芦荟植物中大黄素成分的提取分离方法的研究.doc

芦荟植物中大黄素成分的提取分离方法的研究摘 要：芦荟的活性成分蒽醌类化合物，因其具有抗氧化、抑菌、抗突变等多种药理活性而被广泛关注，本文以芦荟中的蒽醌类化合物为目标，系统地研究了芦荟中大黄素成分的提取、分离及纯化的工艺条件，为芦荟资源开发利用提供实验数据和理论依据。关键词：芦荟；蒽醌类化合物；大黄素；提取分离1 芦荟简介芦荟(Aloe)隶属百合科，是一种百合科多年生常绿肉质草本植物，叶簇生，呈座状或生于茎顶，叶常披针形或叶短宽，边缘有尖齿状刺。花序为伞形、穗状、圆锥形等，色呈红、黄或具赤色斑点，花瓣六片、雌蕊六枚。花被基部多连合成筒状。芦荟原产于非洲热带干旱地区，现在芦荟分布几乎遍及世界各地。据调查，在印度和马来西亚一带、非洲大陆和热带地区都有野生芦荟分布。在我国云南元江地区，也有野生状态的芦荟存在。芦荟的最早记载，是古代埃及的医学书中所记录的，书中不仅记载了芦荟对腹泻和眼病的治疗作用，还有包含了芦荟的多种处方。在此以后，通过马其顿帝国，芦荟被传到了欧洲。之后，芦荟又通过丝绸之路传到了中国。在我国，人们把它称为“芦荟”，“芦”其中文意为黑的意思，而“荟”是聚集的意思。芦荟叶子切口滴落的汁液呈黄褐色，遇空气氧化就变成了黑色，又凝为一体，所以称作“芦荟”。被称为中医医祖的李时珍所著本草纲目里也出现了芦荟，在这部书中芦荟不仅仅被认作是有用的植物，而且还有“色黑、树脂状”的记载。在我国古代，应用芦荟治疗疾病已相当流行，关于芦荟的药用价值和治疗作用，在古书药性论、海药本草、开宝本草、本草图经、本草再新中均有详细记载。芦荟苦寒，入肝、心、脾。主要成分分为芦荟大黄素甙、异芦荟大黄素甙、芦荟甙等，具有泻下通便、清肝泄热、消疮杀虫的功效，用于治疗热结便秘、癣疮、痔瘘、萎缩性鼻炎等。芦荟自古以来深受人们的喜爱，在民间的应用己有3600多年的历史。随着现代科学技术的突飞猛进，芦荟的有效成份、生理活性物质、药用价值不断被发现和应用，芦荟的研究开发和应用已进入一个崭新时代1。从80年代开始，芦荟的多种疗效和神奇功效，引起了世界上许多国家的瞩目,被视为治病强身的“灵仙之药”。如：在美国，用芦荟治皮炎；在前苏联，用芦荟治肺结核；在埃及，用芦荟治皮脂外溢；在日本，用芦荟叶子的活性物质制成消毒剂，用于清洁污染，阻止真菌生长，芦荟被誉为“家庭急救药箱”，曾掀起过一股“芦荟热”的浪潮2-3。在现在世界上芦荟品种多达300种以上，但主要药用品种是百合科植物库拉索芦荟、好望角芦荟)和斑纹芦荟三种。芦荟的叶、花、根均可入药，尤以叶中的汁液经浓缩加工的成品(芦荟干块)即为芦荟的药用品。2 芦荟的化学成分芦荟之所以能够医治多种疾病，受到医药界的高度重视，决非偶然，这是与芦荟的化学成份有关的。现代药理研究结果表明，芦荟鲜叶所含的成分十分复杂，到目前为止研究工作者己经从芦荟属植物中检测出18种微量元素、11种游离氨基酸、21种有机酸、维生素、缓激肤、蒽醌类、酚类、甙类、糖类等70余种成分。但根据现代研究分析表明，芦荟的主要化学成分可以分为六大类：蒽醌类化合物、糖类化合物、蛋白质及氨基酸类化合物、脂类及有机酸类化合物、矿物质类化合物以及维生素、活性酶等其他类化合物等4。