【毕业学位论文】（Word原稿）调控大豆抗逆反应的转录因子基因的分离与功能鉴定生物化学与分子生物学硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 硕士 学位论文 调控大豆抗 逆 反应的转录因子基因的 分离 与 功能鉴定 I 摘 要 非生物胁迫 对植物的生理代谢产生各种各样的影响 ， 植物通过改变自身基因的表达而改变其体内的代谢机制，从而对各种 非生物 环境 胁迫 进行耐受和适应。植物体内基因表达的变化受到多种的信号转导机制的调控 ， 作为信号转导重要组成部分的转录因子在调控胁迫相关的基因表达的过程中发挥着重要的作用。其中 转录因子是近年来研究 较 多，也最详尽的一个转录因子家族；作为其亚家族 ， 转录因子也成为植物分子生物学和植物抗旱分子机理研究的重要对象。 本 论文研究 中，根据 蛋白的 守域的氨基酸序列设计探针，通过 菌斑原位杂交技术 获得两个新的 全长序列。利用特异性的引物，经 得了 2 个 列，其 核苷酸 长度分别为 477 816名为 别编码含有 159 和 272 个氨基酸的蛋白 。经 氨基酸 序列和蛋白结构分析 ， 白 与在拟南芥中有过详细报道的 族 转录因子 具有高 度 的同源性 ，其蛋白 结构类似于已经 从 拟南芥 中分离的 录因子， 推测 白 属于 家族，在调控抗逆基因表达的过程中发挥转录因子的作用。 够 在大肠杆菌中以 合 蛋白的形式表达 ， 段具有较好的表达活性；纯化融合蛋白 通过凝胶阻滞 技术研究了 合蛋白 与 野生型或突变型 件 特异性的 结合 。研究结果表明， 白与野生型 件核心序列 特异性结合，与 突变 型 件核心序列特异性相互作用 弱，其 影响 显著 大于 件两端碱基 。 通过 酵母单杂交技术研究了 酵母中 的转录激活作用 ， 活了 件调控下的 告基因的 高效 表达， 使得酵母在营养缺陷型培养基 够生长， 证明了 因表达产物与 件的相互作用激活 了 件调控的下游基因的表达。 本论文首次 克隆 了 因 ，其 能够 在原核 正确表达， 在酵母中 够与 式作用元件特异 性 结合 ， 调控 游基因的表达。 此结论为提高 农 作物 抗 胁迫 能力 奠定了理论技术基础。 关键词 抗旱 反应 ， 录因子 ， of to to to of to or to of is of as an in of P/is of a an of In we by P2 as a of 77bp 16bp of P2 in of by RE . we be RE of of of of in as a RE to of as a in of to of 录 第一章 绪论 .生物胁迫下植物中表达发生明显变化的基因 . 1 与植物抗逆反应的功能蛋白 . 2 控植物抗逆反应的调节蛋白 . 4 控基因表达的转录因子的研究进展 . 6 赖非生物胁迫信号转导途径 . 8 依赖非生物胁迫信号转导途径 . 9 物抗逆基因工程的研究进展 . 12 能基因的应用 . 12 迫反应相关转录因子基因的克隆和应用 . 13 题意义、依据 . 13 术路线 . 14 第二章 调控抗逆基因表达的转录因子 因的克隆 . . 15 料与方法 . 15 料 . 15 验方法 . 15 果与分析 . 20 斑原位杂交筛选 库 . 20 标基因片段的获得及基因结构分析 . 21 标片段的 T 载体重组体构建 . 22 组体的筛选和鉴定 . 23 标基因序列的获得 . 25 标基因序列分析及蛋白功能预测 . 28 第三章 因功能分析 .料与方法 . 31 料 . 31 法 . 31 果与分析 . 