甘露聚糖酶水解酵母细胞壁水解条件的研究.doc

-甘露聚糖酶水解酵母细胞壁水解条件的研究摘要： 采用单因素实验研究了底物浓度、加酶量、反应时间、反应温度和 pH 值 5 个因素对 -甘露聚糖酶水解酵母细胞壁的影响。在单因素实验基础上，通过正交实验确定了 -甘露聚糖酶水解酵母细胞壁的最佳水解条件为：底物浓度为 8%，加酶量为 55%，水解时间为 4.5 h，水解温度为 55 ，pH 值 6.0。关键词： -甘露聚糖酶；水解条件；正交实验；优化Study on optimization of hydrolysis by -mannanasein yeast cell wallAbstract: The effects of five factors on the -mannan enzyme hydrolysis of yeast cell wall, such as thesubstrate concentration, enzyme dosage, reaction time, reaction temperature and pH value, were studied. Theorthogonal test showed that the best optimized hydrolysis conditions were as follow： pH value of 6.0,temperature of 55 , time of 4.5 hours, enzyme dosage of 55%, substrate concentration of 8%.Key words: -mannanase; decompose by protease; orthogonal experiment; optimize-甘露聚糖酶(-mannanase)是一类能够水解含有甘露糖苷键的甘露聚糖(包括异甘露聚糖)的内切水解酶1，广泛存在于动植物和微生物中，其主要水解产物为单糖、二糖、三糖、四糖等低聚糖2。随着人们对甘露寡糖生理功能的发现和对自然界中纤维素资源的利用， -甘露聚糖酶的研究和开发进入了一个新高潮，已被广泛应用于食品、药品、饲料、造纸、印刷业、印染、纺织、石油开采和生物学研究等领域3-6。目前，-甘露聚糖酶主要用于水解含有-1,4-D-甘露糖苷键的魔芋粉、角豆角、瓜儿豆等植物原料以生产甘露寡糖7-8，而利用 -甘露聚糖酶水解酵母细胞壁中-1,6-甘露聚糖制取甘露低聚糖的研究未见详细报道9。2002年以来我国啤酒产量实现连续五年稳居世界第一，有丰富的酵母甘露聚糖资源。本实验是利用实验室保藏的高产 -甘露聚糖酶菌株产生的-甘露聚糖酶水解酵母细胞壁中 -1,6-甘露聚糖来制取甘露低聚糖，通过研究底物浓度、加酶量、反应时间、反应温度和 pH 值对 -甘露聚糖酶水解酵母细胞壁效果的影响，以确定-甘生物工程7FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY食 品 科 技2009 年 第 34 卷 第 2 期露聚糖酶水解酵母细胞壁获得甘露低聚糖的最优条件，为今后有效利用啤酒发酵残渣生产甘露低聚糖提供参考。1 材料与方法1.1 实验材料酵母细胞壁：自制；高产 -甘露聚糖酶菌株F1-5-10：实验室保藏。发酵培养基：酵母细胞壁 20 g，KNO31 g，K2HPO43H2O 0.5 g， MgSO47H2O 0.5 g， FeSO47H2O 0.01 g，琼脂 20 g，蒸馏水 1000 mL，pH7.47.6。1.2 粗酶液的制备取高产 -甘露聚糖酶菌株(F1-5-10)在发酵培养基中活化，按 10%的接种量接种到 1000 mL 的三角瓶中，摇床培养 (200 r/min)48 h，500 r/min离心5 min，去除杂质，上清液于 9000 r/min、4 离心 10 min，取上清液10。1.3 酶活力的测定标准曲线的绘制：取标准甘露糖水溶液 0、0.05、0.1、0.2、0.3、1.4 mg/mL 各 1 mL 分别置于6 支具塞试管中，各加入 DNS 试剂 1 mL，沸水浴5 min，显色，然后以流水迅速冷却，加蒸馏水8mL，以空白液调零，在 540 nm 处测定吸光度，绘制标准曲线。