“无症状”淋球菌感染的机制探讨

“无症状”淋球菌感染的机制探讨,华中科技大学同济医学院附属协和医院皮肤性病科 陈宏翔,第七届全国皮肤病与性病防治学术研讨会,12/16/2017,留学经历 2010.4-2011.3 日本九州大学医学院皮肤科 导师：古江增隆教授2010年第一届东亚皮肤科学会筹备，古江教授为大会主席,2011.3-2014.3 美国哈佛医学院 麻省总医院皮肤科/皮肤生物学研究中心导师：David E. Fisher教授皮肤科/皮肤生物学研究中心主任、黑素瘤学会主席,2,12/16/2017,3,3,国家自然科学基金面上项目性激素调控Opa-CEACAMs分子通路在女性无症状感染淋病中致病机制研究项目编号：81171626 主持人：涂亚庭 国家自然科学基金面上项目DGI株毒力岛altA与sac-4基因对淋球菌毒力作用的分子机制研究项目编号：30700717 主持人：陈宏翔 国家自然科学基金面上项目mtr系统在淋球菌耐药中作用及其干预研究项目编号：30371293 主持人：涂亚庭教育部博士学科点专项科研基金（新教师基金课题）淋球菌DGI株毒力岛基因的鉴定及外源指导序列干预研究项目编号：20070487140 主持人：陈宏翔华中科技大学同济医学院附属协和医院研究基金淋球菌毒力岛的鉴定及EGS干预研究 主持人：陈宏翔,12/16/2017,4,淋病是我国流行性病中的主要病种,淋球菌的革兰氏染色,淋球菌烛缸培养,淋球菌菌落,12/16/2017,女性无症状感染淋病（asymptomatic gonorrhea，AG）与男性患者产生明显的大量黄白色或黄绿色黏稠脓液症状不同，50%-80%的女性感染后无症状或无明显主观症状，即无症状感染淋病或称无明显症状感染淋病。女性无症状感染淋病易导致多种严重的妇科合并症。无症状女性在感染淋球菌的初期，通常不会积极采取任何有效治疗措施，淋球菌易由下生殖道发展为上行显性感染，导致极为严重的后果，例如，盆腔炎，不孕，输卵管阻塞，异位妊娠，播散性淋病等。衣原体和淋球菌无症状感染者感染HIV的危险性会增加36倍。女性无症状感染淋病极有可能是淋病在人群中蔓延的最大元凶！,5,12/16/2017,6,营养分型、血清学分型营养 /血清学双重分型脉冲场凝胶电泳技术随机扩增多态DNAopa分型NG-MAST分型(Por 和 tbpB),一个新的基因组岛称为GGI(gonococcal genetic island，GGI)，进一步研究发现在57kb大小的GGI毒力岛中18个开放读码框架编码IV型分泌系统（type IV secretion system T4SS)，淋球菌表面抗原变异和其它毒力、耐药信息可能是通过IV型分泌系统以转化的方式来传递给周围受体菌的。,分子分型 毒力岛,12/16/2017,7,第一部分 淋球菌的基因分型、毒力岛分类及与女性无症状感染关系的研究 第二部分 衣原体感染、性激素水平等因素与女性无症状感染关系的研究 第三部分 孕激素体外调节Ngo-PMNs炎症反应的作用机制研究第四部分 孕激素体外调节Ngo-PMNs呼吸爆发、凋亡应答的机制研究第五部分 淋球菌生殖道感染小鼠模型中孕激素对Th17/Treg 细胞的作用第六部分 性激素通过Opa-CEACAMs分子通路对Th2、Th17细胞进行调控。,12/16/2017,8,第一部分 淋球菌的基因分型、毒力岛分类及与女性无症状感染淋病关系的研究,12/16/2017,9,目的 评价Opa分型及NG-MAST对淋球菌分离株进行基因分型的能力及性伴侣分离淋球菌基因型别之间的关系，研究淋球菌不同基因型别的毒力岛类型及其所引起女性无症状感染关系。方法 12对性接触者淋球菌分离株培养鉴定后Opa基因以Hpa II酶切及聚丙烯酰胺凝胶电泳银染显色分析；12株男性标本和81株女性标本PCR扩增por和tbpB后测序用NG-MAST方法从分子水平上进行基因分型，并用ClustalX软件做进化树分析；并对毒力岛分类与女性无症状感染关系进行了研究。,12/16/2017,10,淋球菌株进化树分析,12/16/2017,11,淋球菌株基因以Hpa II酶切后聚丙烯酰胺凝胶电泳银染显色分析,12/16/2017,12,结果 12对性接触患者分离株中，NG-MAST区分出 10 种ST型，而使用Opa分型则呈现 12 种OT型；新发现的ST(217-679)是国内特有的流行株。 武汉地区女性感染的81株野生株中，GGI阳性菌株占了64株（80.43%)；无症状组有GGI阳性株也有GGI阴性株，有症状组也是如此。结论 患者-性伴组除了45/46之外每对菌株的ST型及OT型均相同,表明患者与性伴相互接触传染。Opa-typing及NG-MAST 可区分性关系网中的淋球菌菌株，二种方法分型结果总的趋向一致。Opa分型能力高于NG-MAST，ST型别可进一步的分成opa-types (OT)亚型。GGI毒力岛与女性症状感染之间并无明显的相关性，即女性有脓性分泌物感染并不是感染了强毒力的菌株所致。,12/16/2017,13,第二部分 衣原体感染、性激素水平等因素与女性无症状感染淋病关系的研究,12/16/2017,14,目的 探讨女性淋球菌感染症状与衣原体感染及体内性激素水平等因素之间的关系。