【毕业学位论文】（Word原稿）高寒植物中不同分子量单宁对牦牛体外瘤胃甲烷产量的影响

兰州大学硕士毕业论文 高寒植物中不同分子量单宁对牦牛体外瘤胃甲烷产量的影响 1 引 言 大气中逐年增加的温室气体（ 度加速了全球气候变暖的速度 (2006; , 2011)。甲烷（ 仅次于 第二大温室气体，其效率较 20 多倍。超过 70%的全球甲烷排放与人类活动有关 (2007)。反刍动物通过瘤胃发酵 ( , 2009) 排放的甲烷在温室气体清单中占 18%( , 2008)。同时，反刍动物甲烷排放 也 导致 2的饲料能损失 ( , 2000)。因此，减 低反刍动物温室气体排放不仅能减缓全球变暖，并且可以改善饲料利用率，提高家畜生产能力 ( , 2007)。 由于青藏高原独特的地理环境 (地球第三极 )，导致了其对气候的变化（尤其是变暖）更加 敏感。青藏高原生态系统的稳定与否，严重影响着周边的许多国家，甚至是全世界的气候变化。牦牛是青藏高原的主要放牧家畜，而 94%的牦牛主要集中分布在中国青藏高原 地区 ，牦牛 主要饲养管理方式还是传统的粗放式放牧管理 ，放牧对青藏高原草场 产生多种影响， 在 满足动物产品 供给 的同时，降低牦牛甲烷排放 能够 减少 饲料 能量损 耗 ，为构建和 谐 稳定 的青藏高原 生态 系统提供 技术支持。 近年来的研究发现，植物的次生代谢物 单宁具有调控反刍动物瘤胃发酵的功效 ,特别是能够降低甲烷排放的作用 引起人们 的 关注。这些化合物对降低瘤胃氨水平、甲烷产量和原虫数量的效果比较明显 （ 1989； 1987； ， 2005； ， 2008； 2008）。 植物 单宁 形成与逆境条件胁迫有关。 强 紫外线、低温、创伤、营养不良、病原体侵袭等均诱导植物产生 单宁 ，以适应外界环境的变化 ( , 1997)。植物中 单宁 因植 物种类、部位及植物所处 生长期 和环境 条件 不同而变化。分布于青藏高原的植物，由于 其生长的环境具有 高海拔、低温、强紫外辐射等 特点 ，在长期的自然选择过程中，已在形态和生理功能等方面形成了一系列 应 对严酷自然条件的适应机制 (卢存福等， 2000;师生波等， 2006)，因此生长在青藏高原地区的许多植物都具有高单宁含量的特点 植物 单宁 调控瘤胃发酵和 降低 甲烷生成的作用 已被大量实验所证实。但因 单宁 含量和作用效果随植物生育期的变化而表现出明显差异；因此我们推断对于 植物单宁 可能因其分子量的季节 性 和植物种类的差异而导致瘤胃调控和甲烷抑制 结果 的不同 。 本实验将基于青藏高原这一特殊的生态环境， 筛选 部分 青藏高原 富含 单宁 的高寒植物种， 提取并纯化出缩合单宁， 并应用 葡聚糖凝胶 色谱柱， 分别根据分子兰州大学硕士毕业论文 高寒植物中不同分子量单宁对牦牛体外瘤胃甲烷产量的影响 2 量大小 进一步 分离为不同组分，作为发酵底物，利用牦牛瘤胃液，进行体外发酵，观测瘤胃发酵参数的变化和产气情况， 在分子水平上筛选对调控瘤胃发酵与抑制甲烷排放具有明显作用的有效成分， 为进一步的开发和利用高寒植物饲料，尤其是高寒灌木 资源 ，调控牦牛瘤胃发酵，提高牦牛生产效率，降低甲烷产量提供 技术 支持 与 理论 依据 。 兰州大学硕士毕业论文 高寒植物中不同分子量单宁对牦牛体外瘤胃甲烷产量的影响 3 一 综述 物单宁的研 究进展 宁的定义 和分类 单宁 是英文 译名， 又称鞣质，是存在于植物界的一类结构比较复杂的高度聚合的多元酚类化合物。 它们是植物体内的代谢产物，而不是体外的转化产物。 单宁能够与蛋白相结合形成难溶于水的沉淀，故能 生皮成革，所以称为鞣质（姚新生等， 1996）。 义 单宁 是指能 够沉淀 明胶、生物碱及其它蛋白质的分子量为 500水溶性 的 多酚化合物 (1962)。 