包涵体的纯化和复性总结.doc

板块一、大肠杆菌（这里讨论的大肠杆菌为非分泌到培养基中的重组蛋白，是否有重组蛋白分泌到培养基中的工程菌我没有见过。）一、关于菌体的量大肠杆菌表达的基因工程蛋白是纯化人员最方便获得的原料，对纯化工艺开发来说几乎没有原料方面的限制。常看到有战友用个几毫升的菌液去做纯化，对此我十分不解，同样要做，为什么不多做点呢？很少的菌体会给纯化带来一些难以估计的问题，工艺的重复性和放大往往出现问题。因此，要做个好工艺就多发酵表达一些菌体吧。我做纯化时，初始工艺摸索用的菌体量一般为10g左右。二、关于是否包涵体表达包涵体的定义我就不讲了。我要讲的是，一个基因工程蛋白是否是包涵体表达的说法本身就不完全准确。至于包涵体在电镜下的晶体颗粒表现等等对我们纯化来说毫无意义，我相信做纯化工艺的人没有谁去看这个电镜，也不关心。我们判断的依据只是SDS-PAGE，目的蛋白在破菌沉淀中，我们就认为是包涵体表达，但这是一个似是而非的结论。看着没问题，实际上是有毛病的。关键在于你用的是什么破菌缓冲液！有些蛋白在用缓冲液A破菌时是在破菌沉淀中，而用缓冲液B破菌时却在破菌上清中。缓冲液A和B的差别可能只是pH上相差1-2个单位。那么它是包涵体表达还是可溶上清表达呢？说这个问题主要在于有些战友往往非常在意他的目标蛋白是否包涵体表达。甚至还有包涵体表达就用专门的包涵体蛋白纯化方法等等。我们应该关心的是目标蛋白在什么缓冲体系下是可溶的，在什么缓冲体系下是不溶的！不要让包涵体这个概念给你误导。三、关于表达量我们常常在发表的文章上看到，我这个工程菌的目标蛋白的表达量达到菌体总蛋白的30%、50%等等。我要说都是文章的作者在忽悠。不知道他们是如何定量的，用的最多的大概就是SDS-PAGE的扫描分析吧。且不说一个SDS-PAGE不能表现出所有的菌体蛋白，电泳的染色方法、染色脱色强度、照片的曝光强度、扫描分析时的条带选择等等无不对这个百分比影响巨大。在公司的QC部门做的对此应该最有体验，20%的条带要它变成30%又有何难？我的观点是对待表达量的描述不可定量，只能定性。如用：很低、较低、中等、较高、很高等来描述。有一个指标与表达量密切相关，那就是单位体积的菌体量。两者的乘积才是单位体积发酵液的目标蛋白产率。与表达量相关的指标还有纯化倍数、纯化收率等，这些指标我们也常常在发表的文章中看到。同样，我也认为都是不准确的。除非你用的是活性测定的方法，用蛋白活性收率来表征。纯化工艺的难易有时候也与表达量相关，表达量高时往往纯化也方便的多。所以，尽量提高你的目标蛋白表达量不只是基因工程上游和产量的问题，还是纯化工艺开发的问题。四、菌体破碎（1）破菌前处理诱导表达的菌体在发酵离心后，最好先用PBS缓冲液或其它缓冲液立即洗涤一次。菌体洗涤可以去除一些培养基中的杂质，及代谢产物，减少对后续纯化的影响。如果菌体已经冻存过，冻融的菌体可能有部分破碎，就不要洗涤菌体了。小量菌体的悬浮可以用5ml的枪头吹打，再磁力搅拌。大量菌体的悬浮可以用分散乳化机。破菌缓冲液的用量一般为110120，即1g湿菌体用1020ml的破菌缓冲液。（2）破菌缓冲液的选择选择何种破菌缓冲液，应该与后续的纯化方法密切相关，不能一刀切。而且，破菌缓冲液还与是否可溶表达相关。对于可溶表达的重组蛋白，一般就选用第一步层析纯化的平衡缓冲液为破菌缓冲液。对于不可溶表达的重组蛋白，最简单的就是选用PBS为破菌缓冲液。在选用破菌缓冲液时，有个小小的trick，加EDTA。有个别重组蛋白很脆弱，在超声破菌时就有大量的降解。注意，不是表达降解，而是超声过程中降解。特别是用pET32表达的his-tag融合蛋白容易降解，我运气好，遇到过2次这种超声降解。第一次碰到时，害得我好苦。反复找原因，是诱导表达温度？