基因工程6表达系统和基因工程新技术.ppt

基因工程表达系统和蛋白质工程 中国药科大学生物制药教研室 一 外源基因在大肠杆菌中的表达 1 大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征a大肠杆菌表达外源基因的优势全基因组测序 共有4405个开放型阅读框架基因克隆表达系统成熟完善繁殖迅速 培养简单 操作方便 遗传稳定被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物 b大肠杆菌表达外源基因的劣势缺乏对真核生物蛋白质的复性功能缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白细胞周质内含有种类繁多的内毒素 外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理启动子终止子核糖体结合位点密码子质粒拷贝数 转录 翻译 Ptac 3Ptrp 11Plac 启动子 转录调控机理具有多顺反子结构 基因排列次序为 启动子 lacP 操纵基因 lacO 结构基因 lacZ lacY lacA 正调节因子CAP负调节因子lacI 启动子 Lac表达系统以大肠杆菌lac操纵子调控机理为基础设计 构建的表达系统 lacIPlaclacOlacZlacYlacA lacIPlaclacOlacZlacYlacA Lac表达系统正调节因子CAPcAMP激活CAP CAP cAMP复合物与lac操纵子上专一位点结合后 能促进RNA聚合酶与 35 10序列的结合 进而促进Plac介导的转录 基因工程中使用的lac启动子均为抗葡萄糖代谢阻遏的突变型 即PlacUV5 Lac表达系统lacUV5突变体PlacUV5突变体能够在没有CAP存在的情形下非常有效的起始转录 受它控制的基因在转录水平上只受lacI的调控 因此用它构建的表达载体在使用时比野生型Plac更易操作 Lac表达系统负调节因子lacI在无诱导物情形下 lacI基因产物形成四聚体阻遏蛋白 与启动子下游的操纵基因紧密结合 阻止转录的起始 lacIPlaclacOlacZlacYlacA lacIPlaclacOlacZlacYlacA Tac表达系统tac启动子是由trp的 35序列和lacUV5的 10序列拼接而成的杂合启动子 调控模式与lacUV5相似 但mRNA转录水平更高于trp和lacUV5启动子 Ptac 3Ptrp 11Plac 因此在要求有较高基因表达水平的情况下 选用tac启动子比用lacUV5启动子更优越 lac tac启动子对宿主菌的要求在普通大肠杆菌中 LacI阻遏蛋白仅能满足细胞染色体上lac操纵子转录调控的需要 当多拷贝的lacO随着带有lacUV5 tac启动子的表达质粒转化进入大肠杆菌后 LacI阻遏蛋白与lacO的比例显著下降 无法保证每一个lacO都能获得足够的LacI阻遏蛋白参与转录调控 表现为在无诱导物存在的情形下 lacUV5 tac启动子有较高的本底转录 lac tac启动子对宿主菌的要求为了使以Lac Tac表达系统具有严紧调控外源基因转录的能力 一种能产生过量的LacI阻遏蛋白的lacI基因的突变体lacIq被应用于表达系统 大肠杆菌JM109等菌株的基因型均为lacIq 常被选用为Lac Tac表达系统的宿主菌 但是这些菌株也只能对低拷贝的表达载体实现严紧调控 在使用高拷贝复制子构建表达载体时 仍能观察到较高水平的本底转录 需在表达载体中插入lacIq基因以保证有较多的LacI阻遏蛋白产生 lac tac表达系统存在的问题IPTG用于诱导lac tac启动子的转录 但由于IPTG本身具有一定的毒性 从安全角度 对表达和制备用于医疗目的的重组蛋白并不适合 一些国家规定在生产人用重组蛋白质的生产工艺中不能使用IPTG解决方法lac和tac启动子的转录受温度严紧调控乳糖替代IPTG诱导lac和tac启动子的转录 