方法 选择136例无明显症状女性淋病患者为观察组，45例有症状者为对照组，检测宫颈分泌物衣原体及淋球菌DNA； 放射免疫法测定 E2和 P浓度；用RT-PCR和ELISA的方法在mRNA水平和蛋白水平检测炎症因子TNF-、 IL-1的表达。,12/16/2017,15,7例分泌物标本淋球菌16S rRNA、cppB基因和衣原体omp1基因PCR结果,12/16/2017,16,不同感染组宫颈分泌物 TNF-、 IL-1mRNA的检测A: IL-1和-actin RT-PCR产物电泳结果； B: TNF-和-actin RT-PCR产物电泳结果C: IL-1和-actin条带光密度分析结果； D: TNF-和-actin条带光密度分析结果,12/16/2017,17,12/16/2017,18,结果 淋病的无明显症状感染与衣原体感染无显著相关性，但其炎症因子TNF-、 IL-1减少与血清孕激素水平升高的相关性具有统计学意义。 结论 女性淋病患者体内孕激素水平的增高可能是导致无症状感染的重要原因。,12/16/2017,19,第三部分 孕激素体外调节Ngo-PMNs炎症反应的作用机制研究,12/16/2017,20,目的 选择了有症状组和无症状组的非独特NG-MAST 亚型各3种菌株，进一步研究孕激素在这些淋球菌野生株引起的中性粒细胞炎症反应的调节作用，探讨其作用差异及信号转导的可能机制。方法 分离人外周血中性粒细胞（PMNs），检测PMNs上PR的表达： 在孕激素作用的不同时段检测iNOS, eNOS,TNF-a 和IL-1的mRNA变化，测定iNOS、eNOS、Akt和p-Akt (Ser473)蛋白水平，比较分析其差异。,12/16/2017,21,12/16/2017,22,12/16/2017,23,结果 我们通过RT-PCR和免疫荧光的方法发现人的外周中性粒细胞并不表达经典的PR受体；孕激素能抑制iNOS, TNF-a 和IL-1 的mRNA表达，在有症状组Ngo ST2951、ST735、ST436 和无症状组ST809、ST369、ST2948中并没有显著差别；孕激素显著下调了iNOS蛋白的表达水平，然而eNOS蛋白没有检测到显著的改变；在孕激素处理前后没有能观察到磷酸化的Akt蛋白，总的Akt也没有改变。结论 孕激素的压力导致PMNs中加剧iNOS表达的抑制和PMNs前炎症因子的下调，而这种作用是不依赖于PR介导受体途径和akt信号通路。,12/16/2017,24,第四部分 孕激素体外调节Ngo-PMNs呼吸爆发、凋亡应答的机制研究,12/16/2017,25,目的 研究孕激素体外调节淋球菌引起的中性粒细胞呼吸爆发和凋亡的作用。方法 分离人外周血中性粒细胞，分别用孕激素和十字孢碱处理，十字孢碱作为阳性对照。在0，3，8，12小时等时段用荧光定量RT-PCR分别测定各组中性粒细胞中凋亡抑制蛋白cIAP2和XIAP 的表达水平；同时用流式细胞仪检测PMNs凋亡，用鲁米诺化学发光法检测淋球菌ST2951株刺激PMNs后呼吸爆发。,12/16/2017,26,Figure 1 Effect of progesterone on expressions of IAPs were analyzed by real-time PCR.,12/16/2017,27,Table 1 Progesterone delayed the onset of apoptosis in Ngo challenged PMNs.,12/16/2017,28,Figure2 Annexin V-FITC PI method for detection of apoptosis in Ngo challenged PMNs at 12h.,12/16/2017,29,Figure 3 Chemiluminescence. Adherent PMN were challenged in the presence of luminol with staurosporine () or with progesterone(), Medium+ST2951 () were used as a negative control. Chemiluminescence readings were taken every 5 min for 1 h.,12/16/2017,30,结果 cIAP2在孕激素处理3h后显著上调而XIAP和ST2951+medium组相比上调轻微；cIAP2在十字孢碱组是下调的。此外，我们发现孕激素对淋球菌ST2951刺激后的中性粒细胞有明显的延迟凋亡作用，尤其是在12h的时候；10ng/mL的孕激素对中性粒细胞的呼吸爆发并没有显著的影响，而十字孢碱加强了淋球菌刺激后中性粒细胞超氧负离子的产生。结论 孕激素对淋球菌引起的中性粒细胞炎症反应有很重要的调节作用，孕激素介导的延迟感染了淋球菌的中性粒细胞凋亡可能是其逃避天然免疫和建立女性生殖道长期的低水平感染的重要机制，可能在女性无症状感染中起重要作用。,12/16/2017,31,进一步研究性激素作用元件通过哪些信号传导途径调控Th2、Th17细