【毕业学位论文】（Word原稿）硫酸盐对Rhodococcus sp. LY822脱硫代谢影响的研究及脱硫基因的克隆表达-微生物学硕士论文

密级： 论文编号： 学位论文 硫酸盐对 硫代谢 影响 的 研究 及 脱硫基因的克隆表达 I 摘 要 本论文 以 脱硫菌 出发菌株， 开展 了 硫酸盐对 脱硫代谢 的影响 、 脱硫基因克隆表达及 重组菌 脱硫活性 的 研究 ， 初步 阐明了脱硫代谢机 理， 验证了脱硫酶生成的 硫饥饿 诱导机制 。 1 研究 了 不同浓度的 胞 生长和 脱硫的 影响。 浓度范围内 对 的生长没有影响， 但 对 其 生长细胞 脱硫 活性 具有 抑制 作用 ；在 有 以上的 ， 生长细胞的粗 酶 液 在 脱硫反应 48 h 内没有 2成， 而 以下 时 ，其脱硫反应能生成 2有脱硫酶 的 无细胞粗提液的脱硫活性 无 抑制作用 。 研究 表明， 以上 浓度 的 遏脱硫酶的生成， 而 以下浓度能诱导脱硫酶生成， 从而 验证了 脱硫微生物 脱硫酶 生成 的 硫饥饿 诱导机制 。 2 克隆了 脱硫基因的启动子 ， 构建了 动子 告基因表达载体 并转化原始菌 （ ，激光共聚焦显微镜和荧光分光光度计检测 结果显示， 无 在 0.1 倍 ， 证实了脱硫基因的表达受 硫酸盐的阻遏 ； 果显示， 0.2 在 时 下培养的 的 全细胞蛋白 有与 交的特异性条带生成 ，而 0.2 则 无 特异性条带产生，进一步证明了脱硫 酶的生成 受到硫酸盐的阻遏 ； 以 的总 模板进行 0.2 培养 的 ，可扩增得到与脱硫基因 小相对应的 段；而 0.2 培养 的 ，未扩增到特异性条带， 表明 硫酸盐对 脱硫 基因表达 的调控作用发生在转录水平上。 3 克隆了 脱硫基因 在大肠杆菌 得到 高效 表达，与 100%和 证实了红球菌脱硫基因的高度保守性； 3种重组大肠杆菌的无细胞粗 酶 液脱硫反应的代谢产物与已报道的 4中的相应代谢产物一致，证 明 4；重组大肠杆菌无细胞粗提液表现出比原始菌 （ 更高的脱硫活性。 4 构建了 达载体 转化至消除质粒的原始菌（ 不具 备 脱硫特性的紫红红球菌 （ O. 10494） 中， 所获重组菌均具有 脱硫反应 活性，并不受硫酸盐影响。 研究结果为构建不受硫酸盐阻遏的 高效脱硫 基因工程菌奠定了基础 。 关键词 ： 生物脱硫 ， 硫酸盐 ， 二苯并噻吩 ， 红球菌 ， 脱硫基因 n of on of of 1. of .4 2in 8 . of by , by . of 2. of of of .1 of by of in .2 no in a of of to NA as to in no in In of to at of 3. in of of -S BT it 4S 4. O. 10494). BT of 录 第一章 文献综述 . 1 言 . 1 氢脱硫技术 . 1 物脱 硫技术 . 2 一性脱硫菌 . 2 生物脱硫的 径 . 3 一性脱硫途径 . 4 硫基因相关研究 . 6 一性脱硫微生物 应用研究 . 9 究目的和意义 . 10 究内容 . 10 第二章 硫代谢的影响 . 11 言 . 11 料与方法 . 11 株和质粒 . 11 养基 . 12 生素 . 12 剂 . 12 器设备 . 13 细胞生长和脱硫活性的测定 . 13 硫基因启动子特性的分析 . 14 硫基因转录的分析 . 18 硫酶的 析 . 19 果与讨论 . 20 胞生长和脱硫的影响 . 20 脱硫基因启动子特性的影响 . 23 脱硫酶的产生的影响 . 28 硫基因转录的影响 . 29 结 . 30 第三章 硫基因的 克隆表达 . 31 言 . 31 料与方法 . 31 株与质粒 . 