是超声温度过高？超声功率？外源蛋白酶污染？最后用EDTA解决了。在破菌缓冲液中加0.5mM的EDTA就不会降解了。推测原因，可能是大肠杆菌自身有那么一种蛋白酶，破菌释放后就正好会攻击我的宝贝蛋白。而这种蛋白酶是金属蛋白酶，加EDTA后把它的枪栓（金属离子）给卸了，我的蛋白小命也就保全了，哈哈。第二次在SDS-PAGE上看到降解时，心里就不慌了。可能有战友会问，his-tag的蛋白加了EDTA后还怎么过Ni柱啊，恭喜你，问对了。我的解决方案是先过离子交换柱。EDTA带负电荷，用Q/DEAE吸附EDTA，或用SP柱吸附目标蛋白后，再透析一下，过Ni柱纯化。爱探险的dora跳着舞，成功啦，you did it！。（3）破菌方法大肠杆菌的破碎方法常用的大概有：反复冻融加溶菌酶法、超声法和压力匀浆法。一般来说处理菌体的量也是这个顺序。冻融方法我不喜欢，处理量太少且费时，要买溶菌酶，还是个外源蛋白。我喜欢强力型的超声和压力匀浆。超声法是小规模和中等规模破碎菌体的首选，选择好相应的超声探头，一次处理菌体量为0.1g-100g。压力匀浆为中到大规模破菌的首选，处理量大、快，破菌效果好，但发热量大，对温度非常敏感的蛋白慎用。超声破菌：以10g湿菌体为例，加入破菌缓冲液100ml，玻璃烧杯中磁力搅拌悬浮充分。冰水浴超声。设置超声时间4s，间隙时间4s，超声功率400-600W，超声次数100-200次。压力匀浆：以200g湿菌体为例，加入4预冷的破菌缓冲液3000ml，用分散乳化机充分混匀。匀浆压力800bar左右，压力匀浆发热非常大，流出液要冰水浴加磁力搅拌。一次匀浆完毕后，让菌液充分冷却后再进行二次匀浆。匀浆完毕的菌液如果粘度比较大，可用超声破碎仪超声40次，打碎核酸减小粘度，以方便离心和纯化。（4）破菌后离心高速冷冻离心机离心，50ml的小管18000rpm，20min，4；500ml的瓶用10000rpm，30min，4。50ml小管的离心效果比500ml的瓶好，如果你的溶液量在300ml以下，还是勤快点，多装几根50ml的小管吧。（5）过滤对上清可溶表达的蛋白在收集破菌离心上清后，必须过滤后才能上柱纯化。在园子里常看到有战友说我的柱流速很慢，层析柱压缩等很厉害，柱头有杂质堵了等等，这多数是因为没有进行过滤操作。过滤一般采用真空负压抽滤，可以选择0.8um的膜或双层滤纸过滤。多数层析的要求都是过柱溶液需经过0.45um的膜过滤，但实际上对破菌后的上清液或包涵体的溶解上清样，0.45um膜太难过滤了，mission impossible，无法完成操作。所以在实际工作中，我们都是采用双层滤纸或0.8um的膜过滤。在此推荐我用的一套设备组合：millipore wp6122050型台式真空压力两用泵和Sartorius 16201不锈钢过滤器，非广告，好用哦。五、包涵体处理前面说过对纯化来说，我不赞成包涵体的提法，但为了表述方便还是不妨借用一下，谁谁在拍砖头啊。（1）包涵体洗涤我的蛋白是包涵体表达，用什么来洗涤啊？此类问题战友常问。其实还真不好回答。用什么溶液来洗涤包涵体也是与后续纯化方法相关的。例如，后面接离子交换层析，洗涤液不能加盐；后面接Ni柱，洗涤液不能加EDTA等等。罗列了一些可用的洗涤液成分如下，根据自己的需求来增减。pH6.0-pH9.0：高pH使得包涵体倾向于溶解，杂蛋白也去除的好些，但高pH有可能使目的蛋白降解。10-50mM PB，10-50mM Tris：维持缓冲环境，后接离子交换时选低一点的浓度。0-0.5N NaCl：盐洗涤有助于核酸的去除，多年前有位做干扰素的可爱老太太教我，盐洗涤后包涵体的OD280/260的比值（溶解后）会升高很多，也就是核酸去除很多，有利于后续纯化。