由于最初对植物多酚的性质和应用研究主要集中于其与蛋白质的反应特性，而单宁是体现这一特 性的有效成分，因此单宁这一术语常成为植物多酚的代名词，现在人们比较通用的做法是把单宁作为多酚的一部分。 单宁不是单一化合物，化学成分比较复杂， 根据化学结构和性质，可以将其分为水解 单宁（ 缩合单宁（ 两者常共存。 前者指酚酸或其衍生物与葡萄糖或多元醇主要通过酯 键 形成的多酚，在稀酸、稀碱和 微生物 作用下可水解成较简单化合物，又可分为没食子酸单宁 (水解后可生成没食子酸 )和逆没食子酸单宁 (水解后有逆没食子酸即螺花酸 )，传统药用植物所含多为 水解单宁，如止血消炎的五倍子、保护消化道粘膜的山枝叶、治疗心血管疾病的牡丹根皮等 ; 缩合单宁系氢基黄烷 其衍生物称为儿茶素类 )和氢基黄烷 4其衍生物称为无色花色素类 )的聚合物 (三个单体以上聚合 )， 不能被水解，在酸、碱或 微生物 的作用下氧化脱水而缩合成高分子红棕色不溶于水的“螺红” 沉淀。 兰州大学硕士毕业论文 高寒植物中不同分子量单宁对牦牛体外瘤胃甲烷产量的影响 4 图 单宁的化学结构示意图 (左 : 水解类单宁 右 : 缩合类单宁 ) 食 物中所含单宁主要是缩合单宁，切开的苹果和茶水久置后即有“螺红” 生成。绿茶中单宁实系单宁前体，属儿茶素及其衍生物类，在发酵制成红 茶中经菌催化而氧化缩合为茶黄素、茶红素及茶褐素等，具有缩合单宁的性质。低聚缩合单宁可被微血管吸收进入血液而具有抗氧化作用，而多聚物 (超过三个单体 )无法吸收，或排出体 外，或留在胃肠道中，保护胃壁免受酒精、盐酸的伤害。缩合单宁对反刍 动物不具有毒性，并且缩合单宁与蛋白质结合物能在小肠内部 被降解。缩合单宁还能够抑制瘤胃蛋白质分解细菌，可降低反刍 动物氮的损失和提高蛋白质利用效率，缩合单宁具有杀灭寄 生虫作用从而促进动物健康， 基 本上 会被排出体外。因此缩合单宁对反刍 动物具有重要的营养作用。 宁的资源分布 单宁 ，除苔藓植物很少含有外，广泛分布于植物界，特别在种子植物中分布得更为广泛。单宁存在于植物的皮、木、叶、根、果实等部位。 在极端环境条件下植物中的单宁含量增加。 植物被昆虫伤害所形成的虫瘿 (常含有大量的单宁，如五倍子中所含单宁的量可高达 70%以上，另外还有黑荆树皮单宁、落叶松树皮单宁 (姚新生等， 1996)。 富含单宁的植物主要分布在 中纬度和低纬度 地区，单宁含量高达 20%优质品种甚至高于 40%。这种分布规律，使我国西部 高寒 地区成为得天独厚的植兰州大学硕士毕业论文 高寒植物中不同分子量单宁对牦牛体外瘤胃甲烷产量的影响 5 物单宁资源基地。 高寒植物因其所处的独特地理条件，含 有大量的单宁，对于植物自身免受紫外福射和寒冷的伤害具有很好的保护作用。影响植物中单宁含量的因素主要包括 :一、土壤肥力条件，肥力越低，则单宁含量越高；二、气候条件，温度越高，气候越干，单宁含量越高；三、海拔条件，因海拔变化从而造成各种小环境气候；四、生长时期：植物生长早期的幼嫩枝叶中单宁含量较高，随着植株逐渐成熟，单宁含量下降。 植物中所含单宁的量一般随植物的年龄、存在部位、生长环境、季节等条件不同而有所差异。一年生草本植物一般含单宁量较少 ;木本植物 芯材 中单宁含量随植物年龄增长而增大 ;果实中的单宁随其成熟而含量 下降。又如植物的向阳部位含单宁的量比背阴部位高 ;温热带植物较寒带植物含单宁量较高。植物经采伐放置后，单宁的含量会逐渐降低 (姚新生等， 1996)。 栎树叶中单宁含量随海拔升 高而增加。郭彦军 （ 2011） 等对高山灌木缩 合单宁含量的季节变化动态进行了研究，但有关高山灌木其他酚类物质的测定与研究报道较少。灌木在高寒草地畜牧业经济中发挥着重要作用 ,它既是野生动物和 反刍 家畜不可或缺 的饲 草来源，又在水土涵养和保护生态环境等方面有着不可替代的作用。 (1998)研究发现，由于旱季植物体中碳水化合物的分配发生了改变，用于形成酚类化合物的碳源不足，干旱季节植物体所含的叶蛋白和酚类化合物的量明显降低。