31 培养基 . 32 生素 . 32 剂 . 32 器设备 . 33 脱硫基因的克隆、表达载体的构建及其酶活测定 . 33 含脱硫基因 穿梭质粒载体的构建 . 37 内源质粒的消除 . 41 化消除质粒的原始菌 无脱硫活性的紫红红球菌 10494 . 41 组菌的脱硫活性测定 . 42 果与讨论 . 42 脱硫基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达 . 42 脱硫基因 克隆及其在消除质粒的 原始菌和无脱硫活性的紫红红球菌中的表达 . 48 结 . 54 第四章 结论与展望 . 55 参考文献 . 56 附录 A 准曲线 . 65 附录 B 光密度 . 66 致谢 . 67 作者简历 . 68 V 英文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 物脱硫 氢脱硫 2苯并噻吩 苯并噻吩亚砜 苯并噻吩砜 甲基亚砜 一性脱硫基因 色荧光蛋白 -(2基联苯亚磺酸盐 效液相色谱 丙基 克隆位点 百万分之一 糖体结合位点 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 文献综述 1 第一章 文献综述 言 目前，我国汽油、柴油的硫含量比发达国家高 1数量级，燃烧产生大量的一氧化碳、氮氧化物（ 碳氢化合物（ 硫氧化物（ 可吸入颗粒 物（ ，已经成为城市的主要空气污染源。降低污染物排放的关键是降低石油产品的硫含量，因为硫的存在不仅造成 排放，还会导致汽车尾气催化剂中毒，引起其他几种污染物排放量的增加 。 世界各国对汽油、柴油中硫含量的要求越来越严格， 欧美、日本、加拿大等发达国家均制定了日益严格的超低硫柴油和汽油生产标准（ et 2000） ， 规定 2003柴油硫含量标准为 50 至要求在 10下，汽油硫含量标准为 50 下。我国 是 石油生产和燃料消耗的世界大国之一 ，也正在对汽油、柴油 的 硫含量提高要求 。石油产品深度脱硫技术的研究已成为目前世界各国非常关注的研究课题（ et 1999）。 化学脱硫技术（催化加氢）、物理脱硫技术（吸附脱硫）和生物脱硫技术是目前 研究最多 的石油脱硫技术。 催化加氢脱硫技术发展最为成熟，在石化工业中被广泛采用，该技术可有效地脱除无机硫和简单的有机硫化合物，而对于稠环噻吩类含硫化合物，如二苯并噻吩（ 特别是烷基取代 生物，催化加氢脱硫技术则难以将其脱除。生物脱硫技术 (有条件温和、选择性高 以及不损失燃料燃烧值等优点，深受人们的关注， 被认为是最具有应用前景的石油深度脱硫技术。 （ 1990）以 唯一硫源分离得到了一株专一性的脱硫微生物，引发了微生物脱硫研究的高潮。脱硫微生物能够在温和的条件下通过菌体内的多种酶连续地催化氧化 其中的硫以亚硫酸盐的形式脱除，而其余的结构以 222形式保留在油相中。这一途径最大限度地保持了燃料的燃烧值，并且脱硫过程无有毒物质产生 ，是更具发展潜力的脱硫技术（ et 1993）。 我国从上世纪 80 年代起 开始石油生物脱硫的研究。虽然起步较晚，但发展速度很快，并取得了一定进展。目前我国石油的生物脱硫技术逐步从实验室研究水平进入初步的中试阶段，但与发达国家的脱硫技术相比还有较大差距。继续深入研究 微生物脱硫代谢机理 和开发石油生物脱硫技术，生产含硫量低的石油产品， 具有重要的社会和经济意义 。 氢脱硫技术 近年来石油炼制 过程 中的加氢 脱硫 技术引起 人们的极大关注。一方面加氢脱硫的加工量逐年增加，另一方面其基础研究日益活跃。加氢 脱硫（ 在高温（高于300 ）、高压、氢气和金属催化剂存在的条件下进行脱硫反应。