0.9 mL 0.5% (w/v)角豆胶溶液(由 pH 值 7.0的KH2PO4-NaOH缓冲液配制)，50 保温 5 min，加入 0.1 mL 适当稀释的酶液，60 水浴 10 min，DNS 法2测还原糖含量。在上述条件下，每 min释放相当于 1 mol D-甘露糖的还原糖所需的酶量为一个酶活单位(U)。2 结果与分析2.1 标准曲线的绘制按照 1.3 方法测得数据绘制标准曲线见图 1。2.2 粗酶液的酶活由酶活力的定义计算得到粗酶液的酶活为78.59 U/mL。2.3 单因素条件下 -甘露聚糖酶水解效果的研究2.3.1加酶量对 -甘露聚糖酶水解效果的影响取自制酵母细胞壁 0.8 g，加入到水、酶液中，加入的酶液占总体积的30%、40%、50%、60%和70%。水解 5 h 后，迅速取出放在沸水浴中灭酶活。离心取上清液，测定水解液中甘露低聚糖的含量。加酶量对 -甘露聚糖酶水解效果的影响见图2。从图 2 中可以看出，在 -甘露聚糖酶水解自制酵母细胞壁的过程中，随着 -甘露聚糖酶的添加量的提高，水解产物中甘露低聚糖的浓度也提高。在酶用量达 50%后，随着 -甘露聚糖酶的添加量的提高，甘露低聚糖的浓度提高的趋势不大。因此，选加酶量为 50%为最佳范围。2.3.2水解时间对 -甘露聚糖酶水解效果的影响取自制酵母细胞壁 0.8 g，在 -甘露聚糖酶最适用量的条件下，60 下分别水解 2、3、4、5 h 和 6 h，迅速取出放在沸水浴中灭酶活。离心取上清液，测定水解液中甘露低聚糖的含量。水解时间对 -甘露聚糖酶水解效果的影响见图 3。从图3 中可以看出，在 -甘露聚糖酶水解自制酵母细胞壁的过程中，随着 -甘露聚糖酶水解时间的增加，甘露低聚糖的含量也随之增加，当水解4 h 后含量继续延长时间，但增加趋势变小。因此，选择4 h 为最佳水解范围。2.3.3水解温度对 -甘露聚糖酶水解效果的影响-甘露聚糖酶最适用量的条件下，分别在45、50、55、60 和 65 水解 4 h。迅速取出放0.80.60.40.200 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5甘露低聚糖浓度/(mg/mL)吸光度（A）y=1.9269x-0.0374R2=0.9941图 1 甘露糖标准曲线4.204.003.803.6030 40 50 60 70 80加酶量/(v/v，%)甘露低聚糖的含量/(mg/mL)图 2 加酶量对 -甘露聚糖酶水解效果的影响4.204.003.802 3 4 5 6水解时间/h甘露低聚糖的含量/(mg/mL)图 3 水解时间对 -甘露聚糖酶水解效果的影响生物工程8FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY食 品 科 技2009 年 第 34 卷 第 2 期4.94.64.343.7加酶量 底物浓度 水解时间 温度 pH甘露低聚糖的含量/(mg/mL)图 7 因素指标关系图在沸水浴中灭酶活，离心取上清液，测定水解液中甘露低聚糖的含量。水解温度对 -甘露聚糖酶水解效果的影响见图 4。蛋白酶在适宜的温度下其活力最高，从图 4可以看出，在 55 时，甘露低聚糖的浓度最高，随着温度升高，由于酶失去活性，水解效果减弱。因此，选择 55 范围较适宜。2.3.4 底物浓度对 -甘露聚糖酶水解效果的影响5%、6%、7%、8%和 9%浓度的自制酵母细胞壁在 -甘露聚糖酶最适用量的条件下，55 进行水解反应 4 h 后，迅速取出放在沸水浴中灭酶活。离心取上清液，测定水解液中甘露低聚糖的含量。底物浓度对 -甘露聚糖酶水解效果的影响见图 5。从图 5 中可以看出，在 -甘露聚糖酶水解自制酵母细胞壁的过程中，随着自制酵母细胞壁浓度的增加，甘露低聚糖的含量也随之增加，自制酵母细胞壁浓度为 7%时，甘露聚糖酶对自制酵母细胞壁的降解程度达到最大。继续增大酵母细胞壁的浓度，甘露低聚糖的含量却减少，说明底物浓度过大会抑制 -甘露聚糖酶的活性。所以后续实验选取最佳的自制酵母细胞壁加入量为 7%。2.3.5 pH 值对 -甘露聚糖酶水解效果的影响 在-甘露聚糖酶最适用量的条件下，控制一定的 pH值范围进行水解反应，pH 值对 -甘露聚糖酶水解效果的影响见图6。改变 pH 值的大小，即改变溶液中氢离子浓度会影响蛋白酶作用的环境，进而影响酶活性。