0.5-5mM DTT：提供还原环境，打开蛋白中的二硫键，使得包涵体倾向于溶解，有利于杂蛋白的去除。但浓度太高了使得包涵体真的溶解就不是洗涤了。后续用Ni-IDA柱不可以加，用Ni-NTA柱少加。0-1%beta-ME：同DTT，还原能力稍弱。气味那个香啊0-2N Urea：变性剂，有利于包涵体中氢键、疏水键、范德华力的打开，有利于洗涤去除杂蛋白。同样高浓度会使包涵体溶解。类似的是盐酸胍，更强的变性剂，更高的价格，我等不穷的人也消费不起。当然，你很富就用吧，有时候更有利于包涵体蛋白的线性化。0.05-1%Triton X100：非离子型表面活性剂，像洗衣粉一样用了。同样的还有zwittergent，一种我一直想找机会试试的东东，当年为了溶解beta干扰素包涵体搞得我好苦。0-2mM EDTA：螯合剂，去除金属离子，有利于蛋白的稳定和溶解。Ni柱禁用。其它：期待各路英豪奉献。（2）包涵体溶解看了包涵体洗涤部分，怎么溶解包涵体应该心中有数了。无非就是pH，变性剂，还原剂，表面活性剂等等的组合。经典的包涵体溶解液的配方为：pH8.0，20mM Tris，8M Urea 尿素。说它经典，是因为我用的最多，嘻嘻。再根据个性蛋白纯化的需要往这个配方里面加调料，如Ni柱纯化的咪唑、氯化钠；溶解或吸附不好时再加点DTT、Triton。包涵体的溶解也有两个小Trick，独门秘籍哦。第一，包涵体沉淀在溶解时往往会有一些像硬胶状的块块，有弹性，很难溶。你可以在加变性剂之前，加一点buffer进去，用玻璃棒或硬塑料棒搅成面糊糊，尽量不要有大块块。然后再加变性剂磁力搅拌溶解，要溶解迅速得多哦。第二，可以借助超声来溶解。像超声破菌一样操作，超声次数30-50次。超声不仅仅是有利于包涵体溶解，还有一个功效就是打断核酸，降低粘度。这对离心和过滤很重要，很重要。我们在溶解包涵体后往往离心倾倒上清时，溶液很粘，一不小心底部的沉淀就跟出来了；还有过滤时滤不动。这都是没有超声的原因。六、纯化方法领袖说过：不管黑猫白猫，抓到老鼠就是好猫。对纯化来讲，能拿到纯度好的蛋白，符合你纯化的要求就是硬道理。纯化方法不好讲，各种蛋白不一样，纯化工艺自然不同；即使相同的原料也有不同的纯化方案。纯化的方法我们有层析、沉淀、萃取、透析、超滤等等。柱层析是纯化最强有力的手段，几乎每种蛋白的纯化都会用到层析。各种层析方法：如亲和、离子交换、疏水、反相、分子筛等等都是我们工艺宝库里的吃饭家伙。不知道怎么吃啊，没办法了，你还是先去补一补基础知识吧。GE公司的一套书个人认为是最佳的入门资料，如Recombinant Protein Purification，Affinity Chromatography，Ion-Exchange chromatography，Gel Filtration，等等，在GE的网站上应该能下载到，或者干脆打个电话给GE的销售员或技术支持，请他给你一个光盘就什么都有了。在做纯化之前，我们需要知道一些待纯化蛋白的信息。如蛋白质序列，载体类型，理论等电点，理论分子量，疏水性等等，这些都是computer paper work，电脑上查查就有了。如果还能查到一些与目标蛋白纯化相关的文献也不错，不过没有也没关系。我是较少查文献的，奉行的原则是：与其看不如自己做，看了也难以做出来，做不出来了再去看。我就是一个工匠，操作工，而不是做科学的哦。这也是我对纯化的看法，好听一点的就是实践的科学，哈哈。查文献的目的不在于copy它的纯化工艺，这是新手最最常犯的毛病，以为copy文献就能完成纯化工艺了。要知道文献的真实性是有一点折扣的，作者的原料和纯化的目的与你也不相同。查文献的主要目的在于了解你要纯化的蛋白的性质，它的一些检测方法，特别是有关于活性的检测方法。怎么讲这一节呢？