38 大豆基因组内拷贝数分析 . 38 大豆中的表达特征 . 39 录因子与 件特异性结合 . 41 酵母中的转录激活 . 45 第四章 因功能分析 .料与方法 . 49 料 . 49 法 . 49 果与分析 . 56 因在基因组内拷贝数分析 . 56 因的表达特征 . 56 录因子与 件特异性结合 . 58 酵母中的转录激活 . 61 第五章 结果与讨论 .果 . 63 论 . 64 参考文献 . 谢 . 者 简 历 .国农业科学院硕士学位论文 英文缩略表 0 英文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 水应答元件 水应答元件结合蛋白 烯应答元件结合蛋白 胎后期丰富蛋白 化分裂素的蛋白激酶 离子依赖蛋白激酶 落酸应答元件 落酸应答元件结合因子 定位信号 氧化物歧化酶 胱苷肽 S转移酶 氧化物酶 氨酸脱氢酶 5C 脱氢酶 咯碄 5羧酸脂 性螺旋环螺旋结构 性亮氨酸拉链结构 醇三磷酸 超敏感型 落酸 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 1 第一章 绪论 干旱、低温和高盐是全球性的影响植物生长，限制作物产量的非生物胁迫因子。复杂的气候条件给 我国乃至全球的农作物生产带来了严重损失。我国大部分地区处于东亚季风区，气候复杂，是世界上气候脆弱区之一，也是受气象灾害影响最严重的国家之一。干旱是我国最常见、对农业生产影响最大的气候灾害，干旱受灾面积占农作物总种植面积的一半以上（广东气象数据）。因此，培育耐旱、高产、质优的农作物新品种已经成为我国农业育种工作者的重要任务。 我国是具有悠久历史的农业大国。长期以来，人们一直关注农作物对环境影响因子，如干旱、高盐和低温等的反应，致力于 筛选抗逆性好、产量高的农作物新品系。然而，环境影响因子的复杂性及其与 植物 之间相 互作用 的多样性，使得我们在农作物的胁迫反应方面的 研究较为困难 ，延缓了 与非生物胁迫抗性相关的 育种工作。虽然有新品系的培育成功，但作物抗逆品系的培养依然是提高我国农业生产力的必需。随着现代生物科学的发展和人们对作物抗逆反应机理的认识的深入，从分子水平提高作物抗逆性必将成为未来农业 育种工作 发展的重要发展方向。 当前，植物抗逆分子生物学的研究取得了 重 大的进展，人们对抗逆反应中发挥直接作用的功能基因和调控抗逆反应的蛋白及其调控机理方面对植物胁迫耐受性有了较好的了解。 生物胁迫下植物中表达发生明显变化的基因 植物体内的大量基因可以被非生物胁迫诱导表达 (et 1996;1997; 1994; et 1996; 1997; 2003)。这些基因根据其编码蛋白产物的功能可以分为两类：一类称为功能基因，编码一些直接保护生物大分子和膜结构、保持水分在膜间运动的功能蛋白，如 白、渗调素、分子伴侣和 合蛋白以及其他一些保持植物在胁迫条件下正常生理生化变化所需的蛋白等。而另一类主要是指编码涉及胁迫信 号传导和胁迫反应基因表达的转录因子（如 ），蛋白激酶（包括 酶和 酶，受体蛋白激酶，核糖体蛋白激酶以及转录调控蛋白激酶等）和蛋白酶（如磷酸酯酶和磷脂酶 C 等）等的基因 (et 1998)。这两类基因在植物的保卫反应和胁迫应答过程中起到重要作用。 后来的研究表明这两类基因在胁迫处理后的不同时间表达，推测在胁迫处理早期，与信号转导相关的蛋白激酶及蛋白酶和基因表达调控相关的转录因子基因在短时间内表达，其表达产物对功能基因进行诱导激活，从而使功能基因表达，改变 植物的生理生化或代谢状态，从而对外界胁迫作出反应。