合肥工业大学---生化综合实验报告

生物化学综合实验生物化学综合实验 黄豆芽总 DNA 的提取及亲缘关系的研究 姓名 逯玉东 学号 班级 生物学院食品 10 2 班 实验时间 2012 7 2 2012 7 3 实验目的 实验目的 1 学会和掌握核酸制备的一些基本操作和方法 并通过分光光度 法和电泳等实验技术研究核酸的性质 2 学习用紫外分光光度计和水平琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 的纯 度 浓度的原理与方法 3 掌握利用限制性内切酶酶切 DNA 的原理和方法 培养学生利用 限制性内切酶位点图谱进行实验设计的能力 4 学会通过琼脂糖凝胶电泳法分析不同材料之间 DNA 的亲缘关系 关键词 关键词 核酸制备 CTAB 法 限制性内切酶 分光光度法 电泳 Abstract 1 The extraction of plant DNA 2 Determination of plant DNA purity and concentration 3 Plant DNA restriction endonuclease enzymatic 4 DNA agarose gel electrophoresis to separate DNA fragments 5 Studies on the relationships of plant DNA Key words Nucleic acid preparation CTAB Restriction endonuclease Spectrophotometry Electrophoesis 一 一 黄豆芽黄豆芽 DNADNA 的提取的提取 1 材料 正在生长的黄豆芽 2 主要仪器和用具 高速冷冻离心机 16 000 r min 恒温水溶 紫外可见光分光光 度计 电泳仪及微型电泳槽 电冰箱 凝胶成像系统或手提式紫 外检测仪 微波炉 电子天平 纯水系统 1 5 mL 离心管及离 心架 微量移液管 10 uL 200uL 1 000uL 各 1 支及各量程吸头 常用玻璃仪器及滴管等 一次性塑料手套 3 试剂 1 0 1 mol LTris HCl pH8 0 缓冲液 0 607gTris 碱溶于 40ml 灭 菌双蒸水 用浓盐酸 2 1ml 调节至 PH 至 8 0 定容至 50ml 高 压灭菌 2 CTAB 提取缓冲液 100 mM Tris HCl pH8 0 0 607gTris 碱溶 于 40ml 灭菌双蒸水 用浓盐酸 2 1ml 调节至 PH 至 8 0 定容至 50ml 高压灭菌 20 mmol L EDTA 0 3722gEDTA 溶于 40ml 灭菌双 蒸水 用 NaOH 调节至 PH 至 8 0 定容至 50ml 高压灭菌 1 4 M L NaCl 称取 4 095gNacl 于烧杯中 加 10ml 水溶解 再定容至 50ml 2 CTAB 使用前加入 0 2 2 体积的 巯基乙醇 2gCTAB 8 18gNaCl 0 74gEDTA 加入 10ml1mol L 的 Tris Hcl PH 8 0 2ml 巯基乙醇 加水定容到 100ml 3 Tris HCl 溶液饱和酚 氯仿 异戊醇 25 24 1 V V V 4 RNA 酶 A DNase free RNase A 5 70 乙醇 6 预冷无水乙醇 7 pH8 0 TE 缓冲液或 ddH2O 10 mmol L Tris HCl 0 607gTris 碱溶于 400ml 灭菌双蒸水 用浓盐酸 21ml 调节至 PH 至 8 0 定 容至 500ml 高压灭菌 1 mmol L EDTA PH8 0 0 1816gEDTA 溶于 400ml 灭菌双蒸水 用 NaOH 调节至 PH 至 8 0 定容至 500ml 高压 灭菌 8 琼脂糖 9 5X TBE 缓冲液 称取 54 0gTris 27 5g 硼酸 加入 20ml 500mmol l 的 EDTA 先加 800ml 重蒸水 加热溶解后 再加重蒸水 定容至 1000ml 10 6X 上样缓冲液 在 50ml 