各种纯化的原理我就不讲了，也不可能有瑞典老兄书上讲得好（GE层析的根在瑞典的uppsala），还是举例来说明吧，做一些简单的分析。讲两个实例，一个是可溶表达的蛋白，一个是不可溶表达的蛋白。（一）、可溶表达的蛋白A1、computer paper work：大肠杆菌BL21，pET32a载体融合表达，N端融合Trx（硫氧还蛋白109aa）和his6-tag（共49aa），DDDDK肠激酶位点后为需要的目标蛋白A，融合蛋白的分子量为21.2kd，Trx（DDDDK前）的分子量为17.1kd，蛋白A的分子量为4.1kd，蛋白A稳定性好，水溶性好，融合蛋白的理论等电点为5.9，Trx（DDDDK前158aa）的理论等电点为5.4，蛋白A的理论等电点为9.7。2、纯化要求符合重组药用蛋白要求，SDS-PAGE纯度大于95%，HPLC纯度大于95%，Western Blott单一条带，去除内毒素。3、纯化设计分析此为一典型的小分子蛋白融合表达实例。由于有his6-tag融合可溶表达，可以采用Ni柱来进行初步纯化。融合蛋白的理论等电点为5.9，可以考虑用Q柱、DEAE柱来吸附纯化。融合蛋白需要酶切去除融合片断，要做肠激酶酶切工艺。蛋白A的理论等电点为9.7，可以考虑用SP柱来吸附纯化。酶切后的蛋白纯化可利用his-tag和pI的差异。目标蛋白的分子量较小，有可能试一试反相纯化。纯化样品要求去除内毒素，可以用Q柱、DEAE柱来吸附内毒素。4、纯化流程（1）破菌离心：采用pH8.0，20mM PB，0.5N NaCl缓冲液超声破菌，离心上清过滤后，量体积，加咪唑至55mM，调节pH为8.0。点评：破菌缓冲液先不加咪唑，是为了更精确的保证咪唑的浓度，因为破菌过程中，菌体内液体的释放会稀释咪唑浓度。同理，上柱前的样品要调节pH，因为破菌会使样品的pH下降，细心的话，检测一下，可见pH会从8.0下降到7.7-7.8左右。55mM咪唑浓度是经过了分段洗脱优化的结果，最大程度地保证目标蛋白吸附，而杂蛋白穿透。做优化时，起始的咪唑浓度一般选择10-20mM咪唑，5-10mM分段加上去。（2）Chelating Sepharose FF柱纯化：pH8.0，20mM PB，0.5N NaCl，55mM咪唑缓冲液平衡后上样；相同缓冲液淋洗完全至基线；150mM咪唑，pH8.0，20mM PB，0.5N NaCl洗脱融合蛋白；250mM咪唑，pH8.0，20mM PB，0.5N NaCl洗脱杂蛋白。点评：Chelating Sepharose FF填料是Ni-IDA类型的介质，最大的好处就是可以反复再生使用，特别是脱镍后用NaOH洗柱可以有效地去除内毒素，彻底将填料清洗干净。150mM咪唑洗脱融合蛋白也是前期分段洗脱优化的结果，综合考虑了纯度和收率以及收样体积的因素。更低的咪唑浓度，如100-120mM咪唑也可将融合蛋白洗脱下来，但是洗脱峰很拖尾，纯度虽然好一些，可收样体积要大许多，收率也略低。250mM咪唑洗脱杂蛋白不是此工艺中的要点。实际上，我们在操作过程中往往没有此步骤，就直接用EDTA将柱脱镍再生了。镍柱在上样后的缓冲液淋洗阶段，峰往往很拖尾，要耐得住性子，让它淋洗完全。此柱的融合蛋白载量大约为20mg/ml。不同的镍柱，不同的蛋白，载量也是不同的。经过一步Chelating Sepharose FF纯化，融合蛋白的SDS-PAGE纯度大约为90%。（3）Sephadex G-25（fine）换液pH8.0，20mM PB做缓冲液置换。更换Chelating柱洗脱融合蛋白的溶液体系，使得适合肠激酶酶切的要求。点评：Sephadex G-25（fine）的上样量大约为柱体积的30-35%，有轻微的纯化作用，有时候可以去除一些电泳上看不到的小分子杂质。