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 2 图 1物体内抗逆基因编码蛋白产物分类 of in in et 1998)修改。 与植物抗逆反应的功能蛋白 功能蛋白是一类直接参与植物细胞抗逆反应的蛋白，他们在逆境胁迫下保护植物细胞免受胁迫的破坏，保持细胞内环境的平衡，维持细胞的正常生理生化功能。 蛋白 细胞是组成生物体的基本结构单元，植物对胁迫环境的反应根本上就是细胞针对外界胁迫条件做出的细微调整的宏观效应。而细胞膜是外界环境与胞内原生质体之间的媒介，可以快速的感受外界的环境条件变化，迅速而有效地将外界胁迫信号通过特异的途径传递到细胞内组分，通过特异的中间分子，如细胞内第二信使分子，转录因子等调节细胞内离子浓度和组分的变化。 膜蛋白作为细胞膜的重要组成成分，在维持细胞膜的流动性，胞内外物质的流动，保持细胞膜两侧的渗透平衡等方面起着重要的作用。 目前对膜蛋白中的水通道蛋白和膜上的运输蛋白 的研究较多。 通蛋白 水通道蛋白是一类 膜内在蛋白，广泛存在于动植物、酵母和细菌中，是在细胞膜上 形成 水 转运 通道的蛋白质 。植物通过调控水通道蛋白来改变细胞与外界的信息和物质交流，从而实现渗透调节，增强植物的抗旱性。这类蛋白到上世纪九十年代才得到鉴定，并广泛的在动物细胞中进行研究。 但至今没有发现植物细胞膜上水通道蛋白的存在 。 解毒酶 (功能蛋白 调节蛋白 膜蛋白 (水通道蛋白，运输蛋白 ) 蛋白酶 (细胞质，叶绿体中 ) 蛋白因子 (分子伴侣， 白 ) 渗透调节物质合成相关酶 (脯氨酸 ,甜菜碱类 ,糖 ) 转录因子 (蛋白激酶 (蛋白磷酸化酶 (磷脂代谢相关酶类 (, 非生物胁迫 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 3 最早人们观察到水在渗透压或液压存在时进入血红细胞膜的速度明显的高于水在细胞膜的扩散速度，因此，人们提出细胞膜上有水孔存在的假设（ et 1953; et 1957; et 1957; et 1960）。后来通过对细胞膜进行 试剂的处理，而使的水分子通过细胞膜受阻（ et 1984），从而证明了这些水孔是由蛋白组成的通道（ et 1991）。意识到水通道蛋白的存在后，人们开始试图纯化并鉴定这些蛋白。爪蟾卵细胞成为研究显微注射的 能的重要工具（ et 1991; et 1992）。早期人们都是通过从高水通透性的细胞膜中分离 射入卵细胞后观察水通道的形成的方法研究的（ et 1990）。 研究表明， 水通道蛋白的孔隙中都具有对水分子高度选择的结构：它们都有 六次 跨膜 螺旋 结构域，这些跨膜结构域之间通过疏水性的环连接起来。 这些跨膜螺旋选择性的允许水和其他不带电荷的小分子物质顺渗透压梯度进入细胞膜（ et 2006）。 在细胞膜外的疏水多肽环上的两个高度保守的基序被认为与通道 的选择性有关（ et 1994）。 s 实验室于 2000 年成功的利用 液中的水通道蛋白 的立体结构 。 研究发现这个结构能促进大肠杆菌对甘油的吸收，命名为水 是说这个通道可以允许小分子直链糖类如甘油等通过 （ et 2005） 。 水通道蛋白能够 快速的改变细胞内外渗透压，对于保持细胞内水分的平衡具有重要作用。 输蛋白 细胞膜两侧物质的交换通过扩散、主动运输和被动运输三种方式进行。而主动 和被动 运输的过程需要膜上蛋白的参与，这类蛋白称为运输蛋白。 生物膜上的运输蛋白可以分为通道蛋白和载体蛋白。通道蛋白作为一种选择性的孔径，受某些化学或电生理刺激而开放，允许一些溶质通过一定的电化学梯度而进入细胞或流到细胞外。 而 载体蛋白通常利用一定的能量而将 物质逆浓度梯度运输。