2.1 蒽醌类化合物芦荟中主要活性成份是轻基蒽醌类衍生物，包括芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、芦荟甙、芦荟泻素、芦荟霉素、阿劳辛、芦荟熊果试等。芦荟所含蒽醌类化合物的种类和数量，在不同的品种、栽培条件、收获时期都会有较大变动。大黄酸有抑菌、抗病毒作用，大黄素、芦荟大黄素有抗肿瘤的作用，芦荟酸和芦荟泻素的药用价值为健胃和通便，芦荟霉素具有抗癌、抗病毒、抗菌的作用。阿劳辛有抗癌、抗菌、中和毒素的作用，还有具有抗菌作用及抗霉作用，可以治疗因水疱所引起的白癣菌，芦荟熊果甙具有抗溃疡的药用功能5。2.2 糖类这里是指芦荟所含的葡萄糖、甘露糖以及由它们组成的多糖。芦荟叶肉中的粘液主要成份是甘露聚糖，这是一种线性多糖聚合物，不同种属的芦荟所含葡萄糖和甘露糖的比例不同，但葡萄糖和甘露糖都连接成线性聚合物，此外，也发现在一些芦荟品种的叶肉汁液中含有少量的阿拉伯糖和鼠李糖。芦荟多糖对于癌症和爱滋病的防治有良好作用。芦荟甘露聚糖具有抗肿瘤的作用。芦荟多糖在提高人类免疫力方面的作用最近引起了人们极大的重视。2.3 氨基酸 芦荟叶片中的蛋白质经水解后可产生丙氨酸、赖氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、精氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、谷氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸等多种氨基酸，其中含有8种人体必需氨基酸，组成较为合理。2.4 脂类及有机酸 芦荟的根、茎、叶中均含有多种有机酸。其中已检出的有机酸有琥珀酸、苹果酸、乳酸、对香豆酸、酒石酸、丁二酸、异柠檬酸、柠檬酸、乙酸、辛酸、壬烯二酸、月桂酸、十三烷酸、十四烷酸、十五烷酸、十六烷酸、十七烷酸、十八烷酸、油酸、亚油酸、亚麻酸等。这些有机酸大多与钾、钠、钙等离子或生物碱结合，以盐的形式存在。芦荟中的有机酸含量随季节变化而变化，夏季时的有机酸含量有普遍增高的趋势。2.5 矿物质 芦荟中含有丰富的人体必需微量元素，包括硅、铝、镁、钙、锰、钴、钛、铬、铜、磷、钠、锌、镍、钒和银等，不同产地来源的芦荟，所含的矿物质的量也不尽相同。2.6 酶及其它成份 目前，己从芦荟叶汁中检出的酶有淀粉酶、纤维素酶、过氧化酶、脂肪酶、氧化酶、碱性磷酸脂酶、蒜氨酸酶等。日本添田百枝博士发现，在日本木立芦荟中除酚类化合物和多搪外，尚有三种耐热、耐酸和耐碱的化学成分：(1) 阿劳米嗦 (alomicin)具有解毒、抗肿瘤，可抑制引起癌症的病毒繁殖因子，同时对细菌分泌的毒素有解毒作用。(2) 阿劳埃乌罗辛 (aloculcin)对烫伤、烧伤及溃疡十分有效。(3) 阿劳埃汀 (aloetin)具有解毒、抗菌和抗霉的作用，可抑制病原细菌的繁殖，也能杀死病原菌和霉菌。芦荟成份中最引起人们注意的是aloetin A、B，根据研究报告显示，aloetin A有抗癌作用，aloetin B有降低血糖作用。3 蒽醌类化合物的分布及理化性质 植物中的蕙醒类化合物一般分为两大类6-7：(l)大黄素型。