【毕业学位论文】（Word原稿）利用比较基因组学进行小麦太谷核不育基因的克隆博士论文

密级： 内部 5 年 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 利用比较基因组学进行小麦太谷核不育 基因的克隆 of of I 摘 要 太谷核不育小麦是我国 1972 年发现的一份珍贵小麦材料，是我国特有的种质资源。其不育性受显性单基因（ 制，雄性不育彻底、稳定而且不受遗传背景的影响。克隆 因、阐释其作用机理具有重要意义。太谷核不育基因定位于小麦 4色体，在矮败小麦中，与矮秆 基因 密连锁。小麦 4色体多态性非常低，在已有的 小麦 遗传图谱中， 定位于 4分子标记 最 少，这给 该 基因的克隆带来了很大困难。比较基因组学研究表明，禾本科不同物种之间在基因及基因排列顺序上具有很好的共线性。 本研究的目的是 对小麦 域的共线性进行分析 ，并 利用比较基因组学进行 因的克隆 。 小麦 4色体与水稻第三染色体长臂具有同源性。 根据这种同源关系，利用 小麦 计D 基因组特异引物，对六倍体小麦 库和二倍体 D 基因 组 库进行筛选，并利用 物进行染色体步行。共筛选得到 32 个 隆，跨叠群总长度大约 应的水稻基因组同源 区 段长 度为 820 对小麦 段 11 个 隆， 因组序列 分析表明，重复序列占 其中反转录转座子分布最多，占重复序列的 80%，总测序长度的 反转录转座子中主要为型，占 非 型占 基因序列占 不同 的基因含量差别很大，最低为 最高为 测序的 11 个 共包含 50 个基因，平均基因密度为 1 个基因/30 1个基因 / 1个基因 /源区段的共线性分析表明，小麦和水稻之间存在很好的共线性。该区段 96%的小麦基因与水稻第三染色体同源，其中 81%与水稻保持共线性。同时，该区段小麦中也存在基因重复、插入、缺失、倒位等非共线性区段。 为进一步比较 源区段的共线性， 对 两个短柄草 的 隆 进行了测序 ， 其 一致序列为 180中，基因序列占 21%，共包含 10 个基因，基因密度为 1 个基因 /18在该测序区段， 短柄草的基因全部与水稻和小麦具有共线性， 但 是，短柄草比水稻 少 8 个基因，比 小麦少 1 个 基因。 7 个同源基因中，有 6 个在 短柄草与小麦 之间 的蛋白质序列相似性大于水稻与小麦的相似性。 这些结果表明， 该区段小麦与短柄草间的共线性及基因相似性均大于小麦与水稻 。 记是一种基于重复序列的新的分子标记类型，可有效地用于分子标记的开发。本研究利用 的重复序列，设计了 109 对 D 基因组特异引物。采用 物直接测序的方法，在12 对引物的扩增产物中检测到 15 个多态性位点，其中 9 个位点 被 成功 地 开发 为 记。新开发的 9 个 记中， 7 个位于矮秆基因左侧， 2 个位于矮秆基因右侧，在水稻同源区段中覆盖大约 530区段 。利用新开发的分子标记对 因进行定位，几方面证据 表 明， 因位于 着丝粒之间的区段。 公共数据库中 有 100 多 万条的小麦族 小麦基因组学研究提供了丰富的可利用资源。在 本研究中，利用与水稻基因同源的小麦 计引物，检测可育株与不育株之间的基因序列的多态性。共对 59 个基因的 110 对引物进行了检测，扩增产物包含 268 个内含子，总测序长度大约143果在 同源基因中检测到一个多态位点，该 点与不育基因紧密连锁。 外， 记没有 检 测到多态性，这些结果表明，小麦 段的多态性非常低。 本研究构建 了 目标基因区域 的 叠 群，开发了 9 个 记，并将 因定 位于着丝粒之间的区段 ，为最终分离、克隆 因奠定了很好的基础。 