经过一个湿季后，植物中叶蛋白含量和缩合单宁含量提高，而水解单宁含量保持不变。红豆草是一种单宁含量比较高的植物，萌发期全株单宁含量最高，为 34.5 g/着生长期的延长单宁含量逐渐下降，在成熟期只有 13.4 g/ 灌木和牧草中单宁含量的高低直接关系到家畜的采食量和健康水平。如果认识不够或利用不当，会严重影响畜牧业生产水平。据 (1999)报道，当采用体外产气法 (In 定青藏高原几种牧草和灌木样品的产气量时，添加单宁吸附剂聚乙二醇 (，样品 12 小时和 24 小时的产气量明显增加 (的饲料时，会抑制瘤胃微生物的活动，甚至毒害家畜。 日粮中单宁含量超过 5%可能会对采食量有负面的影响，较低的浓度对反刍动物采食量没有影响 (. J 等 , 1999)。这已经牵涉到降低了日粮的适口性、在瘤胃中的消化率和瘤胃条件的优化 (2006; 2008)。 (2003)观测到在绵羊日粮中添加 白坚木 单宁 0, 3 g/W(相当于 0, 28, 83 和 166 g/，当含量 1.5 g/是在最高计量时，采食量显著降低。相同地， 白坚木 缩合单宁添加到 2%时，没有影响到肉牛采食量 ( , 2007)。更进一步，日粮和单宁的相互作用可能影响到自由采食量。例如，给饲喂新鲜野豌豆的羊羔中添加 白坚木 单宁 (饲喂相同的没有添加单宁的 日粮 羊羔相比，降低了日粮采食量 (768 956 g/d)，同时当给小羊羔饲喂精料基础的日粮时， 单宁没有影响采食量 ( , 2009)。 (2005)研究表明：当日粮中添加 黑荆树 单宁时，绵羊的采食量增加了，同时抑制了甲烷产量，这在实际应用中进行饲料添加剂技术是非常重要的。 兰州大学硕士毕业论文 高寒植物中不同分子量单宁对牦牛体外瘤胃甲烷产量的影响 12 合单宁对反刍 动物蛋白质消化的影响 缩合单宁与蛋白质的相互结合主要通过疏水作用与氢键作用，几种因素影响缩合单宁与蛋白质之间的反应，但主要因素是 ，缩合单宁的类型和分子量不同使其与蛋白质结合的产物对 的耐受能力不同。 977)报道，缩合单宁能在 条件下与在瘤胃内与蛋白质结合形成缩合单宁蛋白复合物，这种 复合物 在能在 低于 高于 分离释放出蛋白质。最近很多报道研究认为，缩合单宁对蛋白质及酶的沉淀可分为两步，首先是缩合单宁与一个蛋白质分子表面结合，形成化合物。之后会和多个蛋白质分子间形成交联，而凝聚乃至沉淀。 缩合单宁本身是高分子聚合物、具有高度开放的和可变的三维结构，所以缩合单宁活性的化学结构也影响缩合单宁对蛋白质的保护作用， (2003)在同样的浓度下， 高原百脉根 和 百脉根 提取的缩合单宁， 高原百脉根 能更有效地降低瘤胃微生物对 核酮糖二磷酸梭化酶一加氧酶蛋白质的降解。 百脉根 中缩合单宁的平均分子量 ( 1900 高原百脉根 的缩合单宁平均分子量为 2200 此，在有关缩合单宁保护蛋白质不受降解的研究中，缩合单宁的分子量需要考虑。 (2007)在试验中，给绵羊饲喂不同分子量 的缩合单宁，发现分子量高的缩合单宁在同样浓度条件下， 对饲料蛋白质的保护效果越强。说明缩合单宁的分子量决定其与蛋白质结合的能力。 宁对瘤胃甲烷生成的影响 许多含有单宁的植物或者单宁的提取物都被报道在体内、体外研究时能够降低甲烷产 量。白坚木单宁对甲烷生成过程的抑制作用已经在不同的试验中被证实。 (2009)报道白坚木单宁对甲烷产量的抑制 (13与剂量 (5底物 )成线性关系。 (2005)报道白坚木单宁 (75%度为 1-2 g/L 时能在体外条件下抑制甲烷产量的 同样地，牛放牧在繁殖季的白三叶草地，饲喂白坚木单宁 63 天 (10g/采集它们的瘤胃液，体外研究发现甲烷产量降低了 25 ,2006)，但是在生长季的白三叶草地上的研究表明没有抑制 作用 ( , 2006)。 (2007)当饲喂白坚木的提取物(10g/肉牛 28 天时，没有发现任何对甲烷产量的影响。其它来源的单宁提取物，在 含羞草 和 栗子 单宁 (1并饲喂大豆时 ,体外甲烷产量分别降低了 , 2002)。同样添加 黑荆树 单宁提取物到日粮中，饲喂绵羊 ( , 2005)和牛 ( ,2009)21 天降低了甲烷生成。 不同来源的含有单宁的饲草在体内和体外研究表明能够抑制甲烷排放。 朱樱花 中的单 宁在体外试验中证明能够导致每克有机物中营养物质降解率和甲烷排兰州大学硕士毕业论文 高寒植物中不同分子量单宁对牦牛体外瘤胃甲烷产量的影响 13 放降低 ( , 2003b)。随着体外发酵使用底物中红豆草比例的增加，甲烷产量的抑制作用更加地明显 ( , 1999)。 (2002)研究了给黑白花奶牛和泽西乳牛饲喂 冠状岩黄芪 后的甲烷产量和产奶量。放牧在 冠状岩黄芪草地的奶牛干物质日采食量和固态日牛奶产量高于放牧在黑麦草草地的奶牛。日甲烷产量相当，但是前者每单位的干物质采食量和固态牛奶产量排放的甲烷产量降低。在饲喂 百脉根 青贮饲料后也发现了相同的结果 ( , 2001)。 在给小羊羔饲喂 百脉根 后，抑制了 16%的甲烷生成，因为其中含有缩合单 宁( , 2002)。 (2005)报道在 体外瘤胃发酵 12h 时甲烷产量(mL/g 苜蓿 (25于 百脉根 (后者中含有 缩合单宁。从添加了 乙二醇 )之后 百脉根 甲烷产量增加了 17%，但是 紫花苜蓿 没有变化。给安哥拉山羊饲喂含有缩合单宁 ( 铁扫帚 后与饲喂螃蟹草 /牛毛草后相比降低了甲烷产量 (7.4 10.6 g/d 和 6.9 16.2 g/M) ( , 2005)， 干物质采食量 (kg/d)和可降解干物质采食量 (kg/d)饲喂 胡枝子 后比螃蟹草 /牛毛草高。 (2008a)发现给山羊饲喂不同水平的 鸡眼草 后甲烷产量降低，是因为其中含有缩合单宁 ( , 2008b)。其它的一些植物如 波叶大黄 , 越橘 , 岩白菜素 , 火炬树 和 盾叶天竺葵 ( , 2009),芒果 和 银合欢 被证明能够抑制甲烷生成 ( , 1998)。 研究表明甲烷生成的抑制作用与剂量、单宁类型和来源 以及 饲料类型相关。 (2006)研究表明饲喂同样剂量的 白坚木 单宁，在生殖 生长 阶段小麦草 地放牧 的牛降低了甲烷产量，但是放牧在 营养 生长阶段的小麦草草地 甲烷产量 没有影响。 (2009) 报道从 杨梅 中提取的水解单宁样品 (13% HT/M)比从栗子树中提取的水解单宁 (HT/抑制产甲烷古细菌方面 (6用强。在厌氧发酵中，没食类鞣酸聚合物比水解单宁单体更能抑 制甲烷的生成 ( 1987)。 黑荆树 缩合单宁在奶牛中的甲烷抑制作用随着单宁剂量增加而增加 ( , 2009)。同时，有很多报道也发现单宁 对甲烷产量没有影响， (2002b)研究在以干草 20%水解单宁 )(5和 10.1 g/与空白相比甲烷产量增加了 虽然在本试验中甲烷产量的增加原因还不清楚，单数说明低剂量的水解单宁在甲烷减排方面没有作用。日粮中含有单宁可能降低纤维降解率，从而降低甲烷 产量。 合单宁对瘤胃 甲烷 细菌的影响 单宁会抑制瘤胃微生物繁殖，降低微生物利用硫的效率，使微生物不能正常繁殖，从而影响瘤胃的正常发酵功能。 (1999)发现从 百脉根 和 高原百脉兰州大学硕士毕业论文 高寒植物中不同分子量单宁对牦牛体外瘤胃甲烷产量的影响 14 根 提取的缩合单宁 (237mg/够显著保护 1， 5一结果显示体外研究形成最大蛋白酶抑制能力的缩合单宁，浓度大约为 400 mg/更高。 (2001)研究也证实了这一点，他发现 400 mg/更高浓度的缩合单宁能抑制瘤胃许多种细菌的生 长。这些研究结果显示，饲料中缩合单宁能显著抑制瘤胃蛋白质分解菌的生长和降低体内一些蛋白质分解菌的数量。 大量的研究已经证实单宁能够抑制瘤胃产甲烷菌，但机理 尚不清楚 。 (2005)首次报道了单宁能够抑制培养时的瘤胃产甲烷菌。他们研究了 高原 百脉根 提取物的缩合单宁对瘤胃甲烷短杆菌 影响。缩合单宁的聚合体部分测定甲烷产量时没有抑制性。低分子的聚合物能够完全抑制 甲烷测生成，降低 烷产量的 65%。对两种菌种的抑制作用， 有细胞活性，但是 有细菌活性，甚至很长一段时间内都没有恢复。在平板试验中，发现涂有小分子聚合物的区域在接下来的几周内仍有抑制作用。 实验结果表明，在一定范围内，高分子的单宁对微生物的抑制作用比低分子单宁更强，但是超出一定范围， 则无明显差异。可能 因为 高分子量单宁含有更多的酚羟基官能团，能够更牢固有效的结合细菌细胞壁上面的糖蛋白，对产甲烷菌产生毒性和抑制作用。但是过高分子单宁不能够渗透到细菌蛋白，对产甲烷菌的毒性降 低 ( , 1989)。从这篇研究中显示，缩合单宁对产甲烷菌的抑制作用肯与单宁的 分子量以及 甲烷菌 的种类相关。 通过混合培养研究， (2009)混合了白坚木的单宁样品，包含 水解单宁 ( 缩合单宁 (在 50 g/合底物时没有降低产甲烷菌数量，但是在 100 g/物时对产甲烷菌产生了抑制作用。另一白坚木样品包含 水解单宁 ( 缩合单宁 (在 50 g/底物时对甲烷菌产生了抑制作用，在 250 g/物时也观测到了抑制作用 ( , 2009)。但是， 含羞草 单宁样品包含 水解单宁 ( 缩合单宁(高到 250 g/物都没有对甲烷菌的生长产生任何影响，然而由于抑制了原虫的生长甲烷产量直线下降。这些研究都反映了单宁对甲烷生成过程的影响依种类和剂量的不同而有所差异，是通过抑制甲烷菌的生长或者原虫的生长而实现的。不同来源的单宁对原虫的毒性作用在许多报道中都有研究 ( , 2008b; , 2009; , 2006a)。 瘤胃微生物可以通过单宁的解毒作用、合成单宁配位聚合物和形成胞外多糖蛋白复合物来适应单宁的毒性 ( ,2005)。还没有研究揭示产甲烷菌能够克服单宁的毒性影响。在非瘤胃产甲烷菌研究中，没食子单宁聚合物对甲烷菌的兰州大学硕士毕业论文 高寒植物中不同分子量单宁对牦牛体外瘤胃甲烷产量的影响 15 毒性作用能够坚持 2 个月，但是，单宁单体的毒性作用不能够持久 (1987)。 研究的目的与意义 近年来，植物单宁作为动物饲料添加剂 ，被国内外所广泛关注。我们发现青藏高原的部分高寒植物富含单宁，并在藏系家畜饲料营养平衡和生产方面发挥着重要作用。 反刍动物甲烷排放导致 2%的饲料能损失。因此，减低反刍动物温室气体排放不仅能减缓全球变暖，并且可以改善饲料利用率，提高家畜生 产能力。 本实验将基于青藏高原这一特殊的生态环境，应用 葡聚糖凝胶色谱柱 ，将从高寒植物中提取的缩合单宁进一步分离成不同分子量集团 (通过体外实验 (统地研究不同分子量及含量水平对瘤胃发酵参数及甲烷抑制效果的影响。 为开发高纯度、高活性和高稳定性调控瘤胃与抑制甲烷生物饲料添加剂提供原料， 以期研发出既对环境友好，又能改善动物生产能力的“双赢”天然饲料添加剂， 为促进我国反刍畜牧业的发展和减轻温室气体排放做出贡献。 兰州大学硕士毕业论文 高寒植物中不同分子量单宁对牦牛体外瘤胃甲烷产量的影响 16 二 材料与方法 验点自然概况 采样地点位于天祝 藏 族自治县 甘肃农业大学高山草原试验站。地理坐标北纬37 11 12，东经 102 29 33。海拔处于 2900间，气候寒冷潮湿空气稀薄，太阳辐射强；年平均气温 ， 7 月平均为 ， 1月平均为 ，大于 0 积温为 1522 。年平均降水 424.5 蒸发量1430.4 绝对无霜期，但植物生长期仍有 120（路远， 2006）。区内土层较薄，厚度为 40壤 机质含量高，为 10土壤为高寒灌丛草甸 土（张德罡， 1999）。 该区植被属青藏高原植物亚区。