还有一类活化运输蛋白通过物质的顺浓度梯度运输而运输另一种物质。 输蛋白（ 用 分解将各种底物运到膜内或膜外。通过 X射线已经获得的六个不同的运输蛋白，包括两个 输蛋白的高分辨率三位结构图。这些结构图验证了之前的生物化学和生物学研究，并且对新的功能机制的研究提供了材料。这些运输蛋白都具有跨膜的螺旋结构 ，并且具有不规则的折叠或弯曲，这些结构保证了运输蛋白在物质运输过程中可以通过构象的变化而促进物质的运输（ et 2004）。 运输蛋白是细胞内外离子和物质交换的重要媒介，因此膜 运输蛋白对于膜两侧离子的平衡和细胞对物质的吸收起着重要的作用。 白酶 蛋白酶对于维持细胞内组分的平衡和生理平衡状态是必需的。蛋白酶类关系到胁迫信号的感受，传导，和解除，对植物的生理生化过程进行实时的调控。 白 白是指胚胎发生后期种子中大量积累的一类蛋白质。 白广泛存在于高等植物。白质植物细胞中可以保护生物大分子，维持特定细胞结构，缓解干旱、高盐和低温等环境胁迫的作用。 伴随着干旱过程产生的一类的分子量蛋白，大部分在 10 30间，少部 分在 30上（ et 1989），这类蛋白与种子的耐脱水性密切相关，在种子成熟脱水过程中期保护组织免受伤害的作用。 1985）最早检测并得到了 因并得到其编码中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 4 产物。后来人们相继从小麦（ et 1993）、番茄（ et 1997）和大豆（ et 1995）等多种植物中检测到此类蛋白的存在，说明 白在许多植物中可以表达。 干旱胁迫等也能有到它的表达，如黎豆（ 利用高盐胁迫和水胁迫等诱导了此类蛋白的产生（ et 1996）。同样在 诱导下，此类蛋白的表达量也增加（ et 1999）。 白高亲水性，保证了植物在干旱条件下细胞结构的稳定，避免了 细胞 膜结构的破坏。 透调节物质合成相关的酶 干旱条件下，植物细胞内会积累大量的有机分子、可溶性溶质和小分子物质，用于维持细胞内外的渗透压平衡。如脯氨酸、甜菜碱以及一些小分子糖类。 脯氨酸累积是植物针对干旱胁迫的保护措施。研究发现，脯氨 酸可以保护蛋白在缺水时不变性，其亲水基团与蛋白质的亲水残基相互作用，而使得蛋白的稳定性提高 (992)。同时，脯氨酸还可以协助清除体内自由基，调节细胞 止酶变性和细胞质酸化等作用。脯氨酸的合成和降解分别受 成酶和 原酶以及脯氨酸脱氢酶和 氢酶（ (et 1997)。如此则保证了胁迫条件下脯氨酸含量的快速增加，并使得在胁迫解除后，脯氨酸的迅速降解。 而甜菜碱可能是作为植物主要的渗透调节物质来调节细胞内外渗透压的平衡。植物体内甜菜碱的 合成是由甜菜碱醛脱氢酶 (胆碱脱氢酶（ 个基因共同作用的结果 (et 1998; et 2000)。胁迫条件下，胆碱被上述两种酶类氧化为甜菜碱，并在细胞质中大量积累，使得细胞内外的渗透压保持平衡，从而提高了植物的胁迫耐受性。 et 2000)将甜菜碱醛脱氢酶和胆碱脱氢酶基因转入烟草而提高了植株中甜菜碱的含量，提高了转基因植株的胁迫耐受性。 性氧清除酶类 环境胁迫条件可以导致细胞内活性氧含量的增加， 对细胞内的信号分子和组成成分造成破坏，从而在细胞内形成超氧化环境，对植物造成损害 ，引起一系列的衰亡反应 。植物体内含有多种活性氧清除酶类，如超氧化物歧化酶（ 过氧化氢酶 （ 、过氧化物酶（ 谷胱甘肽 它们协同抵抗胁迫诱导的氧化伤害 。胁迫条件下， 细胞内 活性明显提高，表明 这些 酶在 植物的 胁迫反应过程中发挥作用。 另外，植物体内还含有大量的分子伴侣，保证胁迫条件下多肽折叠的正确性，以及促进变性蛋白的降解。