测器中有气泡时，要对流动相进行脱气处理;检测器灯有连续噪声时，更换氘灯;出现由污染引起的随机噪声时，应清洗色谱柱、净化样品、使用HIPLC级试剂;偶然有噪声时，可能是来自电源的干扰，如果电压不稳时，应采用稳压电源。5.肩峰或分叉进样量太大或样品浓度过高时，要减少进样量或稀释样品;样品溶剂太强时，应使用软弱的样品溶剂;色谱柱性能欠佳时，应更换色谱柱。6鬼峰色谱柱未达到平衡时，要继续平衡色谱柱;样品中溶剂出峰时，使用流动相作样品的溶剂;出现进样阀残余峰时，使用强溶剂清洗进样阀，并改进阀和样品的清洗程序;流动相用水不合格率，应使用HPLC级的水。使用注意事项在使用混合溶剂作流动相时，一定要先混合，再过0.45um滤膜;等流动相恢复至室温，用超声波或He气进行脱气处理后，方可使用。更换流动相时，必须按一定的程序进行，否则会产生问题。更换流动相有三种情况：互溶性流动相的更换、无互溶性流动相的更换和缓冲溶液的更换。对于第一种情况，先用准备更换的流动相把吸滤器完全清洗干净，再打开仪器的排液阀，按清洗键，清洗泵中的流动相。将吸滤器放入新流动相中，减慢流速清洗数分钟后关闭排液阀。接下来清洗色谱柱和检测器检测池直到基线平稳。对于第二种情况，先用与新旧流动相都互溶的中间清洗液(如：异丙醇)清洗，再用新流动相清洗，具体过程与第一种情况相同。对于第三情况，应先用蒸馏水作为中间清洗液进行清洗，再用新流动相清洗即可。问:用HPLC进行分析时保留时间有时发生漂移，有时发生快速变化，原因何在？如何解决？ 答:关于漂移问题： 1.温度控制不好，解决方法是采用恒温装置，保持柱温恒定 2.流动相发生变化，解决办法是防止流动相发生蒸发、反应等 3.柱子未平衡好，需对柱子进行更长时间的平衡 关于快速变化问题 1.流速发生变化，解决办法是重新设定流速，使之保持稳定 2.泵中有气泡，可通过排气等操作将气泡赶出。 3.流动相不合适，解决办法为改换流动相或使流动相在控制室内进行适当混合 问:色质联用中毛细柱的选择应注意什么问题？ 答:1.柱效要高 2.热稳定性好 3.化学惰性强 具体选择应注意 1.柱极性。根据分析样品选择不同极性的柱子进行分析 2.柱子内径。内径大小决定柱容量 3.液膜厚度。分析样品温度不一样，对膜厚有不同要求，温度高液膜要厚，温度低液膜要薄 4.柱长度。柱越长，柱效越高，分离效果越好，但也存在吸附问题，柱子过长，分析时间长，因此要根据样品考虑柱子长度 5.外涂层(柱体)的选择。 6.另外还有仪器型号、分析对象等因素 问:液相色谱中峰出现拖尾或出现双峰的原因是什么？ 答:1.筛板堵塞或柱失效，解决办法是反向冲洗柱子，替换筛板或更换柱子。 2.存在干扰峰，解决办法为使用较长的柱子，改换流动相或更换选择性好的柱子 问：从那些方面可以简单判别毛细管柱子的热稳定性好坏？ 答：1.分配容量(或容量因子)K，好的柱子在高温运行后，分配容量K不应有明显的下降，否则，说明柱子的热稳定性不好 2.理论塔板数n，热稳定性好的柱子经受高温后，理论塔板数应基本保持恒定 3.柱子的极性。热稳定性好的柱子，高温前后极性变化不大，具体表现为保留指数I值没有大的变化。 4.噪声。热稳定性好的柱子在高温下使用后，噪声不能增加。 5.柱子的去活层，毛细管柱子涂固定液前内部一般要用去活性试剂去活以增加惰性。质量好的毛细管柱子高温后，去活层不应该变化，表现在对强极性样品或酸碱性样品的吸附性不能增加。 问：为什么进样器内的玻璃衬套会对色谱行为造成影响？ 答：进样器内的玻璃衬套主要有下列作用： 1.提供一个温度均匀的汽化室，防止局部过热。 2.玻璃的惰性不不锈钢好，减少了在汽化期间样品分解的可能性。 3.易于拆换清洗，以保持清洁的汽化室表面，一些痕量非挥发性组分会逐渐积累残存于汽化室，高温下会慢慢分解，使基流增加，噪声增大，通过清洗玻璃衬套可以消除这种影响。 4.可根据需要选择管壁厚度及内径适宜的玻璃衬套，以改变汽化室的体积，而不用