羟基分布于两侧的苯环上，多数化合物呈黄色，大黄中的大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚和芦荟大黄素属于此类。(2)茜草素型。羟基分布在一侧苯环上，颜色为橙黄至橙红色，种类较少，如茜草中的茜草素、羟基茜草素和伪羟基茜草素等。蒽醌类化合物及其衍生物在自然界植物中分布很广，如百合科的芦荟，豆科的决明子、番泻叶，茜草科的茜草、鼠李，寥科的大黄、虎仗、何首乌、拳参。除高等植物以外，蒽醌类化合物还存在于低等植物地衣和菌类的代谢产物中。芦荟中的蒽醌类成分多属于大黄素型，其主要的化合物结构式如图1-2所示。 天然中草药中蒽醌类化合物母核上一般都有酚羟基助色基团，因此绝大多数蒽醌化合物都是有色晶体，取代的助色基团越多，颜色越深，有黄、橙、棕红色以至紫红色等。在不同pH值下，由于还原的作用，形成显现不同颜色或荧光的蒽醌类化合物。游离的蒽醌类化合物极性较小，一般可溶于乙醇、乙醚、苯、氯仿等有机溶剂，基本上不溶于水，在植物中，蒽醌类化合物常以甙的形式存在，此时比较难以结晶，易溶于低浓度甲醇溶液及乙醇溶液、热水中，在冷水中溶解度大大降低，几乎不溶于苯、乙醚、氯仿等极性较小的有机溶剂中。羟基蒽醌类衍生物多与葡萄糖、鼠李糖等结合成甙类，一般有单糖甙和双糖甙两类，如图l-3所示。蒽醌类化合物一般皆具有酸性，其酸性强弱的排列顺序大致为：含COOH含二个以上-OH含一个-OH含二个以上-OH含一个-OH。据此可采用pH梯度萃取法分离蒽醌类化合物：用碱性不同的水溶液(5%碳酸氢钠溶液、5%碳酸钠溶液、1%氢氧化钠溶液、5%氢氧化钠溶液)依次提取，其结果为酸性较强的化合物（带COOH或二个-OH）被碳酸氢钠提出；酸性较弱的化合物（带一个-OH）被碳酸钠提出；酸性更弱的化合物（带二个或多个-OH）只能被1%氢氧化钠提出；酸性最弱的化合物(带一个-OH)则只能溶于5%氢氧化钠。显色反应：蒽醌类化合物及其贰类衍生物如蒽酮、蒽酚，只要有酚轻基存在，均可以用NaOH、Na2CO3、氨水等碱性试剂显色，呈现出橙、红、紫红等颜色，加酸酸化后颜色可消失，加碱又显色，该反应称为Brontragers反应。羟基蒽醌类化合物与0.5%醋酸镁甲醇溶液，反应5分钟，产生稳定的橙红色、紫红色或紫色的配合物，其颜色随分子中轻基的位置而异。如仅有一个羟基的呈橙红色；具有间位二轻基的呈紫至紫红色；具有邻位二轻基的呈蓝紫色，因此该反应可以帮助识别羟基的位置，可用于色谱检识和定性定量测定。4 蒽醌类化合物的药理作用4.1抑菌、抗病毒作用大黄酸对金黄色葡萄球菌、链球菌、淋球菌、白喉、枯草、痢疾、炭疽、伤寒、副伤寒杆菌等具有显著抑制作用8。大黄素、大黄酸、大黄酚、芦荟大黄素对幽门螺杆菌均有较强的抑制生长作用9。蒽醌类化合物抗菌机理主要是抑制菌体糖及糖代谢中间产物的氧化和脱氢过程，并与DNA结合，干扰其模板功能，抑制蛋白质和核酸合成。大黄素、大黄酸具有抗病毒作用。4.2 抗肿瘤作用4.2.1 诱导肿瘤细胞凋亡体外研究表明，用大黄素、芦荟大黄素、大黄酸处理可诱导多种肿瘤细胞系凋亡的发生，主要有：人肺鳞片癌细胞CH27、人肺非小细胞癌细胞H460、早幼粒白血病细胞株HL-60、人口腔鳞癌细胞KB、人肝癌细胞系BEL-7402、HCC、Mah/avu、PLC/PRF/5和HepG2及Hep3b等10。