水中溶解 0 25g 溴酚蓝 加甘油 30ml 加水定容至 100ml 11 1 溴化乙锭 EB 染色液 将 100mg 溴乙锭溶于蒸馏水或 者电极缓冲液 100ml 棕色瓶内封好 避光保存 4 实验步骤 1 准备干净研钵 中 小号 研杵 药匙 无水乙醇 异丙 醇 预先放进冰箱预冷 以减少液氮用量 2 取用黄豆芽两片子叶之间生长旺盛的芽尖 先后用自来水 蒸馏水冲洗 用滤纸吸干水分 放进冰箱 4 摄氏度保存备用 3 称取 0 1 0 5g 芽尖 在液氮中研磨 目的是破碎植物细胞 释放其中内含物 低温可抑制核酸酶的活性 待液氮蒸发完后 迅 速转入装有 700 uL 预热过的 60 65 摄氏度 的 CTBA 提取液的 1 5mL 离心管中 轻轻混匀 4 60 65 摄氏度水浴 30 60min 每 10min 轻轻摇动混匀 5 加等体积的氯仿 异戊醇 24 1 V V 温和摇动 使成 乳状液 6 室温下 温度不低于 15 摄氏度 8000 min 离心 15min 取上清液 根据需要 上清液可用氯仿 异戊醇反复抽提多 次 7 用大孔吸头小心抽提上清液逐滴加入预冷的 2 3 体积的无 水乙醇 或等体积的异丙醇 20 摄氏度条件下放置 30min 以上 5 000 r min 低速离心 10 min 4 摄氏度 收集沉淀 如果不见沉淀 将溶液放入 20 摄氏度 30min 至过夜 再离心 或用更高速度 10 000 12 000 r min 离心 10min 4 摄氏度 收集沉淀 9 将收集到的沉淀移入另一新离心管中 加入 1 2mL 70 乙醇冲洗液 轻摇几分钟 4 摄氏度下 10 000r min 离心 5min 收集 沉淀 重复 1 2 次 10 打打开管盖 放洁净场所晾干 5 注意事项 1 使用的研钵最好预先冷处理 勿使研钵的植物样品融化 2 抽提过程温度不宜低于 15 摄氏度 以免 CTAB 沉淀而损失 DNA 3 用氯仿 异戊醇抽提时 摇晃一定要轻 否则容易使 DNA 断裂 使用的吸头最好要口径大的或剪掉吸头尖 此外 应避免重复冻融 步骤 4 提取的 DNA 不宜过分干燥 当乳白色的 DNA 沉淀变成透明胶 状即可 二 二 植物植物 DNA 纯度 浓度的测定纯度 浓度的测定 1 材料 提取的 DNA 溶液 2 主要仪器及用具 紫外分光光度计 微波炉或电炉 稳压电泳仪及水平式电泳槽 凝胶成像系统或手提式紫外检测仪 电冰箱 电子天平 微量 移液器 10uL 200uL 1 000uL 各 1 支吸头 三角瓶 离心管 常用玻璃仪器及滴管等 石蜡膜 一次性塑料手套 3 实验步骤 一 紫外分光光度计测定 DNA 纯度和浓度 1 预热紫外分光光度计 10 20min 2 取 1 支石英比色杯 装入 TE 溶液 作为空白 用于校正分光 光度计 DNA 纯度及浓度测定 3 取 5uL DNA 待测样品加入另 1 支比色皿中 加 TE 溶液定容至 3mL 用无菌石蜡膜堵住杯口 倒转混匀 4 将 2 只比色杯置分光光度计中 先调入射波长 然后分别用空 白溶液调整零点 T 为 100 OD 为 0 测定 260nm 280nm 230nm 待测样品液的 OD 值 4 结果与分析 计算浓度 对于双链 DNA 来说 OD260 1 0 时 其浓度为 50ug mL 故 DNA 样品浓度 ug uL OD260 x N 样品稀释倍数 x 50 1 000 测定纯度 据经验值其 OD260 OD280 1 8 2 0 OD260 OD280 2 0 以 判断 DNA 纯度 OD260 OD280 2 0 表明有 RNA 污染 OD260 OD280 1 8 时 表明由蛋白质或酚污染 OD260 OD230 2 0 时表明溶液中有残存的盐和小分子杂质 在电泳过程中可随时用手提式紫外检测仪直接观察 DNA 的电泳 情况 电泳时间视实验的具体要求而定 待 DNA 各条区带分开后 停止电泳 一般需 2h 取电泳凝胶直接拍照或绘图 DNA 样品浓度估测 比较被测 DNA 样品条带与标准 DNA 样品条 带的荧光强度 DNA 量相同时所产生荧光强度相同 5 注意事项 1 设计标准 