关键词 太谷核不育小麦，图位克隆， 比较基因组学， 共线性 ， 记 972 a it by of is of on it to of of D. be of of to in of to to it is to of is on . on to D AC AC to A 2 up of is 20 AC of TR 0% of of in 0 1 a 04, 2.3 of a of In 96% in 1% of in to in in 80it a of 8of in in 8) ) of is a on it in A 09 D on 1 in IV by CR 5 2 CR 7 of on on in 30to in ST in is In on to to A 10 9 43kb 68 CR As a in NP to SR NA in In AC to of V 目 录 英文缩略表 . 一章 文献综述 . 1 物雄性不育及其研究进展 . 1 物雄性不育 . 1 物雄性不育研究的意义 . 1 物雄性不育发生机理研究进展 . 2 麦雄性核不育基因 . 3 定位的小麦雄性核不育基因 . 3 谷核不育基因 其遗传特点 . 4 谷核不育小麦的研究进展 . 5 因的图位克隆技术 . 8 位克隆技术流程 . 8 位克隆方法在小麦中的应用 . 9 较基因组学研究进展 . 13 传图谱揭示了基因组间的共线性 . 13 片段 列比较揭示了基因组间的微共线性 . 15 麦第四部分同源群染色体的共线性 . 16 题意义及技术路线 . 19 题意义 . 19 术路线 . 19 第二章 小麦 域的跨叠群构建及物种间的共线性比较 . 20 前言 . 20 料与方法 . 20 料 . 20 法 . 21 果与分析 . 30 库的筛选与跨叠群的构建 . 30 隆测序与序列拼接 . 32 麦基因组序列组成特点 . 33 麦、水稻、短柄草微共线性比较 . 37 论 . 44 麦 域的共线性 . 44 短柄草是否可作为小麦的模式植物 . 45 因密度 . 45 列与基因 . 46 转录转座子 . 46 第三章 基于重复序列的分子标记开发 . 48 前言 . 48 料与方法 . 48 料 . 48 法 . 48 果与分析 . 50 于微卫星重复的 记的开发 . 50 于反转录转座子的 记的开发 . 54 记转化为 记 . 56 记检测与 因定位 . 58 论 . 59 谷核不育基因 定位 . 59 记在小麦基因组学研究中的应用前景 . 60 第四章 基于小麦 分子标记开发 . 62 前言 . 62 料与方法 . 62 料 . 62 法 . 62 果与分析 . 68 用基因开发 记 . 68 据小麦 列设计引物检测多态性 . 69 论 . 71 麦 4色体多态性低于其它染色体 . 71 因区域分子标记的开发 . 72 第五章 全文结论 . 74 参考文献 . 75 致 谢 . 91 作 者 简 历 . 92 文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 菌人工染色体 胞质雄性不育 达序列标签 向逆转座子扩增多态性 性不育 转座子插入位点多态性 转座子微卫星扩增多态性 制性片段长度多态性 转座子内部扩增多态性 核苷酸多态性 列特异扩增多态性 单序列重复 中国农业科学院博士学位论文 第一章 文献综述 1 第一章 文献综述 物雄性不育及其研究进展 物雄性不育 植物雄性不育是指植物在有性繁殖过程中雄性生殖器官发育异常 ，不能产生有正常功能的花药、花粉或雄配子，而其雌性器官的生长发育完全正常，可以接受正常发粉受精结实。植物雄性不育在自然界中是一种常见现象 ， 早在 1763 年 观察到雄性不育现象， 1876)首次引入“植物雄性不育”的概念。目前已经在近千个品种或种间杂交种中发现雄性不育（ et 1988）。 