在酶切之前，本例也做过Q柱吸附纯化融合蛋白试验，吸附没问题，也能做到进一步的纯化。只是后来在工艺整合过程中发现此步不是必需的，就省略掉了。（4）肠激酶酶切酵母表达的重组牛肠激酶，酶切用量每16mg融合蛋白用肠激酶1个单位，酶切体系为pH8.0，20mM PB，酶切温度35-37，酶切时间16小时。点评：商品化的肠激酶有多种，有生化提取的，有重组大肠杆菌的，还有就是重组酵母表达的，其中以重组酵母表达的肠激酶活性最高。此处的肠激酶活性单位为Invitrogen公司产品标准，定义可以参考Invitrogen公司的EKMax manual，不过Invitrogen公司的推荐参考量太低了，它的标准是1个单位20ug融合蛋白，哈哈。Invitrogen公司的标准酶切体系是50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM CaCl2, and 0.1% Tween-20。本例中没有加CaCl2和Tween-20，试验表明无明显影响。如果你的融合蛋白不好切，可以考虑增加这两项。此处的酶切用量标准由酶切梯度试验获得。即固定融合蛋白量，加入不同单位的肠激酶，SDS-PAGE比较酶切效果。取融合蛋白酶切约80-90%的量。可能有人会问，为什么不是95-100%？做过酶切梯度的就会知道，这个10%量的增加是以酶量成几倍增加才能实现，而且酶量越大，非特异性切割的可能性就越大。酶切时间取16小时是因为下班前加好酶，第二天上班时正好是16个小时，符合我等工作节奏哦。酶切可置于恒温摇床上进行，转速开得缓慢点。小量酶切就放在恒温培养箱中。（5）Q Sepharose FF柱纯化pH8.0，20mM PB平衡Q柱，上样酶切后样品，目标蛋白穿透，未酶切的融合蛋白和Trx-histag吸附于柱上。点评：此步纯化很简单，仅仅是个流穿纯化，但效果非常好。Q柱不仅去除了绝大部分的杂蛋白，而且还去除了内毒素和酶切时加入的肠激酶。Q柱在平衡前要用0.5N的NaOH洗柱以去除内毒素，平衡缓冲液要用注射用水配制且通过3kd的超滤膜来去除缓冲液中的内毒素。样品在上Q柱前，要进行过滤操作。酶切过程中会有少量的沉淀产生，可能是因为我没有往酶切体系中加0.1% Tween-20。药用蛋白不敢随便加表面活性剂，否则要在QC中验证工艺可以完全去除。酶切加入的肠激酶就必须做去除的QC验证，这是后话了。Q/DEAE类型的阴离子交换柱是纯化中应用最广泛的操作。因为大部分蛋白质的等电点在中性或偏酸性，阴离子交换柱可以吸附纯化。换而言之，如果你的目标蛋白等电点比较高，那么恭喜你了，纯化要方便多了。还不明白？你的目标蛋白与众不同啊，就像本例中的蛋白A，用Q柱可以高效的穿透纯化。酶切后经过Q柱纯化，蛋白A的SDS-PAGE纯度可以达到95%以上，基本上看不到明显的杂带。但做反相HPLC检测，纯度只有85%左右。由于两种检测方法的原理不同，样品中可能含有一些小分子的杂质，电泳检测不到，而反相HPLC可以检出。还有一个可能，就是酶切毕竟是个蛋白酶的水解过程，特异性再好也有错切的时候。也许有少量的蛋白A被多降解了几个氨基酸。另外就是目标蛋白质本身可能有高级结构方面的差异。回想起来，那可是一段沮丧的日子。*尚未成功，同志仍需努力。（6）SP Sepharose FF柱纯化pH5.8，20mM PB平衡SP柱，Q柱穿透样小心调节pH5.8后上样SP柱，目标蛋白吸附于柱上。 pH5.8，20mM PB，90mM NaCl洗脱杂蛋白峰。然后从90mM300mM NaCl做线性梯度洗脱。分段收集洗脱峰，HPLC检测。点评：此步SP柱纯化是关键性步骤，使得目标蛋白从SDS-PAGE纯度95%上升到HPLC纯度大于95%。一般对离子交换