脱硫 效果的 难易程度取决于化合物的类型， 不同类型的含硫化合物脱除难度不一致， 脱硫难度按 以下顺序依次 递增：噻吩苯并噻吩二苯并噻吩（ et 2001） 。 近 年来 加氢脱硫（ 技术取得了很大的发展，一方面改良了催化剂（酸性催化、金属硫化物协同或碳化钼催化），另一方面无催化剂加氢脱硫工艺（ 的 研制开发 ，中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 文献综述 2 使得 过去 无法 处理的硫化物 ， 如： 4,64,6，现在也能够 比较顺利地脱除（ et 2003）。 加氢脱硫是相对成熟和完善并 在生产中 得到 广泛 应用的脱硫技术，但 在 进行深度脱硫时， 存在一定的局限性，如 加氢反应条件 要求 更苛刻，温度 要求 更高， 需要 压力更 高 ， 操作费用增高， 导致 油品生产 成本 上涨 。 此外 ， 加氢 脱硫 反应产生的 副产物 体，会造成 环境造成 二次污染，需进行再处理。 物脱硫技术 20 世纪 30 年代，人们 试图采用 微生物 脱除石油 中的硫 化物 ， 但 由于 当时微生物脱硫机理 和技术 的匮乏 ， 生物脱硫 研究 进展缓慢 。 20 世纪 50 年代 生物脱硫 （ 技术发展进入 了 第一次高潮 。 20 世纪 70 年代， 生物脱硫（ 技术的研究进入第二次高潮 ，研究者开展了生物脱硫代谢机理的研究 。 20 世纪 80 年代，专一性脱硫菌种的发现将 生物脱硫（ 技术的研究推向第三次高潮 。 基因工程 应用于生物脱硫（ 究，使得 利用重组技术克隆高效、专一 性的 脱硫 微生物 及 通过有效的分离技术纯化高活性脱硫酶 得以实现。 20 世纪 90 年代初，遗传学家 在 分离、克隆 和表达 脱硫基因 的基础上 ，通过对脱硫微生物 质粒接合和转化 ，获得 突变 菌 株， 经 培养生产出工业 化应用的 生物催化剂， 使 术 研究取得 突破性进展。 20 世纪 90 年代，美国能源生物系统公司（ 用 株进行 研究 （ et 1996）， 开发出 结合 达到深度脱硫 效果的 脱硫 工艺，已 通过 中试 ，进行 了 技术 体系标准 和 商业化 评估 工作，并 于 2005 年与 油公司联合 ， 在 阿拉斯加州建成了 5000 b/d 的柴油生物脱 硫生产示范装置。 石油生物脱硫是提高石油产品附加值的新技术，具有重大的产业化前景 。 微生物脱硫就是利用微生物专一性脱除石油产品中含硫化合物的硫，最近十年生物催化脱硫（ 究取得了很大进展。微生物脱硫可以在满足脱硫要求的同时，不降低柴油的热值和汽油的辛烷值，显示了良好的工业化前景。生物脱硫法具有反应条件温和、设备简单、催化效率高和高度的作用专一性等优点，可以达到深度脱硫的目的，是石油产品生产高新技术的代表。相对于催化加氢脱硫这一高温高压过程而言，生物脱硫的设备投资费减少 30，运行费降低 10 15，而 且很少有废液排放，符合环保要求。 20世纪 90年代以来，国际上对微生物脱有机硫的研究十分活跃，许多公司和政府组织等已投身于生物脱硫这个浪潮中。 其中规模较大的有 本石油能源中心、 国天然气技术研究所、美国 国 外，加拿大、韩国、德国、意大利、西班牙、中国等国家的研究机构也在致力于这方面的研究。 由于菌种及相关工艺的专利保护，各国研究机构最初都致力于分离得到有自主知识产权的合适菌种。继 目 前为止，已经有几十株具有特异性脱硫途径的细菌报道，其中多数为红球菌属。 近年来的研究重点主要在于利用基因工程技术改进脱硫微生物和脱硫工艺的开发，包括脱硫微生物的生产、固定化 和 脱硫动力学研究等。 