近年研究较热的磷脂酶类也对植物细胞的胁迫耐受性具有重要影 响。 控植物抗逆反应的调节蛋白 植物中的抗逆相关的调节蛋白主要参与胁迫信号的转导和基因表达的调控过程。包括一些与信号转导有关的蛋白酶类、调控基因表达的转录因子等。 控基因表达的转录因子 转录水平的调控是基因特异性表达的主要调控环节。 转录因子通过与顺式作用元件相互作用而调控下游基因的表达。转录因子又称反式作用因子，是指能够与顺式作用元件特异性结合，激活下游基因表达的蛋白因子。转录因子一般由 合域、转录控制域、寡聚化位点及核定位信中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 5 号等组成。一些转录因子也通过与其他的转录因子 相互作用而起到调控基因表达的作用。 合域决定了转录因子与 列的结合特异性，而转录控制域调控基因的表达；核定位信号是指蛋白序列中的一些富含精氨酸和赖氨酸残基的区域，是蛋白合成后正确定位所必需的；而寡聚化位点可能是转录因子之间相互作用的功能域，可以与 成一定的空间构象（ et 2000）。 植物对胁迫环境的反应是特异的胁迫反应基因的表达的结果。植物通过一系列的信号转导途径激活转录因子的表达，进而激活特异的胁迫反应基因的表达。植物的非胁迫反应过程是受多基因控制的，因此，近年来，非生 物胁迫反应调控机理的研究成为植物分子生物学研究的重点，而作为抗逆反应基因表达调控因子的转录因子的研究对于揭示非生物胁迫反应的调控机理具有重要的意义。按照蛋白的结构组成分类，目前研究的转录因子主要有： 白，最早由 et (1997)在 白中发现， 守域是由 60 个左右的氨基酸残基组成的 1 个 螺旋和 3 个 折叠构成；锌指蛋白，由 1 个富含碱性残基的 合域和与其相邻的锌指二聚体结构组成；类 白，由三个不完全重复组成的螺旋 螺旋组成；类 白，含有基本的螺旋 螺旋结构域，有两个分别可与 合和与 成而具体的结构域组成。 与细胞信号转导的蛋白激酶 环境胁迫作用于植物细胞表面受体，引发细胞内一系列的信号转导途径，最终通过激活特异的功能基因的表达改变植物生理生化状态，从而对胁迫作出适应。研究表明，蛋白激酶在信号的感知和转导过程中都具有重要作用（ hu et 2002, 005）。 对拟南芥的基因组分析结果表明，其中约有 600 多个基因编码蛋白 激酶（ 003）。目前已研究的与植物非生物胁迫反应相关的蛋白激酶主要有四类：受体蛋白激酶、促分裂原活化蛋白激酶（ 核糖体蛋白激酶和转录调控蛋白激酶等。这些蛋白激酶通过影响细胞内组分的磷酸化 /去磷酸化、羟基化 /去羟基化、还原 /氧化等状态，而改变各种蛋白或信号分子的构象，或存在状态：或聚合 /解聚、或失活 /趋活等，调节信号分子或蛋白的活性，影响了细胞内的代谢，从而对环境条件作出适应性反应 (2000)。 体蛋白激 酶 受体蛋白激酶可以感知各种外界胁迫信号并将信号向胞内传递，引发一系列的信号转导过程(003)。典型的受体激酶是由胞外结合域、跨膜域和胞内催化结构域三部分组成 (001)能与区分不同的信号有关 (et 2004)，而胞内部分同源性较高，可以达到 40%，因此依据不同的胞外域，我们将受体蛋白激酶分为 15 类 (001, 2003)。从拟南芥中分离出的蛋白激酶基因可以受干旱、高盐和低温的快速诱导，推测该蛋白激酶可能在环境胁迫信号的转导过程中发挥作用 (et 1997)。最近在多种植物中发现的双组分系统就是一种干旱胁迫反应感受器，含有一个组氨酸激酶作为感受器和一个依赖于磷酸化作用的反应调节器(997;et 1998, 2000;et 2001)。 