lac tac表达系统存在的问题lac和tac启动子的转录受温度严紧调控把阻遏蛋白LacI的温度敏感突变体lacI ts lacIq ts 插入表达载体或整合到染色体后 均能使lac和tac启动子的转录受到温度严紧调控在较低温度 30 时抑制 在较高温度 42 时开放 用乳糖替代IPTG诱导lac和tac启动子的转录乳糖在b 半乳糖苷酶作用下生成异乳糖 异乳糖具有诱导剂的作用这一过程涉及乳糖的转运和转化 其效率受到多种因素的影响和制约因此乳糖诱导的有效剂量大大高于IPTG 乳糖本身作为一种碳源可以被大肠杆菌代谢利用 较多的乳糖存在也会导致菌体生理及生长特性变化 乳糖替代lPTG作为诱导剂的研究要与发酵工艺结合起来 才能显示其良好的前景 转录调控机理色氨酸启动子Ptrp受色氨酸 阻遏蛋白复合物的阻遏 转录呈基底状态 在培养系统中去除色氨酸或者加入3 吲哚丙烯酸 IAA 便可有效地解除阻遏抑制作用 在正常的细菌培养体系中 除去色氨酸是困难的 因此基因工程中往往添加IAA诱导Ptrp介导的目的基因表达 启动子 Trp表达系统以大肠杆菌trp操纵子调控机理为基础设计 构建的表达系统 Trp表达系统 PL和PR表达系统以l噬菌体早期转录启动子PL PR为核心构建的表达系统在野生型l噬菌体中 PL PR启动子转录与否决定了l噬菌体进入裂解循环还是溶源循环 启动子 PL和PR表达系统转录调控的机理由l噬菌体PE启动子控制的cI基因的产物是PL PR启动子转录的阻遏物 cI基因的产物在大肠杆菌宿主中的浓度取决于一系列宿主与噬菌体因子之间的错综复杂的平衡关系 由于通过细胞因子来控制cI基因产物的产生和消失是相当困难的 因此PL PR表达系统都选用温度敏感突变体cI857 ts 的基因产物来调控PL PR启动子的转录 在较低温度 30 时以活性形式存在在较高温度 42 时失活脱落 PL和PR表达系统宿主菌中没有cI基因产物 PL PR启动子的高强度直接转录 带有PL或PR启动子的表达载体在普通大肠杆菌中相当不稳定 对宿主菌的要求用溶源化l噬菌体的大肠杆菌作PL PR启动子表达载体的宿主菌N4830 1 POP2136等菌株已经溶源化cI857 ts l噬菌体 可用作表达外源基因时的宿主菌 把cI857 ts 基因组装在表达载体上宿主菌选择范围更大 PL和PR表达系统存在的问题由于PL和PR表达系统诱导时不加化学诱导剂 成本又低廉 最初几个在大肠杆菌中制备的药用重组蛋白质都采用PL或PR表达系统 缺陷在热脉冲诱导过程中 大肠杆菌热休克蛋白的表达也会被激活 其中一些是蛋白水解酶 有可能降解所表达的重组蛋白 在大体积发酵培养菌体时 通过热平衡交换方式把培养温度从30 提高到42 需要较长的时间 这种缓慢的升温方式影响诱导效果 对重组蛋白表达量有一定的影响 T7表达系统大肠杆菌T7噬菌体具有一套专一性非常强的转录体系 利用这一体系中的元件为基础构建的表达系统称为T7表达系统 T7噬菌体基因1编码的T7RNA聚合酶选择性的激活T7噬菌体启动子的转录 T7RNA聚合酶活性高 其合成RNA的速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍左右 并可以转录某些不能被大肠杆菌RNA聚合酶有效转录的序列 在细胞中存在T7RNA聚合酶和T7噬茵体启动子的情形下 大肠杆菌宿主本身基因的转录竞争不过T7噬菌体转录体系 最终受T7噬菌体启动子控制的基因的转录达到很高的水平 T7表达系统转录调控的机理T7噬菌体启动子的转录完全依赖于T7RNA聚合酶 因此T7RNA聚合酶的转录调控模式就决定了表达系统的调控方式 化学诱导型温度诱导型双质粒系统 化学诱导型噬菌体DE3是l噬菌体的衍生株 一段含有lacI lacUV5启动子和T7RNA聚合酶基因的DNA片段被插入其int基因中用噬菌体DE3的溶源菌作为表达载体的宿主菌 调控方式为化学诱导型 