植物雄性不育主要有三种类型：（ 1）生理上不协调或某些环境因素造成的雄性不育，不能遗传；（ 2）由于染色体数目、性质上的不协调造成的雄性不育，多为远缘杂交种；（ 3）由基因决定的 雄性不育，可以遗传。可遗传的雄性不育是生产应用和科学研究的主要 材料 。 1947)根据雄性不育材料基因型的差异，将雄性不育分为核不育 (、胞质不育 (核质互作不育三种类型，雄性不育性分别由核基因、细胞质基因及二者的互作决定。然而，事实上至今没有 细胞 质突变独立引起雄性不育的报道 (孙东发， 1956)把胞质不育和核质互作不育合为一类，提出了雄性不育的“二型学说”。核不育中有显性基因、隐性基因控制的不育，及环境条件控制的光（温）敏核不育。 根据雄性不 育败育发生的过程，可分为孢子 体不育和配子体不育两种。孢子体不育是指合子体（植株）基因型控制的花 粉不育，不育性与发粉本身的基因型无关，多数的雄性不育属于此类。配子体不育是指由配子（花粉）基因型控制的雄性不育，如红莲型、型和滇型等水稻不育系（曾千春等， 2000）。 988)根据植物雄性不育表型特征将植物雄性不育分为结构 型 、孢子发生 型 、功能 型 雄性不育三种类型。结构 型 雄性 指 不育雄蕊结构显著异常，致使小孢子组织不能正常发育，不能生成小孢子。孢子发生 型 雄性不育雄蕊发育正常，但是不能产生花粉或花粉异常、畸 形。功能 型 雄性不育 产生正常的花粉，但是存在花药不开裂、花粉不能萌发或花粉管生长不正常等障碍而不能受精。 物雄性不育研究的意义 物杂种优势的利用 遗传基础不同的两个亲本杂交产生的杂种在某些性状上优于其亲本的现象称为杂种优势（ 贝尔从 1862 年起，研究玉米杂交效应，指出生产上可利用品种间杂种第一代。 注意到玉米自交衰退与杂交有利的现象，于 1914 年将此现象定名为“杂种优势”（ 现今，主要农作物如水稻、小麦、玉米及经 济作物都利用了杂种优势，在产量、品质、抗性等性状上获得了大幅度提高。 中国农业科学院博士学位论文 第一章 文献综述 2 尽管利用杂种优势已成为提高农业生产效益的主要途径之一，但对于自花授粉作物，在未解决人工去雄的困难以前，难以在生产上大面积推广。而利用植物的雄性不育性是解决这一困难的有效途径。目前水稻、玉米、高粱、洋葱、油菜等作物已经利用雄性不育性进行杂交种子的生产，并产生了巨大的经济效益和社会效益。水稻中基于细胞质雄性不育的 f 体系（ 1980; 1988）对中国及亚洲地区国家的杂交水稻的发展发挥了重要作用（ Li 2000）。小麦杂种优势利用中，发展了利用隐性核不育基因的 系，和利用 T 型胞质 (T. 、 K 型 (具有 胞 质 )、 V 型 (具有 胞质 )、 (普通小麦细胞质 )、 Q 型 (具有燕麦细胞质 )等多种胞质不育系的三系配套体系（ 2003; 1987)。显性雄性核不育则被广泛应用于轮回选择等群体改良中。 物花发育机制及基因作用机理的研究 高等植物的开花 无 论对 植物本身还是对于人类都十分重要。开花是高等植物生活史上的一个质变过程，是植物个体发育过程的中心环节。研究高等植物的开花过程，阐明其调控机理无论在理论上还是在应用上都具有重要意义。雄性不育是植物花器官发育的特殊形式，对植株本身是一种不利性状，但却是植物在进化过程中一种生存的方式。植物雄配子的产生需要几千个特异基因（ et 1993; et 1999），多数花药特异基因表达具有严格的时空顺序。花粉发育所需基因一旦发生突变，就会有损于花粉的正常发育，造成雄性不育 。研究不育花粉在败育过程中基因表达特征，并分离和克隆与雄性不育有关基因，研究基因的 结 构与功能，阐述雄性不育的发生机理具有重要意义 （ et 1998） 。植物雄性不育具有多种类型，控制败育发生的生物途径具有不同的特点。