4.2.2 影响肿瘤细胞的增殖动力学和细胞周期大黄素可引起U-ras转化细胞S和GZ/M期停滞11。大黄酸对人肝癌细胞和小鼠腹水癌细胞的杀伤作用主要通过抑制肿瘤细胞DNA模板，干扰DNA模板功能，从而使肿瘤细胞的生长受到明显抑制。大黄素、大黄酸可抑制Colo-16细胞Gl期细胞周期蛋白在Gl期末与催化亚基结合，使P34cdc2蛋白酶丧失活性，失去了S期启动因子的正调控，抑制Gl向S期转变。4.2.3 抗多药耐药性胡凯文12报道对同蒽醌类化合物的阿霉素、柔红霉素耐药的细胞瘤株对大黄素、大黄酸仍然敏感，而目大黄素、大黄酸对所选耐药细胞及其对应敏感细胞的杀伤活性几乎相同。大黄素逆转肿瘤细胞多药抗药性的作用与抑制核甙转运、降低P-糖蛋白的功能和表达相关。4.2.4抗诱变在鼠伤寒沙门菌TA98中大黄素具有抗诱变活性， Su HY13研究表明，大黄酸能抑制致癌物3-氨基-1-甲基-5H-吡哆 4，3，b吲哚(Trp-P-2)对CYPIAI的诱导作用，降低细胞色素P450(CYPIAI)的活性。另有研究表明，100mM的大黄酸对苯并吡在肝癌细胞株HepG2介导的DNA损伤具有抑制作用，其抑制率为71%。4.2.5酶抑制剂Yim H.等人14报道了大黄素可选择性地抑制酪蛋白激酶(CK)的活性，通过对几种新氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性IC50比较，大黄素对CK的IC502mol/L低于其他激酶2-3个数量级，具有竟争性抑制CK的活性，抗ATP的Ki值为7.2mol/L。大黄素也可阻碍HER-2/neu过度表达的乳腺癌细胞包括侵袭能力在内的恶性表型的转化，在体内可增强紫杉醇的抗癌作用。4.3 抗炎作用大黄素对局部急性炎症有明显的对抗作用，能强有力地抑制核转录因子和粘附分子的表达，因此可治疗多种炎症。大黄素可通过抑制LPS刺激的大鼠腹腔巨噬细胞分泌TNF-，抑制过度的炎症反应，而对于未经LPS刺激的大鼠腹腔巨噬细胞，大黄素可促进TNF-的分泌。大黄酸可抑制中性粒细胞的趋化和吞噬作用以及巨噬细胞的迁移和吞噬作用，并抑制IL-1的活性及花生四烯酸的产生15。大黄酸能通过抑制细胞内信号传递的强度达到抑制LPS诱生大鼠腹腔巨噬细胞IL- 12mRNA的过渡表达。大黄酸、大黄素抗炎机制与抑制腹腔巨噬细胞生物合成白三烯B4(LTB4)有关。4.4 抗氧化作用大黄素、大黄酸具有清除氧自由基的作用。化学发光法16表明，大黄素、大黄酸对大鼠脑匀浆脂质过氧化或Maillard反应引起的极弱化学发光均有猝灭作用，该作用强度与对丙二醛(MDA)的抑制率存在线性关系。电化学方法表明，大黄酸的羟基与超氧阴离子发生单电子转换反应，阻断了邻苯三酚自氧化的自由基链反应，从而具有清除活性氧自由基作用。4.5 对心血管的作用大黄素、大黄酸对平滑肌细胞的增殖具有抑制作用，表明大黄素、大黄酸可用于防治动脉粥样硬化。大黄素及大黄酚剂量依赖的抑制苯肾上腺素诱导的豚鼠胸主动脉坏血管收缩反应，降低最大收缩力，显示非竟争性阻断作用。大黄素和大黄酚也可抑制组胺诱导的血管收缩反应，其机制可能与阻滞了钙通道有关。