类似于Lac表达系统 T7RNA聚合酶基因 lac启动子 E Coli DE3 IPTG诱导 温度诱导型PL启动子控制T7RNA聚合酶基因 通过热诱导方式激发T7噬菌体启动子的转录 这种方式可以使本底转录降到很低的水平 尤其适用于表达对大肠杆菌宿主有毒性的重组蛋白质 T7RNA聚合酶基因 PL启动子 E Coli CE6 热诱导 cI857 双质粒系统一个质粒带有T7RNA聚合酶基因 另一个质粒带有T7启动子和目的基因两个质粒的复制子和抗性标记不能相同调控方式为控制T7RNA聚合酶的启动子调控类型 热诱导 T7表达系统存在的问题T7表达系统表达目的基因的水平是目前所有表达系统中最高的 但也不可避免出现在相对较高的本底转录 如果目的基因产物对大肠杆菌宿主有毒性 会影响细胞的生长 解决办法之一在表达系统中低水平表达T7溶菌酶基因 因为T7溶菌酶除了作用于大肠杆菌细胞壁上肽聚糖外 还能与T7RNA聚合酶结合抑制其转录的活性 目前T7溶菌酶基因都通过共转化质拉导入表达系统 它能明显降低本底转录 但对诱导后目的基因的表达水平无明显影响 强化转录终止的必要性外源基因在强启动子的控制下表达 容易发生转录过头现象 即RNA聚合酶滑过终止子结构继续转录质粒上邻近的DNA序列 形成长短不一的mRNA混合物过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达 其原因如下 转录产物越长 RNA聚合酶转录一分子mRNA所需的时间就相应增加 外源基因本身的转录效率下降 如果外源基因下游紧接有载体上的其它重要基因或DNA功能区域 如选择性标记基因和复制子结构等 则RNA聚合酶在此处的转录可能干扰质粒的复制及其它生物功能 甚至导致重组质粒的不稳定性 过长的mRNA往往会产生大量无用的蛋白质 增加工程菌无谓的能量消耗 更为严重的是 过长的转录物往往不能形成理想的二级结构 从而大大降低外源基因编码产物的翻译效率 终止子 强终止子的选择与使用目前外源基因表达质粒中常用的终止子是来自大肠杆菌rRNA操纵子上的rrnT1T2以及T7噬菌体DNA上的Tf 对于一些终止作用较弱的终止子 通常可以采用二聚体终止子串联的特殊结构 以增强其转录终止作用 外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动的频率 而且在很大程度上还与mRNA的翻译起始效率密切相关 大肠杆菌细胞中结构不同的mRNA分子具有不同的翻译效率 它们之间的差别有时可高达数百倍 mRNA翻译的起始效率主要由其5 端的结构序列所决定 称为核糖体结合位点 RBS 核糖体结合位点 大肠杆菌核糖体结合位点包括下列四个特征结构要素 位于翻译起始密码子上游的6 8个核苷酸序列5 UAAGGAGG3 即Shine Dalgarno SD 序列 它通过识别大肠杆菌核糖体小亚基中的16SrRNA3 端区域3 AUUCCUCC5 并与之专一性结合将mRNA定位于核糖体上 从而启动翻译 翻译起始密码子 大肠杆菌绝大部分基因以AUG作为阅读框架的起始位点 有些基因也使用GUG或UUG作为翻译起始密码子SD序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成基因编码区5 端若干密码子的碱基序列 核糖体结合位点对外源基因表达的影响SD序列的影响一般来说 mRNA与核糖体的结合程度越强 翻译的起始效率就越高 而这种结合程度主要取决于SD UAAGGAGG 序列与16SrRNA的碱基互补性 其中以GGAG四个碱基序列尤为重要 对多数基因而言 上述四个碱基中任何一个换成C或T 均会导致翻译效率大幅度降低 SD序列与起始密码子之间的序列的影响SD序列下游的碱基若为AAAA或UUUU 翻译效率最高 而CCCC或GGGG的翻译效率则分别是最高值的50 和25 紧邻AUG的前三个碱基成份对翻译起始也有影响 对于大肠杆菌b 