HCV及HIV实验室诊断

HCV及HIV实验室诊断 2009年6月,HCV、HIV的比较,1992-1995年全国病毒性肝炎血清流行病学调查表明我国抗-HCV的阳性率3.2% (我省为1.6) ，全国可能约3000万人感染。迄今没有再进行全国范围的HCV血清学调查。75%-80%HCV感染者无明显临床症状，临床确诊主要依靠实验室检测结果。,HCV实验室检测方法筛查试验抗-HCV筛查方法： 酶联免疫吸附法（ELISA)，RT化学发光免疫法（CIA)确证试验重组免疫印迹法（RIBA) RNA检测,HIVHCV诊断试验筛查试验EIA，RT，PAEIA，RT化学发光化学发光确证试验WB，LIARIBA，RNA（抗原）替代策略S/CO6以上S/CO3.8以上治疗相关检测CD4，RNARNA，亚型,HIV诊断治疗筛查-复检-确证CD4200监测：RNA HCV筛查-？-？RNA阳性亚型监测：RNA,90年代后期，美国CDC开始针对来自不同人群(包括高危人群、低危人群)的样本设计研究，评估筛查实验S/CO比值的作用。结果表明，用美国FDA批准的两家ELISA试剂(Abbott公司、Ortho公司)进行筛查试验，当S/CO3.8时，高度预示HCV抗体真阳性状态。 2000年10月，美国乔治华盛顿大学医学中心的Dr.Dufour等开始了对HCV抗体筛查弱阳性结果的常规确认实验（那时还很少实验室做确认实验，医院实验室更少）。结果显示对抗体弱阳性样本（S/CO3.8 65例，RIBA阳性64例（占98.5%） S/CO比值3.8的样本做RIBA补充实验。这样实验室即节约了大量资金，又使抗体检验结果更加可靠。）,美国CDC报告的HCV-EIA初筛试验与RIBA确证试验的符合率人群感染率 总样本量S/COEIA+（%）RIBA（%） -+/-+2% 24012total68926.97.365.91-3.8231（33.5）78.816.94.33.8458（66.5）0.72.496.99.5% 2936total3519.77.383.01-3.8 45（12.8）64.433.32.23.8306（87.2）1.63.49524.9% 498total1241.6494.41-3.8 3（2.4）66.733.303.8121（97.6）03.396.7,以下结果报告HCV阳性，需进一步进行临床咨询和评价EIA+/RIBA+/RNA+EIA+/RIBA+/RNA-EIA+RIBA-/RNA+HCV阴性，不考虑感染，不需要临床评价（除外窗口期）EIA-EIA+/RIBA-EIA+/RNA-/ RIBA-HCV不确定EIA+/RIBA+-抗体假阳性、窗口期或慢性HCV感染者，上述情况下RNA检测均+，因此，不确定者：检测RNA或1个月后再检测抗体,初筛确证报告 结果解释 EIA-不做HCV抗体阴性 未感染EIA+不做HCV抗体阳性 可能有5%以下的假阳性（s/co3.8）EIA+RIBA+HCV抗体阳性 现在或过去感染EIA+RIBA-HCV抗体阴性 未感染EIA+RIBA+/-HCV抗体不确定 RNA检测或1月后抗体检测EIA+RNA+抗体/RNA阳性 活动性感染EIA+RNA-/RIBA+抗体阳性/RNA阴性 现在或过去感染EIA+RNA-/RIBA-抗体阴性/RNA阴性 未感染EIA+RNA-/RIBA+/-抗体不确定/RNA阴性 可能是假阳性,美国献血人群HCV检测,抗体检测,取消献血资格，进行补充实验,核酸检测,采用“回顾”方法,根据不同情况作出判断,+,-,+,-,guidance for industry use of nucleic acid tests on pooled and individual samples from donors of whole blood and blood components (including