大黄素对多种血管有舒张作用，能抑制5-羟色胺对血管的收缩作用，协同乙酰胆碱的舒张作用，其舒张作用与自由基或氢过氧化及cGMP增加有关。大黄素、大黄酚明显抑制苯肾上腺素及组胺等激动剂诱导的鼠主动脉血管收缩反应，大黄素作用明显强于大黄酚。此外，从动物实验17发现大黄酸可改善血脂代谢紊乱，表现为血甘油三酯和胆固醇的降低，高密度脂蛋白 (HDL)升高，低密度脂蛋白(LDL)降低。大黄酸可以抑制脂肪细胞内mRNA的复制与表达，从而降低脂肪细胞水平，可能是大黄酸具有调脂作用的机制之一。4.6 对肝、肾脏的保护作用大黄素能减轻CCl4对肝细胞的损伤，对大鼠肝细胞纤维化有治疗作用，降低肝细胞纤维化大鼠血清透明质酸，对CCl4性肝损伤具有保护作用18。大黄素对CCl4引起的原代培养大鼠细胞ALT、AST和MDA水平的升高有抑制作用，并能明显改善受损肝细胞的增殖活性。大黄素能有效地抑制狼疮性肾炎(LN)肾间质成纤维细胞的分裂增殖，并能促使其细胞发生凋亡，两者均呈剂量依赖关系，从而达到减轻LN肾间质纤维化病变。通过细胞培养的方法证实大黄素能抑制人狼疮性肾炎纤维母细胞的增殖，通过上调纤维母细胞c-myc基因表达，促进细胞凋亡，认为大黄素有助于改善狼疮性肾炎患者的预后。细胞培养的方法证实，大黄素是通过抑制DNA合酶及延缓细胞周期来抑制人肾纤维母细胞增殖。动物实验证明大黄酸可以抑制糖尿病大鼠肾脏高代谢，明显减少尿蛋白，控制肾脏的肥大。4.7 对胃肠道的作用大黄素对豚鼠离体肠管具有双向调节作用，并与钙离子的参与密切相关。大黄素对豚鼠、大鼠和家兔离体回肠具有双向调节作用，这种作用对肠麻痹及痉挛可能有调节性治疗作用。腹腔注射大黄素能抑制大鼠的胃溃疡，降低胃酸和胃蛋白的浓度，促进胃黏液分泌，提高胃液中的蛋白含量。大黄素对实验性大鼠具有泻下作用，其机制可能是抑制大肠对水分的吸收和刺激分泌，从而引起水容量的增加。5 蒽醌类化合物的提取及分离方法5.1蒽醌类化合物的提取对于芦荟有效成分的研究方法，首先是必须对其中有效成分进行提取，然后将其从复杂的物质中分离提纯出来，并研究其结构、药效，阐明其构效关系。提取方法的不同，会影响到产成品中有效成份的含量。不同提取工艺也会影响中药制剂有效成份的含量，提取条件可以从提取方法和提取工艺这两个方面加以考虑。常用的提取方法有水提法，有机溶剂提取，酸性、碱性有机溶剂提取，水蒸汽蒸馏，酶解或抑制酶解，化学处理和升华法等19。但通常采用的都是前两种方法，即水提法和有机溶剂提取法，其他方法的应用范围非常有限根据提取工艺的不同，水提法又可分为煎提、浸提和渗流选择适当的溶剂对中药有效成分的提取是很重要的，因为适宜的溶剂溶出的有效成分较多，无效的杂质较少。最常用的溶剂是水和乙醇，由于水的极性大，对大多数的化学成分有强的溶解能力，所以水提物所含成分多，杂质含量高；乙醇在中药有效成分提取中的应用仅次于水，乙醇具有适宜的极性，可以与水以任意比混合而改变溶剂的极性，而且乙醇的沸点低，可以反复回收利用。由于植物药的化学成分大致可分为亲脂性成分、亲水性成分和中等极性成分，常用中药的有效成分大多属于中等极性成分，更适于用乙醇溶液进行提取，用乙醇提取的另一个优点是提取液不会霉变。随着科枝的发展，许多新的提取技术也被引入到中药领域，如超声提取法、超临界流体萃取法以及将整体药物研究法与分子药物研究法相结合的半仿生提取法20。