一性脱硫菌 1990 年， 以 唯一硫源分离得到了一株专一性的脱硫微生物 国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 文献综述 3 够在温和的条件下通过菌体内的多种酶连续地催化氧化 应 ，使其中的硫以亚硫酸盐的形式脱除，而其余的结构以 222形式保留在油相中。脱硫微生物 专一性脱硫微生物的菌种分离是微生物脱硫的基础（ et 2000）。在微生物脱硫研究中，常把二苯并噻吩（ 为杂环有机硫化物的模型化合物（ et 2001） 并利用其进行菌种分离 。继 后，已经有几十株具有专一性脱硫途径的菌株（ et 1998）被分离， 其中包括 细菌类 （ 多数是革兰氏阳性菌 ）和 真菌类 。其中诺卡氏菌属的红球菌数目最多，如 et 1995）、 et 1992）、 et 1996）、 et 2002）等。与红球菌亲缘关系较近的部分菌株有 et 1998） et 1998）、 et 1998）；与红球菌亲缘关系较远的菌株有et 1996）、 et 2002）等。能专一性脱硫的革兰氏阴性菌有 1993）等。国内近年来也分离到一些脱硫微生物，如中国科学院过程工程研究所分离的 本实 验室分离的。这类菌多属于室温菌，适宜温度在 30 。近年来人们认识到嗜热菌将给工业应用带来方便。由于温度升高，酶促反应的速度也相应地得到提高，杂菌污染的可能性降低，而且生物催化剂的稳定性也相应提高。目前报道的专一性脱硫嗜热菌，在 50 以上仍具有脱硫活性，有 2001）、 2001）、 et 2001）和 2003）。 生物脱硫的 径 早在上个世纪 50 年代， 布了第一份石油微生物脱硫的专利（ et 2001）。 1968年， 以将 化成为几种不同的水溶性产物，发现了 (图 1具有这一途径的微生物除 1977）、 et 1978）和 et 1976）等。 径是以 的碳代谢为目的活动，通过这一途径，硫并没有真正从杂环化合物中脱除，只是因为产物具有水溶性，从而可以使硫化物离开油相而进入水相。虽可以有效脱硫，但使杂环分子本身被破坏，石油的燃烧值降低，未得到广泛应用。 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 文献综述 4 图 1硫代谢的 径 （ 1968） 1968) 一性脱硫途径 究所最早报道微生物可从 脱去硫而不改变烃的结构这一现象。他们分离的假单胞菌 在以苯甲酸酯为唯一碳源的高浓度的 生长，可专一性地切断 ，没有 翠卿等， 2000）。 1990）分离得到能选择性脱除 硫的菌株 提出生物降解 专一性脱硫途径，又称为 4S途径（图 1 O O O O O i b e n z o t h i o p h e n e c i s - - 1 , 2 - d i h y d r o x y d i b e n z o t h i o p h e n ec i s - 4 - 2 - ( 3 - h y d r o x y ) t h i o n a p h t h e ny l 2 - o x o - 3 - b u t e n o i c a c i h y d r o x y - 2 - f o r m y l b e n z o t h i o p h e n et r a n s - 4 - 2 - ( 3 - h y d r o x y ) t h i o n a p h t h e n y l 2 - o x o - 3 - b u t e n o i c a c i 士学位论文 第一章 文献综述 5 图 1生物脱硫的 四硫途径 （ 1990） 4S 1990） （ 1994）人发现，在 硫过程中需要辅酶因子 参与。人们认识到生物脱硫是一个复杂的生物反应过程，反应过程不仅涉及到多个酶反应，而且