source plasma and source leukocytes) to adequately and appropriately reduce the risk of transmission of HIV-1 and HCV.2004,美国CDC HCV检测策略及流程 EIA + -（报告阴性） S/CO，3.8报告阳性1-3.8作RIBA或RNA或所有阳性作RIBA 或RNA RIBA - +报告阳性+ -+/- RIBA：可用筛查的样本 报告 报告报告RNA：必须采集符合RNA检测样本 阳性 阴性不确定,英国 HCV检测策略及流程 EIA-1 + -（报告阴性） EIA-2或RIBA +/+/+或+/+/-或+/- 报告阳性 RNA -重新采样，用第三种抗体检测+考虑感染,抗-HCV检测,报告阳性，认为HCV感染,报告阴性，认为无HCV感染,+,-,我国丙型肝炎防治指南,两种ELISA试剂检测,两种均为阴性，认为无HCV感染,有一种试剂检测阳性，取消献血资格,我国献血者HCV 筛查,国产HCV抗体检测试剂质量方面，从卫生部临床检验中心开展的HCV抗体检验室间质量评价中可见，对强阳性或弱阳性样本检测，国产试剂(主要厂家)的S/CO值高于进口试剂，但是无论对阳性及阴性样本检测，国产试剂(主要厂家)的CV值要大大低于进口试剂，国产试剂的特异性也差于进口试剂，造成临床上出现更多的假阳性。,筛查实验的灰区设定方面，目前丙肝抗体酶免检测试剂皆没有灰区的设定，S/CO比值较低(但应大于1)的结果也报告阳性，造成许多假阳性。 临检中心对国内几家血液中心送来的HCV抗体筛查(两家国产试剂结果不一致)阳性的3000份样本检验，得到确认HCV抗体阳性的仅25份。参考文献：1、邢文革，郑怀竞.全国医院、血站病毒性肝炎标志物检验的流行病学调查.中华肝脏病杂志，1998;6(1):47.2、邢文革等，国产丙型肝炎病毒抗体酶免检测试剂盒的质量评价. 中华肝脏病杂志，2001;9(5):314.3、邢文革，郑怀竞，血站丙肝病毒抗体酶免检测试剂盒的使用调查.中国输血杂志,2002;15(1):60.,HCV实验室检测面临的挑战缺乏实验室检测技术指导性文件规范化检测有待加强质量控制急需强化试剂质量有待提高应对措施 编制“规范”，组织培训，试剂考评,制定我国HCV检测策略可参考的依据美国CDC推荐的丙型肝炎病毒实验室检验新导则：以S/CO=3.8为临界值国家检定所评价结果：进口EIA试剂可用S/CO3.8作为临界值判断结果（国产试剂需再评价）国家艾滋病参比实验室评价结果：进口EIA试剂与RIBA确证试剂符合率为95%（样本来源于既往献血为主的地区）（国产EIA试剂尚未评价）,NARL组织的HCV-EIA与HCV-RIBA检测符合率比较s/co值EIA+RIBA- +/- +13.8 210 14 73.81000 5 95合计1213 36102S/CO=3.8时，进口EIA与RIBA确证的符合率为95.0%S/CO1- 3.8时，进口EIA与RIBA确证的符合率为33.3%,中国CDC HCV感染摸底调查检测策略及流程（讨论稿） EIA-1 +（双孔复检） -（报告阴性） EIA-2 + S/CO（=3.8） -或+（s/co3.8）报告阳性 RIBA + - +/- 报告阳性 报告阴性 RNA+ - 报告阳性 报告阴性,Wang Y, et al. J Med Viral, 1993,40:254-260庄辉，等. 中华流行病学杂志, 2001,22:99-101,HCV genotype distribution in the HIV/HCV co-infected patients,HIV/HCV共感染美国HIV感染者共感染HCV的比例平均为33%，根据感染途径不同有所区别，IDU人群60-90%，MSM人群10%以下（最近有所增加）。