超声波提取技术是指以超声波辐射压强产生的振动效应、空化效应和热效应，引起机械搅拌、加速扩散溶解的一种新型提取方法21。具有空化、机械振动、乳化、扩散、击碎等多级效应。这些效应对植物药材的细胞有破坏作用，使其溶媒渗透到药材的细胞中，使药材中的化学成分溶于溶媒之中，增加有效成分的提取率。超声法具有实验设备简单，操作方便，与常规提取法相比，提取时间短，产率高，无需加热等优点。5.2 蒽醌类化合物的分离由于芦荟化学成分的多样性、复杂性以及众多化学成分的性质相近，因而分离难度较大，经典的分离方法，如有机溶剂分级沉淀法、有机溶剂萃取法等很难分离得到纯净的物质。随着分离和精制技术的发展，近年来出现了许多新的分离和精制方法，如柱色谱法、絮凝沉淀法、膜分离法、高速离心法，大孔树脂吸附法、分子蒸馏法及后来发展起来的低压快速色谱、逆流色谱 (CC)、气相色谱 (GC)、高效液相色谱(HPLC)、离心色谱、毛细管电泳(CE)、超临界流体萃取法(SFE)、双水相技术。这些新技术的出现，极大地推动了分离科学的发展，倍受各行业人士的欢迎，如膜技术、色谱方法、电泳法等的出现，使得芦荟有效成分的深度分离成为可能。6大黄素的提取分离工艺研究大孔树脂进行分离的技术是20 世纪60 年代末发展起来的继离子交换树脂后的分离新技术之一，具有物理化学稳定性高、吸附选择性独特、不受无机物存在的影响、再生简便、解吸条件温和、使用周期长、节省费用等诸多优点，广泛用于植物活性成份的分离纯化。大孔吸附树脂技术就是以大孔吸附树脂为吸附剂，利用其对不同成分的选择性吸附和筛选作用，通过选用适宜的吸附和解吸条件借以分离、提纯某一或某一类有机化合物的技术。本文采用大孔吸附树脂为固定相，选择适当的流动相，应用低压柱色谱法对芦荟的有效成分进行分离鉴定，旨在探索一种快速提取、分离与纯化芦荟有效成分的实用方法，以大幅提高芦荟的经济附加值。芦荟中大黄素的提取分离流程图如下所示：芦荟干燥提取物蒸发乙醇乙醇提取液50%乙醇提取芦荟叶减压抽滤含量测定滤液溶解乙醇溶解减压蒸发纯化定容过滤大黄素粗品实验比较了GD-3、GD-4和GD-10三种吸附树脂对芦荟提取的分离效果，确定了以GD-10大孔吸附树脂为固定相，梯度浓度乙醇溶液为流动相的低压柱色谱分离模式，通过实验确定分离条件为上样速度为2.0mL/min，上样浓度为5.0g/L，制备型色谱的洗脱速度为2.0mL/min，分析型色谱洗脱速度为1.0mL/min。7 结语随着生态环境的不断恶化，尤其人类社会进入21世纪的今天，在崇尚回归自然的理念下，对天然产物有效成分的研究日益受到重视。芦荟是近年来在全球范围类重点推广的一种药食同源的植物，具有广泛的药用价值，而且还是一味良好的保健品。现代药理研究表明其具有清热明目、润肠通便、降血脂等多种功效。虽然我国也有将芦荟中葱醒类化合物制成美容、减肥和抗癌的天然保健品，但开发研究远远不够。大力开发蕙醒类化合物相关产品，不仅可以提高产品的附加值，还能提高人民的健康水平。因此，对葱醒类化合物的研究开发既具有可观的经济前景，又具有良好的社会效益。参 考 文 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