草地类型主要有：金露梅灌丛草地；杜鹃 +高山 柳 芽蓼草地，线叶嵩草草地；禾草 远镇有草原 亩，主要饲养家畜有牦牛、绒山羊和高山细毛羊等，主要饲养方式是传统 自然 放牧。 验材料 2011 年的 8 月 1 日， 9 月 1 日， 10 月 1 日 ， 分别从试验点高寒草甸样地和高寒灌丛草甸 样 地采集 珠芽蓼 ( 金露梅 (高山绣线菊 ( 高山柳（ 藏沙棘（ 5 种高寒植物，选取当地种植的 8 月份 燕麦干草作为对照。选择这 5 种植物 样品 的原因是 这 5 种植物营养丰富， 家 畜喜 食，分布广泛， 是较好的饲料资源， 且 富含单宁， 对牦牛体外瘤胃甲烷产量有抑制作用 （ 丁学智， 2006；米见对， 2011；薛树媛， 2011.）。 样品采集原则 :高山 柳、高山绣线菊、金露梅、藏沙棘 等灌木采集动物喜食的叶和嫩枝，珠芽寥主要采集叶，每个样品必须随机采集大于 50 颗植株，采集的样品装入液氮罐 。 带入实验室采用冻干机 冻干，粉碎过 l ，储存于密封的自封袋 4 保存备用。 兰州大学硕士毕业论文 高寒植物中不同分子量单宁对牦牛体外瘤胃甲烷产量的影响 17 品的分析 品粗蛋白的测定 采用凯氏定氮法测定粗蛋白 (002)，试验中所用仪器是上海纤检有限公司的 氮仪。 性洗涤纤维和酸性洗涤纤维的测定 测定参照 ( , 1991)，其中 在无 物质和灰分的测定 干物质和灰分的测定依据杨胜 (1993)提供的方法 测定。 单宁的测定 总单宁的测定利用 测定。 单宁的提取： 用容积为 25 烧杯称取 200 碎的样品，加入 5 70%），室温超声波处理 20 处理好的离心管， 3000 g， 4离心 10 集上清液，冰浴保存，再次用 5 酮（ 70%）将沉淀转移至烧杯，并再次室温超声波处理 20 上所述离心并收集上清液。 试剂及药品 : 剂（ 1N）：用等体积的蒸馏水稀释 剂（ 2N），将其转移至棕色瓶中 4保存。正常是金黄色，若变成橄榄绿则废弃不用。 20%的碳酸钠溶液：称取 40 g 十水碳酸钠，用 150 馏水溶解，并定容到 200 (注：换算到碳酸钠百分数应该是 业购买。 没食子酸溶液（ 0.1 mg/溶解 25 食子酸于 25 馏水中，然后用蒸馏水稀释 10 倍。如表 置标线（现配现用）。 兰州大学硕士毕业论文 高寒植物中不同分子量单宁对牦牛体外瘤胃甲烷产量的影响 18 表 没食子酸的标线 试管 没食子酸溶液（ 蒸馏水 （ 剂 （ 碳酸钠溶液 （ 没食子酸 （ 2 6 0 总酚的测定 ： 加整数体积的提取液到测试管中（ 用蒸馏水将总体积补齐到 入 剂， 酸钠溶液，漩涡混匀，在 25 恒温摇床上振荡 40 ， 725 测定吸光值。总酚的测定用等量的没食子酸表示（通过标线读取），结果以干物质百分比表示总酚含量（ x%）。 例如： 50 提取液在反应后的吸光值是 当量的没食子酸（从标线读取）。因此 1取液含有 97.9 食子酸 =200品用了 10提取液。因此， 100 品有 5=果样品的干物质含量是 95%， 那么没食子酸占干物质的百分比是： 除去提取液中的单宁 ： 称取 100 00 12入 1.0 馏水，然后再加入 1.0 提取液。漩涡混匀，在4 下放置 15 漩涡混匀，然后 3000 g 离心 10 集上清液。如上所述测定总酚的方法测定其中不含单宁酚类的含量（测定样加入量应该比测定总酚时的高）。不含单宁酚类含量以干物质的百分比表示（ y%）。 用 理后的 100清液反应后的吸光值是 当量的没食子酸。因此， 1 清液 =10 品有 为提取液被稀释了两倍） 。 所以， 100品中含有 0=y=品干物质含量是 95%） =但是总酚的干物质含量是 x=（ 是和没食子酸相当量的单宁干物质百分比。 