DNA 含量梯度时要合理 便于肉眼分辨 2 琼脂糖电泳注意事项 参见用 DNA 琼脂糖凝胶电泳分离 DNA 片段 三 三 DNA 的限制性内切酶酶解的限制性内切酶酶解 1 主要仪器 微量移液器 离心机 水浴锅 2 试剂 1 限制性内切酶 EcoR I HindIII 2 限制酶缓冲液 1 x M 0 1mol LTris Hcl pH7 5 3 实验步骤 按限制性内切酶试剂盒用量说明 加入 DNA 酶等试剂 充分混匀 并在 37 消化 3 6 小时 加入上样缓冲液 用 1 琼脂糖凝胶电泳 检测酶切结果 以未酶切 DNA 作为参照 进行多个酶切反应 仅 DNA 样品不同 建议配制反 应混合液后分装 4 结果与分析 将得到的 DNA 片段进行电泳 5 注意事项 内切酶不应混有其它杂蛋白特别是其它内切酶或外切酶的 污染 注意内切酶的识别位点及形成的粘性末端 内切酶体积不能超过反应体系 10 因内切酶中含 50 甘油 体系中甘油超过 5 会抑制内切酶活力 内切酶操作应在低温下进行 冰上 使用时防止操作中 对内切酶的污染 四 四 DNA 琼脂糖凝胶电泳分离琼脂糖凝胶电泳分离 DNA 片段片段 1 实验材料 植物基因组 DNA 分子 2 主要仪器及用具 1 Eppendorf 离心管 1 5ml 预先高温高压灭毒 3 个 及其离 心管架 2 电泳槽 1 个 电泳仪 1 个 凝胶塑料托盘 1 个 样品 槽模板 1 个 3 一次性塑料手套 64 只 4 微量注射器 2 L 3 15 L 或 20 L 1 5 锥形瓶 100ml 1 烘干 6 胶头滴管 3 7 小烧杯 50 100 250ml 8 洗瓶 2 个 分别盛重蒸水和蒸馏水 9 大烧杯 1 个 10 量筒 50ml 1 11 紫外反射投射仪 3 试剂 1 电泳缓冲液 5 TBE pH8 0 使用前用蒸馏水稀释 10 倍 浓度为 0 5 TBE 配制 称取 54 0gTris 27 5g 硼酸 加入 20ml 500mmol l 的 EDTA 先加 800ml 重蒸水 加热溶解后 再加重蒸水定容 至 1000ml 2 1mg ml 溴化乙锭溶液 EB 配制 带手套谨慎称取 1mg 溴化乙锭 溶于 1ml 重蒸水中 置 4 冰箱备用 EB 是 DNA 的诱变剂 亦是强致癌屋 操作时 应小心 3 琼脂糖 视实验要求制不同浓度的胶 用 0 5 TBE 作溶剂配 制 4 酶终止反应液 10 0 1mol L EDTA 20 Ficoll 0 25 溴酚 蓝 5 溴酚蓝指示剂溶液 4 实验步骤 一 1 0 琼脂糖凝胶板的制备 1 用配套挡板将凝胶塑料托盘短边缺口封住 置水平玻板或水 平工作台面上 将样品槽模板 梳子 插进托盘长边上的凹槽内 距一端约 1 5cm 梳齿底边与托盘表面保持 0 5 1mm 的间隙 安置好后保持静置状态 2 称取 0 3 克琼脂糖置于小锥形瓶中 加入 30mlTBE 稀释缓冲 液 在电炉上 或微波炉中 加热融化 轻轻摇匀 避免产生泡 沫 3 待琼脂糖冷却至放在手背不觉太烫手 约 60 后 滴一滴 EB 然后将琼脂糖溶液在靠近挡板一侧连续地倒入托盘内 注意 中间不要间断 使凝胶缓慢而连续地展开直至在托盘表面形成 一层约 3mm 厚均匀胶层 7 1 9 0cm 胶内不要存有气泡 室温 下静置约 20 分钟 4 待凝固完全后 用小滴管在梳齿附近加入少量 TBE 稀释液润 湿凝胶 双手均匀用力轻轻拔出样品槽模板 注意勿使样品槽破 裂 则在胶板上形成相互隔开的样品槽 5 取下封边的挡板 将凝胶连同托盘放入电泳槽平台上 倒入 大量 TBE 稀释缓冲液直至浸没过凝胶面 2 3mm 要防止样品槽 内窝存气泡 可以用微量注射器挑除 二 加样 用微量注射器或移液枪将经酶切的样品液和未经酶切的样品 要加 2 L 的酶反应终止液 分别加入到胶板的不同加样槽内 每 个槽 5 2 2 5mm 容积约为 25 L 因此加样量不要超过 20 L 避免因样品过多而溢出 污染邻近样品 加样时 注射器针头穿过 缓冲液小心靠近加样槽底部 但不要损坏凝胶槽 然后缓慢地将样 品推进槽内 让其集中沉于槽底部 加完一个样品后的微量注射器 