另一报告：HCV感染者中HIV感染率10%，HIV感染者中，约25%HCV阳性。,HCV 感染（%）HIV感染（%）IDU6031MSM不清47异性恋2010输血（1992以前）7-202职业暴露11不祥109 （Irena Maier,George y.Wu.World JGastroenterology2002;8(4)577-579）,HIV/HCV共感染状况估计（Irena Maier,George y.Wu.World JGastroenterology2002;8(4)577-579）统计HCVHIV美国感染人数4百万1百万全球感染人数6千至一亿八千万四千五百万初发传播血液性治愈可以（40%）不可每天复制1012-13 109-10变异率10-3-10-4 10-3-10-4,我国HIV感染者中，HCV感染调查四川IDU-HIV(+)：91.2% （11/12），张永刚等HIV感染者合并感染HCV和HBV情况调查，中国性病艾滋病防治 1997，3，1浙江IDU-HIV(+)：94%（47/50）, 浙江吸毒者HIV/HBV/HCV重叠感染研究，浙大第一附院云南IDU-HIV(+)：97.5%（155/159）；李大勤等 中华流行病学杂1994,2 99.3%（137/138）；Zhang cuiyu et al. JAIDS 2002,29中部地区既往献血HIV(+)人群：82%（73/89），阴宁等河南省既往经献血HIV(+)人群：86.3%（259/300）,刘震等，中华肝脏病杂志，2005，146，464-465MSM/PMTCT/STD?我国HCV感染者中，HIV感染调查中部地区既往献血人群：8.95%(34/380)，2006,HCV co-infection prevalence in HIV positive population,By Wantai and Dia sorin HCV EIA-3 kits，259 of the 300 patients are HCV Ab positive，41 negative， HCV Ab positive rate is 86.3%. 2.67% (8/300) are HBsAg positive，and HIV/HCV/HBV co-infection rate is 1.33%。,HIV对HCV的影响 许多研究证明，HIV感染可以对HCV感染的各个阶段产生影响，例如出现更高的HCV载量（机制不清），更多的终末期肝脏疾病，HCV临床进展更快，对抗病毒治疗的影响抗HIV药物会使肝脏酶增加，HCV载量增加，尤其是CD4细胞数低的病人。也有研究认为HIV感染会使肝硬化增加，加速疾病进程，总之，对共感染的病人，HAART治疗时应特别注意肝脏疾病，线粒体毒性，过敏反应的发生。,发展为肝硬化的平均时间感染后10年发生肝硬化的比例HCV+23.2年2.6%HCV+/HIV+6.9年14.9%P0.0010.01 （David L. Thomas. Adv Stud Med. 2005;5(4c):s352-355）HCV对HIV的影响不清楚,HIV/HCV共感染对诊断的影响国家艾滋病参比室研究结果： HIV对HCV的影响抗体检测无明显变化核酸检测：HIV感染者中HCV抗体的假阴性率为19.5%（8/41）（刘震等，人类免疫缺陷病毒/丙型肝炎病毒共感染对实验室诊断影响的研究，中华检验医学杂志，2006，287，691-694）HCV对HIV的影响：未观察到,HIV感染者中HCV的检测策略：1、由于HIV/HCV共感染率很高，美国卫生部建议所有HIV感染者检测HCV。2、由于HIV感染者中，HCV抗体的假阴性率较高，美国卫生部推荐在可疑HCV抗体阴性患者中检测HCV RNA。（HCSP, Hepatitis C Support Project）,集合RT-PCR检测技术在窗口期检测中的应用,长期感染者的传播效率？