从图 6 中可以看出，随着 pH 的变化，甘露低聚糖的浓度呈现先增加后减少的趋势，当pH值为 6.0时，甘露低聚糖的浓度最高。因此，选择 pH 值6.0 为最适作用范围。2.4 -甘露聚糖酶水解条件的优化考虑到各因素的相互作用和相互制约导致对水解效果的影响，进行正交实验以确定各参数的最佳组合。按正交表 L16(45)设计实验，以水解液中甘露低聚糖的浓度为测定指标。拟定出实验方案(见表 1)来考察 5 个因素对 -甘露聚糖酶水解自制酵母细胞壁效果的影响。根据以上单因素水解条件，确定最佳水解条件的因素与水平，见表 1。采用 L16(45)表设计实验，实验结果见表 2。根据表 2 各因素的 k、R 的大小，对实验结果进行分析。从图 7 可以判断出，各因素对指标影响的主次顺序为底物浓度加酶量降解时间pH 值降解温度，最优组合是 A3B3C4D3E2。由此得出最佳条件为：加酶量为 55%，底物浓度为8%，水解时间为 4.5 h，水解温度为 55 ，pH值为6.0。由于最优组合并未出现在实验中，所以需要对实验进行验证。验证实验结果见表 3。由验证实验可知，最优组合水解所得甘露低聚糖的浓度与正交实验中出现的最高值接近，所4.704.404.1045 50 55 60 65水解温度/甘露低聚糖的含量/(mg/mL)图 4 水解温度对 -甘露聚糖酶水解效果的影响3.803.603.403.203.005 6 7 8 9 10底物浓度/%甘露低聚糖的含量/(mg/mL)图 5 底物浓度对 -甘露聚糖酶水解效果的影响4.604.203.803.403.005 6 7 8 9 10pH甘露低聚糖的含量/(mg/mL)图 6 pH 值对 -甘露聚糖酶水解效果的影响表 1 因素与水平表1 45 6 3 45 52 50 7 3.5 50 63 55 8 4 55 74 60 9 4.5 60 8水平因素加酶量(v/v，%) A底物浓度(w/v，%) B降解时间/hC温度/DpH 值E生物工程9FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY食 品 科 技2009 年 第 34 卷 第 2 期表 2 正交实验结果实验号因素甘露低聚糖的含量/(mg/mL)A B C D E1 1 1 1 1 1 3.502 1 2 2 2 2 4.243 1 3 3 3 3 4.754 1 4 4 4 4 4.165 2 1 2 3 4 3.816 2 2 1 4 3 4.027 2 3 4 1 2 4.838 2 4 3 2 1 4.179 3 1 3 4 2 4.1610 3 2 4 3 1 4.5711 3 3 1 2 4 4.8012 3 4 2 1 3 4.4313 4 1 4 2 3 3.9914 4 2 3 1 4 4.3315 4 3 2 4 1 4.6216 4 4 1 3 2 4.35k14.163 3.865 4.168 4.273 4.215k24.208 4.290 4.275 4.300 4.395k34.488 4.750 4.353 4.375 4.298k44.322 4.278 4.388 4.240 4.275R 0.325 0.885 0.220 0.135 0.180以选择 A3B3C4D3E2为最终组合。3 结论研究 -甘露聚糖酶水解条件的优化以水解产物中甘露低聚糖的浓度为指标，研究单因素下加酶量、底物浓度、水解时间、温度和 pH 对自制酵母细胞壁的水解效果，进而通过正交实验得到最佳水解条件为：底物浓度为 8%，加酶量为 55%，水解时间为 4.5 h，水解温度为 55 ，pH 值为6.0。目前报道的-甘露聚糖酶都是水解含有 -1,4-D-甘露糖苷键的魔芋粉、角豆角、瓜儿豆等植物原料，对于水解含有 -1,6-甘露聚糖的啤酒酵母细胞壁的研究还未见报道，本实验室保藏的菌种发酵获得的-甘露聚糖酶可以水解含有 -1,6-甘露聚糖的啤酒酵母细胞壁。本实验对影响-甘露聚糖酶水解效果的 5 个因素进行研究并确定了最佳的水解条件，可以为甘露低聚糖的来源、啤酒发酵残渣的有效利用和减少啤酒工业带来的环境污染提供新的思路。参考文献：1 Schombug D, M Salzmann. 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