合单宁的测定 缩合单宁含量的测定参照 方法（ 1986） 试剂：丁醇 盐酸试剂（ 95 5 v/v）： 950醇与 50 7%)混合铁试剂（ 2N 含 2%的硫酸铁铵）：将 蒸馏水定容到 100 高寒植物中不同分子量单宁对牦牛体外瘤胃甲烷产量的影响 19 制成 2N 确称取 2.0 g 硫酸铁铵溶于此溶液（ 2N 即可，该试剂须保存在深色瓶中。 操作步骤：在 100 12 玻璃试管中，加入 70 丙酮稀释的提取液（丙酮的量应该足够大以防止在本化验中吸光度超过 在试管中加入3.0 醇盐酸试剂和 0.1 铁试剂，涡旋试管，盖上试管盖，在沸水浴中处理 60 却后于 550 比色，记录吸光度。缩合单宁（以每 物质为基础）采用无色花青素当量按以下公式来计算： 缩合单宁当量（ 释因子） /物质 注：稀释因子为： 0.5 取液用量 标准曲线的制作 试剂： 液（ 20%）：称取 40 10于约 150 馏水中，然后定容至 200 准单宁酸溶液（ 0.1 mg/将 25 宁酸溶于蒸馏水 25 ，然后用蒸馏水以 1： 10 稀释（现配现用）。按表 浓度的标准液。 表 准曲线 试管 没食子酸溶液 （ 蒸馏水 （ 剂 （ 碳酸钠溶液 （ 没食子酸 （ 2 6 0 合单宁的纯化 机溶剂萃取初步纯化 需要仪器：振摇器，离心机， 5 心管，天平， 化纤维滤膜，真空过滤器，分液漏斗，旋转蒸发仪， 500子。 所需试剂：提取液 含 (w/v) 抗坏血酸 的 70% (v/v)的丙酮溶液 ；二乙基醚； 40%(v/v)的甲醇。 根据 5 种植物样品 3 个月份中的 总单宁和缩合单宁含量的测定结果， 按照含量最大原则，将每个植物筛选出一个月份的植物样品进行进一步的分析研究。 （ 1） 200 离心管装 200 冻干样品，加提取液（ 含 (w/v) 抗坏血酸 70% (v/v)的丙 酮溶液） ，室温下振摇 20 分钟， 3500 g 离心 10 用兰州大学硕士毕业论文 高寒植物中不同分子量单宁对牦牛体外瘤胃甲烷产量的影响 20 150 100 取液提取两次。 （ 2）用 硝化纤维滤膜真空过滤，除去杂质。 （ 3）冲洗滤液三次，每次用分液漏斗加等体积的二乙基醚以除去叶绿素，色素及低分子量的酚酸。 （ 4）用旋转蒸发仪（不高于 40 ）除去丙酮和二乙醚。提取物放入 500 入等体积的 40%(v/v)的甲醇。 聚糖凝胶柱进一步纯化 所需仪器：填充柱； 联葡聚糖；超声波仪 ； 化纤维滤膜，真空过滤器，旋转蒸发仪，冻干机，冰箱。 所需试剂： 40% (v/v)的甲醇； 80% (v/v)的丙酮。 混合溶液通过排阻色谱法纯化，使用 联葡聚糖 充柱，40% (v/v)的甲醇和 80% (v/v)的丙酮分别作为流动相 ( , 1990)。 （ 1） 纯化使用 柱子的规格为 40 cm x 16 mm K 16 (B, 填充 联葡聚糖 (B, 流速 1ml/ （ 2） 纯化之前，葡聚糖用 40% (v/v)的甲醇浸泡溶胀过夜。所有的溶液注入之前先脱气和 硝化纤维滤膜真空过滤。 （ 3） 纯化过程中，流速 1 ml/分子量的酚被 40% (v/v)的甲醇洗堤， 80% (v/v)的丙酮溶液洗 脱 。 （ 4） 纯化的 旋转蒸发仪除去丙酮和甲醇。 （ 5）将纯化的 总 干， 4 避光保 存。 离 纯化的 总 同组分的 小到大分离使用 交联葡聚糖 填充柱，填充交联葡聚糖B). 所需仪器：蠕动泵，分光光度计， 联葡聚糖，填充柱。 所需试剂： 50% (v/v)的丙酮， 1 mg/单宁丙酮溶液， （ 1）纯化的缩合单宁粉末使用 50% (v/v)的丙酮水溶解为浓度 1mg/ （ 2）柱的洗堤的流速通过一个蠕动泵 (格控制为 1.2 mL/合剂通过柱子洗堤 5 （ 3）接着，在采集 分之前，添加 50% (v/v)的丙酮水溶液洗堤 16 分钟。 （ 4）然后采集分析物（ 馏分）。每 30s 采集一次馏分。 （ 5）在 350吸收光谱测定，根据洗脱时间顺序和光谱读物相似性将所兰州大学硕士毕业论文 高寒植物中不同分子量单宁对牦牛体外瘤胃甲烷产量的影响 21 有馏分分为 5 组。 