核质互作雄性不育是研究核基因与细胞质基因相互作用的典型材料，光（温）敏雄性核不育基因的研究将对探讨环境对基因表达的影响及植物的环境应答机制 有 所帮助。 物雄性不育发生机理研究进展 被子植物可育花粉的产生，涉及到大量遗传控制的生理、生化和形态学过程。任何干扰雄蕊发育 、 胞原细胞分化 、 减数分裂 、 自由小孢子的发育 、 小孢子有丝分裂 、 花粉分化或花药开裂的基因突变，都有可能导致植物的雄性不育 （ et 1998）。 目前，对植物雄性不育的研究，在拟南芥和 金鱼草 等模式植物中开展得比较多 （ et 2001; 2005） ，主要是以各种诱变的雄性不育突变体为材料，通过分离克隆不育相关基因探讨其发生机理。如花丝过短雄性不育突变体（ et 1994）、花药不开裂雄性不育突变体（ et 1999）及雄配子 发育障碍或减数分裂异常的突变体（ (et 1993a; et 1998; He et 1996;et 1996; et 1997; et 1999）等。 在 雄性不育中，对绒毡层的研究很多，绒毡层的异常往往直接导致雄性不育。绒毡层是花药壁的内层细胞，细胞质浓，富含线粒体、内质网膜和高尔基体等细胞器。小孢子形成过程中，绒毡层分化形成双核的、具极性的分泌细胞层，缺乏初级细胞层。细胞学分析表明 ，绒毡层细胞质膜的内表面含有许多的囊泡。它通过向花药室中分泌大量的碳水化合物、蛋白质、脂类等物质，促进花粉的发育或变成花粉外壁的重要成分 。 有证据表明，花粉外壁腔中的蛋白质主要是在绒毡层中合成，组成花粉外壁的孢粉素也是在绒毡层中合成并分泌到花药室中。其次，绒毡层还与花中国农业科学院博士学位论文 第一章 文献综述 3 粉鞘和含油层（疏水和亲水物质的混合物，包裹着成熟的花粉粒）的合成有关。另外，与苯丙烷酮代谢有关的几个关键酶，如苯丙氨酸脱氨酶、肉桂酸羟化酶等都是在绒毡层中合成并分泌到花药室中，从而催化花药室中或发育中的小孢子外壁的苯丙烷酮代谢。苯丙烷酮代谢途径 为 类黄酮、木质素、芪类化合物和香豆素合成提供前体。 上述研究 表明绒毡层在小孢子的发育过程中具有许多非常重要的作用。拟南芥 用 签法克隆的雄性不育基因（ et 1997） ，表现为绒毡层细胞严重液泡化，花粉粒外壁发育异常。 在小孢子释放至花粉粒外壁形成的短暂时间内， 因在绒毡层细胞中特异表达，它很可能参与了胞粉素形成过程中脂肪酰到脂肪醇的还原过程。 水稻 变体则表现为绒毡层延迟解体而导致小孢子崩溃（ Li et 2006） 减数分裂时期是对各种干扰非常敏感的发育阶段，植物中大多数雄性不育突变都发生在减数分裂开始或减数分裂结束的某个时期 （ 1988） 。在拟南芥菜中，已 鉴定 许多减数分裂缺陷突变体 ，如 et 1998; et 2002; 2004; 2002; et 2005; et 1999; et 1998; et 2001; et 2001; 2000; et 2004; Li et 2005; et 2005)等。 因有两个等位突变体，即 变 的等位基因 入引起 的等位基因 胞学分析表明 变体在花粉 母细胞 发育到第二次减数分裂以后出现异常，产生异常的四分体状结构，即在第二次减数分裂后，又出现了一次额外的分裂，而 没有复制，结果形成多分体 （ et 1998）。 另外，激素类物质 (Li et 2006)、 、 细胞骨架（ Ye et 2003）及细胞程序性死亡（ et 1996； et 1996）等都与植 物的雄性不育有关。 麦雄性核不育基因 胞核雄性不育性是由细胞核不育基因 控制，其作用不受细胞质类型影响，没有正反交的遗传效应，其雄性不育的遗传、表达完全符合孟德尔遗传规律，一般由控制花粉正常育性的核基因发生突变形成。自然突变和诱发突变都可以产生核雄性不育。在核不