应反复洗净后才能用以加下一个样品 三 电泳 加样完毕 将靠近样品槽一端连接负极 另一端连接正极 千 万不要搞错 接通电源 开始电泳 在样品进胶前可用略高电压 防止样品扩散 样品进胶后 应控制电压降不高于 80V 当染料带 移动到距离凝胶前沿约 1cm 时 停止电泳 四 观察 小心地取出凝胶置托盘上 将胶板推至预先浸湿并铺在紫外灯 观察台上的玻璃纸内 在波长 245nm 紫外灯下进行观察 DNA 存 在的位置呈现橘红色荧光 5 结果与分析 根据图谱分析不同材料的亲缘关系 6 注意事项 1 要根据被分离的 样品的大小范围选择不同浓度的琼脂糖凝 胶 2 溴乙锭 EB 是诱变剂 配制和使用时应带乳胶手套 并且不 要将该溶液洒在桌面或地面上 凡是沾污过 EB 的器皿或物品 必须 经过专门处理后 才能进行清洗或弃去 3 加样量的多少取决于加样槽最大容积 可以采用大小不同的样品 槽模板以形成容积不同的加样槽 加入样品的体积应略小于加样槽 容积 为此 对于较稀的样品液应设法调整其浓度或加以浓缩 五 实验数据及处理五 实验数据及处理 在 DNA 纯度与浓度的测定结果 OD230 0 137 OD260 0 180 OD280 0 102 进而可以算出 OD260 OD280 1 765 1 8 OD260 OD230 1 314 2 0 DNA 含 量 ug uL OD260 0 02 稀释倍数 0 180 0 02 100 900 ug uL 0 9ug ml 六 实验总结与分析六 实验总结与分析 1 讨论 讨论 1 制备的 DNA 在具备哪些条件的溶液中比较稳定 制备的 DNA 在 1 含有螯和剂如 EDTA 中较稳定 因为 EDTA 能螯和 Mg2 或 Mn2 离子 抑制脱氧核糖核酸酶 因此在配 制提取缓冲液和 TE 缓冲液的时候加入了 EDTA 的钠盐以维持 DNA 的 稳定 2 在 pH5 9 之间较稳定 否则过酸过碱会破坏 DNA 的 结构 所以无论是提取缓冲液还是 TE 溶液 都最终调 PH 至 PH 约 等于 8 3 有一定离子强度 强度越高 DNA 越稳定 的溶液中 较稳定 TE 满足以上要求 但如需对所得 DNA 进行酶切 EDTA 浓 度不可过高 一般用 0 1 TE 或 0 2 TE 在实验时我们用的是稀释十 倍的 TE 溶液来增强 DNA 结构的稳定性 2 为了防止 DNA 降解 提取过程中应注意什么 在提取的过程中应注意以下几点 1 整个提取过程应在较低 温度下进行 一般利用液氮或冰浴 这样可防止和抑制内源脱氧核 糖核酸酶对 DNA 的降解 2 当 DNA 处于溶解状态时 要尽量 减弱溶液的涡旋 动作要轻柔 3 在进行 DNA 溶液转移时用大 口 或剪口 吸管 尽量减少对溶液中 DNA 的机械剪切破坏 3 为什么选择波长为 260nm 280nm 230nm 的 OD 值来确定 待测样品纯度 除了 DNA 浓度 分光光度计同时显示几个非常重要的比值表示 样品的纯度 如 A 260 A 280 的比值 用于评估样品的纯度 因为 蛋白的吸收峰是 280 nm 纯净的样品 比值大于 1 8 如果比值低 于 1 8 或者 2 0 表示存在蛋白质或者酚类物质的影响 A 230 表示 样品中存在一些污染物 如碳水化合物 多肽 苯酚等 较纯净的 核酸 A 260 A 230 的比值大于 2 0 4 干扰核酸纯度的物质有哪些 干扰核酸纯度的主要物质有杂蛋白质 多糖 多酚 色素以及极 少量的 RNA 等 5 在整个酶切反应过程中应注意哪些问题 在酶切反应过程中应注意 1 不应混有其它杂蛋白特别是其 它内切酶或外切酶的污染 2 注意内切酶的识别位点及形成的粘 性末端 3 内切酶的用量 根据内切酶单位和 用量而定 通常 1u 指在适当条件下 1 小时内完全酶解 ug 特定 底物 所需要的限制性内切酶量 使用中一般以 ug DNA 对 u 酶短 时间为宜 4 同时内切酶体积不能超过反应体系 因内切酶中 含 甘油 体系中甘油超过 会抑制内切酶活力 5 使用时 防止操作中对内切酶的污染 6 如何选择 和限制性内切酶的用量 我们实验的时候用的是 