凝胶参透电泳法 （ 测定各 组分 单宁分子量 所需仪器：凝胶参透电泳色谱仪，三种柱子 ( 所需试剂：四氢呋喃；聚苯乙烯 ； 醋酸酐 ； 甲醇 。 样品处理 :称取单宁粉末 50 带盖螺 旋口试管中，加 l 啶 溶解样品，然后加入 l 酸酐，充氮气，于 45保持 24h 后加入 l 醇， 8 2N 洗有机相，最后用无水 有机相进行色谱分析。 色谱条件 :分析柱 动相 :速 :样量 :10测波长 :254温 :室温。 鉴定方法 : 凝胶 渗 透色谱法 （ 1）将三种 柱子 (按照适用分子量排序分别为 000, 10000 0000 顺序联接。 （ 2）排阻色谱中被测物质分子量的对数与其在色谱柱上的保留时间成线性关系，根据标准分子量图谱做校正曲线，得到回归方程 y=y 为x 为保留时间 )，其中 r= （ 3）纯化单宁用四氢呋喃溶解。四氢呋喃也用于溶剂系统，流速为 1ml/5 。然后由实际测得样品的保留时间来计算分子量 (虞志光， 1984) 。 （ 3）使用范围在 16200 聚苯乙烯作为校准物，计算出相对分子质量。 使用 和 表单宁的相对分子质量。多分散性指标 (表各个分子量的分布。 计算通过 件。 N 数均分子量 =求和各组分分子量 *组分摩尔数 /总摩尔数。 w/合度 of 原花青素衍生物的构成的基础上估算为大约 500 ( , 1983)。 外发酵实验 材料和仪器 验供体 2012 年 9 月 7 日于早晨放牧前，用瘤胃管采集 3 头自然放牧的去势公 牦 牛兰州大学硕士毕业论文 高寒植物中不同分子量单宁对牦牛体外瘤胃甲烷产量的影响 22 (50 士 胃液到提前保温 (39 )好的广口瓶内并混匀，迅速用四层纱布过滤到温浴 (39 )好的烧杯中，测定 10菌 离心管采集两管瘤胃液，迅速投入液氮罐，带回实验室保存在 箱，待测。其它的瘤胃液迅速用于准备好的体外发酵试验。 外发酵试验装置 人工瘤胃装置 ： 100玻璃 注射 培养管，最小分度 1 注射 培养管 前端连接有 5 右的乳胶管，乳胶管上配套有止水夹，起到密封的作用。 二氧化碳气体 ： 购买自兰州兰梅光明低温产品有限责任公司的 作为体外发酵过程中厌氧环境的气源。 恒温水浴箱 ： 采用 智能恒温 水浴 箱作为 体外发酵的恒温控制 装置 。体外发酵试验前一天 将 注射 培养管在 39预热的状态 下 ，给注射器活塞 涂抹适量的凡士林 以便密封 。 并将涂抹好凡士林的注射培养管 39恒温过夜备用。 分液装置 ： 采用西德生产的 通用分液装置 ， 用于 混合发酵液 的分装，分装范围从 0小分度为 1 需溶液的配置 表 工瘤胃营养液配置表 溶液 微量元素 缓冲液 常量元素 刃天青 还原剂 各组分组成及重量 .7 g .2 g .6 g 00285体积 蒸馏水 100馏水 1000馏水 1000馏水 1000工营养液配制所需各组分的体积 b 37 37 0 注 a 可储存 可储存 可储存 可储存 现配现用 a 均储存于棕色瓶 b 先加 474 馏水，再按表中各组分的体积从左到右添加 人工营养液的配置 ： 人工 瘤胃 培养液由微量元素溶液、缓冲溶液、常量元素溶液、刃天青溶液和还原剂溶液组成。 各组分的 的配置见表 兰州大学硕士毕业论文 高寒植物中不同分子量单宁对牦牛体外瘤胃甲烷产量的影响 23 用前按表 制好 人工瘤胃营养液 ，不断通入 需通入到容器底部 )，并预热至 39 后约 30 合液颜色变淡或至无色。 人工瘤胃营养液的配置：将采集瘤胃液与准备好的人工瘤胃营养液 （体积比为 1:2） 混合 ，制成混合人工瘤胃培养液， 39 恒温， 用磁力搅拌器搅拌，同时通入无氧 验 处理 将 燕麦干草 称 取 500 5 为发酵底物 ，加入 54 00 目 )的自制尼龙袋 (长： 5： 2并用细尼龙线密封。 注射器中 添加 50 工