,窗口期/早期感染者的传播效率？,BED,集合PCR,窗口期,MSM VCTIDU EIA- EIA+集合PCRWB+ MSM 22例 ,VCT1例，IDU4例,集合PCR技术在发现窗口期感染者中的应用,丙型肝炎病毒抗体检测,原理：本品系用纯化基因工程丙型肝炎病毒（HCV）抗原和人工合成肽抗原相配比包被的微孔板和酶标记特异性抗人IgG，配以缓冲液和其它试剂组成。应用间接法原理（ELISA）检测人血清或血浆中的HCV抗体。,丙肝抗体操作步骤,以丽株试剂为例1. 加样：将预包被板条固定于板架上。每次试验设阴性对照2孔、阳性对照2孔，分别加入阴、阳性对照100ul；设空白对照1孔，只加样品稀释液100 ul。其余孔加入100 ul样品稀释液，再加入10ul待测样品。2. 温育：振荡混匀，置37温育30分钟。3. 洗涤：弃去孔内液体，将稀释后的洗液注满各孔，静置3060秒，弃去孔内洗液，扣干。重复洗6次。4. 加酶：空白对照孔不加酶，其余孔加入酶标记物100ul。5. 温育：置37温育20分钟。6. 洗涤：弃去孔内酶标记物，重复洗6次（同操作步骤3）。,7. 显色：每孔加入底物缓冲液50ul（1滴），再加入底物液50ul（1滴），振荡混匀，置37温育10分钟。8. 终止：每孔加入终止液50ul（1滴），轻拍混匀。在单波长450nm或双波长450nm/630nm下，用空白孔校零，再读取各孔OD值。结果判读1. 要求： 阳性对照OD值应 0.50 阴性对照OD值应 0.12（空白校零后）2. 临界值（C.O.）计算： 临界值（C.O.）= 0.12 + 阴性对照平均OD值 备注：阴性对照平均OD值小于0.05按0.05计算，大于0.05按实际值计算。3. 结果判定：样品OD值 临界值（C.O.）为HCV抗体阳性样品OD值 临界值（C.O.）为HCV抗体阴性,注意事项,1. 从冷藏环境中取出的试剂盒应平衡至室温后方可使用。2. 未使用的预包被板条应置于封口袋，28保存。3. 若20倍浓缩洗液出现结晶，请放置37至溶解。4. 滴加试剂时，应先摇匀，并弃去12滴后，垂直滴加。5. 洗涤时各孔均需加满洗液，防止孔口有游离酶不能洗净。6. 结果判读请在15分钟内完成。7. 不同批号的试剂组份不可混用。,HIV抗体的检测,策略检测HIV抗体是常规使用的HIV病原学诊断方法。为了使检测结果达到尽可能高的准确性， HIV检测使用特殊的策略.即：高敏感的方法进行初筛，初筛阳性的标本再用特异性强的方法进行确认，也称“金标准”方法。,诊断的金标准：HIV特异性抗体检测EIA（高敏感性）+WB（高特异性）诊断的准准确率大于99%，假阳性率约为0.0006%，造成错误诊断的机会几乎是0。同时，为了减少检测的错误和误差，还要采取严格的质量保证、质量控制评价措施,ELISA方法原理,第三代（双抗原夹心法） 该方法的原理是将HIV抗原包被在96孔板底部，加入待检血清与之反应，洗涤后加酶标记抗人IgG。洗出多余的酶后，再加底物显色。若血清中含有HIV抗体，被固定住的酶使底物反应颜色变深，经测定得到很高的光密度值，为阳性反应；反之为阴性。 该方法通常是被用作HIV抗体检测的初筛试验，测定阳性结果需做重复试验，重复阳性结果仍需经确证实验证实才能肯定。,操作步骤,1. 加样：将预包被板条固定于板架上。每次试验设阴性对照2孔、阳性对照2孔，分别加入阴、阳性对照50ul；设空白对照1孔，不加样品。其余孔加入待测样品50ul。2. 温育：置37温育30分钟。3. 洗涤：弃去孔内液体，将稀释后的洗液注满各孔，静置3060秒，弃去孔内洗液，扣干。重复洗6次。4. 加酶：空白对照孔不加酶，其余孔加入酶标记物50ul。5. 温育：置37温育30分钟。6. 洗涤：弃去孔内酶标记物，重复洗6次（同操作步骤3）。,7. 显色：每孔加入底物缓冲液50ul，再加入底物液50ul，振荡