分裂原活化蛋白激酶 促分裂原活化蛋白激酶 (联反 应是一种在 酵母 细胞中了解比较清楚地信号转导途径（ 22） 。 人们希望 在植物中 也能找到一条类似的渗透胁迫信号转导的途径。酵母中的渗透胁迫调控途径首先以含有 构域的膜蛋白或双组分组氨酸激酶开始，通过激活 酶信号通路，最中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 6 终引起渗透调节物质的合成和累积（ 22）。尽管植物中也积累可溶性的渗调物质来调节细胞的渗透压，它们是否具有相同的膜上信号感应器和 酶级联调控渗调物质的合成还不清楚（ 2006） 。 最近 在植物中鉴定了一些受渗透胁迫或其他胁迫诱导的蛋白激酶。 植物中存在许多受渗 透胁迫激活的 酶，如在紫花苜蓿中发现的 et 1998）。有趣的是 渗透压超过一定范围（ 750就不再激活，反而是另一个更小的激酶被活化，表明这两个蛋白激酶在不同的渗透压范围发挥作用。烟草细胞中的 高渗透压诱导激活（ et 2000）。 在烟草中 过量 表达 et 2000)，最近报道的 过度表达还增强 了转基因玉米的胁迫耐受性 (et 2004a, 2004b)。 糖体蛋白激酶 核糖体蛋白激酶是一类通过增加某些蛋白的合成而使植物对胁迫反应的蛋白激酶。 生物化学分析表明植物细胞内蛋白的磷酸化参与了植物环境信号、代谢、病原体和激素（ et 1987; et 1991）反应。遗传分析发现蛋白激酶的在自身不相容性（ et 1993; et 1993）和乙烯信号（ et 1993）转导中发挥作用。这些结果表明可逆性蛋白磷酸化在植物细胞调控中具有重要作用。 如拟南芥中发现的 糖蛋白激酶基因就被认为对植物的生长和发育具有重要调节作用（ et 1994）。 录调控蛋白激酶 转录调控蛋白激酶参与调控与 生物生长发育、细胞周期和染色体活动以及生命物质的合成的等多种与 生命活动相关的基因的表达 ，同时也通过其激酶活性影响转录因子的活性。 控基因表达的转录因子的研究进展 干旱，高盐和低温是影响植物生长，限制作物产量 的主要的环境胁迫因子。植物在分子水平、细胞水平和生理生化水平对这些胁迫条件进行适应，从而使它们能够耐受或抵抗这些胁迫条件，在恶劣的环境中生存下来。人们已经对许多植物中的胁迫诱导基因的表达进行了研究（ et 1996;et 1997;1999）。这些基因的表达产物不光在胁迫耐受过程发挥作用，而且在植物的基因表达和信号转导过程中发挥作用（ et 1998; et 2005; et 2003; et 2002）。 植物激素 干旱胁迫条件诱导产生，在植物对干旱和高盐胁迫的反应过程中发挥重要作用。外用 以诱导大量的干旱和低温反应基因的表达（ et 2003;et 2004）。然而，对于 如何调控 低温胁迫反应基因的表达还不是很清楚。同时有一些报道描述了受干旱和低温诱导的基因，但并不受外源 诱导（ et 2003，et 1994； et 2002）。这表明植物体内有 赖和 过对 胁迫诱导基因 动子元件的分析发现了依赖信号转导通路的顺式元件的存在（ et 2003; 国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 7 2005）。 植物对非生物胁迫的反应过程是受多基因控制的，因此它的信号转导途径也相当复杂（ 2000， 2002， 2006）。通过 交 ,基因芯 片和定量 试验 ,对拟南芥中的干旱 ,高盐和低温诱导的基因的表达进行了分析 (et 2002; et 2002; et 2002; et 2005),发现超过 300 多个 基因的表达受胁迫