DNA 提取液 1ul 水 16ul buffer 2ul buffer EcoR1 1ul 但实验的效果不理想 在后来的电泳中 未 能发现被切割的 DNA 短链 所以在第二次切割的时候我们用 DNA 提取液代替了水 酶切效果有一定的改善 2 实验过程出现的问题以及原因和解决方法 实验过程出现的问题以及原因和解决方法 1 在首次提取 DNA 的时候 絮状物或者沉淀提取量特别少 主要原因 第一 可能是取材料是我们取的只有芽尖部位 子叶大部分都 被除去了 所以提取物中所含的蛋白质和杂质本来就少 第二 在用液氮进行研磨的时候 研磨的不够充分 以至于在 用提取液提取 DNA 的时候 无法把原料中的 DNA 充分提取出来 第三 是在离心获得 DNA 的时候用的清液较少 从而直接导致 后面分离的 DNA 的量较少 提取出的 DNA 量少的原因还可能是叶 子量太大 而 CTAB 量少导致得到的液体粘稠无法混匀细胞破裂不完 全 DNA 少 解决方法 保留第一次提取的少量沉淀继续后面的实验 同时 再重新提取一次 在第二次提取 DNA 的时候我们进行了更充分 的研磨 并且将得到的清液全部用于 DNA 的提取 而且适当增 加了 CTAB 的量 最后发现 第一次提取少量的沉淀和后面第二 次重新提取做出来的效果都比较明显 相比较后一组稍微好一 点 说明以上三点都是导致絮状物少的原因 2 在 DNA 纯度与浓度的测定中 OD230 0 137 OD260 0 180 OD280 0 102 进而可以算出 OD260 OD280 1 765 1 8 OD260 OD230 1 314 2 0 原因 是提取的 DNA 不纯 OD260 OD280 的值小于 1 8 表明 DNA 由 蛋白质或酚污染 OD260 OD230 小于远远小于 2 0 表明溶液 里含有较多残留的盐和小分子杂质 如果不进行纯化 将对后 面的实验结果产生严重影响 解决方法 在提取的 DNA 中加入少量的蛋白酶 K 保温 进一 步抽取纯化 然后接着用 70 乙醇洗两次 这样得到的 DNA 将 是比较纯的 3 在最后的电泳中 未得到条带而出现拖尾是因为 DNA 降解了 那些拖尾实际上就是断裂的 DNA 碎片 而未出现条带主要是因 为 DNA 的酶切没有成功 如下图 4 一方面原因纯度差或残留酶切抑制物最为常见 杂蛋白存在 会影响酶切 表现为 A260 A280 低于 1 8 抑制物常见多糖 酚 盐 乙醇等 另一方面可能是因为由于只取得 DNA 的量较 少 再加上实验过程中 DNA 的裂解 到电泳的时候 溶液中已 基本上没有 DNA 了 以至于最后无法得到预期的实验结果 解决方法是重新提取 DNA 尽量增加 DNA 的含量 并且在实验 过程中避免剧烈摇晃 DNA 溶液 减少 DNA 的裂解 另一个重要 的步骤是要对提取的 DNA 进行纯化 降低杂蛋白质 多糖 酚 等对酶切结果的影响 3 3 个人心得个人心得 1 做过这么多的实验 我们应该都清楚实验前的预习非常重要 实验前我们应该认真分析每一个实验步骤 了解每一个用到的 仪器和试剂的作用 一个实验的进度的快慢很大一部分取决于 实验前的准备工作的是否充分 好多人实验前不预习 到开始 做实验时不知道从何下手 不知道试剂和仪器的作用 大大延 迟了实验进程 或者只能看着其他同学的作法 按部就班 做 完整个实验 没有任何收获 2 实验时必须注重每一个实验步骤的操作要求 以及每一种实验 仪器的操作要领 严格按照要求操作 一方面 生化试验室里 面的试剂比较危险 好多含有剧毒 还有对实验仪器的操作比 较高 例如离心机的使用严格要求对角重量相同 离心之前必 须用天平使之达标 否则可能会发生爆炸之类的实验时事故 另一方面 每一个步骤都有可能影响实验的各项数据和最终结 果 决定着实验的成功与否 实验时要时刻观察和记录实验现 象和数据 仔细思考产生各种实验现象的原因 分析其中的原 因 有些同学实验自始至终都不记录现象和数据 也不进行各 项操作 只是看着其他同学做 走马观花看一遍 自认为自己 懂了 会操作了 但实际上一无所知 这样的实验方式是完全 不可取的 失去了掌握实验技巧的机会