半乳糖苷酶的mRNA而言 在这个位置上最佳的碱基组合是UAU或CUU 如果用UUC UCA或AGG取代之 则酶的表达水平低20倍 SD序列与起始密码子之间的距离的影响SD序列与起始密码子AUG之间的精确距离保证了mRNA在核糖体上定位后 翻译起始密码子AUG正好处于核糖体复合物结构中的P位 这是翻译启动的前提条件 在很多情况下 SD序列位于AUG之前大约七个碱基处 在此间隔中少一个碱基或多一个碱基 均会导致翻译起始效率不同程度的降低 起始密码子及其后续若干密码子的影响大肠杆菌中的起始tRNA分子可以同时识别AUG GUG和UUG三种起始密码子 但其识别频率并不相同 通常GUG为AUG的50 而UUG只及AUG的25 除此之外 从AUG开始的前几个密码子碱基序列也至关重要 至少这一序列不能与mRNA的5 端非编码区形成茎环结构 否则便会严重干扰mRNA在核糖体上的准确定位目前广泛用于外源基因表达的大肠杆菌表达型质粒上 均含有与启动子来源相同的核糖体结合位点序列 序列和间隔是最佳的 不同的生物 甚至同种生物不同的蛋白质编码基因 对简并密码子使用频率并不相同 具有一定的偏爱性 其决定因素是 生物基因组中的碱基含量在富含AT的生物 如单链DNA噬菌体 X174 基因组中 密码子第三位上的U和A出现的频率较高 在GC丰富的生物 如链霉菌 基因组中 第三位上含有G或C的简并密码子占90 以上的绝对优势密码子与反密码子相互作用的自由能性中等强度规律如GGG CCC GCG GGC AAA UUU AUA UAU等使用少如GUG CAC UCG AGC ACA UGU AUC UUG等使用多细胞内tRNA的含量 密码子 生物体对密码子的偏爱性 密码子偏爱性对外源基因表达的影响由于原核生物和真核生物基因组中密码子的使用频率具有较大程大的差异性 因此外源基因尤其是高等哺乳动物基因在大肠杆菌中高效翻译的一个重要因素是密码子的正确选择 一般而言 有两种策略可以使外源基因上的密码子在大肠杆菌细胞中获得最佳表达 外源基因全合成同步表达相关tRNA编码基因 质粒拷贝数 质粒拷贝数对细菌生长代谢的影响目前实验室里广泛使用的表达型质粒在每个大肠杆菌细胞中可达数百甚至上千个拷贝 质粒的扩增过程通常发生在受体细胞的对数生长期内 而此时正是细菌生理代谢最旺盛的阶段 质粒分子的过度增殖以及其后目的基因的高效表达势必会影响受体细胞的生长代谢 进而导致重组质粒的不稳定性以及目的基因宏观表达水平的下降解决上述难题的一种有效策略是将重组质粒的扩增纳入可控制的轨道 胞内表达和胞外表达 蛋白质的合成是在细胞之中进行的目标蛋白在细胞质中表达的主要优点是 表达质粒的构建比较简单 能够达到很高的目标蛋白表达量 一般可以达到占细胞总蛋白的20 40 目标蛋白在大肠杆菌系统表达的形式有二种 在细胞内表现为不溶性的包涵体颗粒包涵体存在于大肠杆菌细胞质中在细胞内表现为可溶性的蛋白质可溶性的目标蛋白质除可存在于细胞质中外 还可借助于本身的功能序列和大肠杆菌蛋白质加工 运输体系 最终分泌到周质空间 或外泌到培养液中 大肠杆菌基因工程菌的构建策略包涵体型异源蛋白的表达分泌型异源蛋白的表达融合型异源蛋白的表达寡聚型异源蛋白的表达整合型异源蛋白的表达蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建 包涵体及其性质在某些生长条件下 大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子 它们致密地集聚在细胞内 或被膜包裹或形成无膜裸露结构 这种水不溶性的结构称为包涵体 InclusionBodies IB 富含蛋白质的包涵体多见于生长在含有氨基酸类似物培养基的大肠杆菌细胞中 由这些氨基酸类似物所合成的蛋白质往往会丧失其理化特性和生物功能 从而集聚形成包涵体 由高效表达质粒构建的大肠杆菌工程菌大量合成非天然性的同源或异源蛋白质 后者在一般情况下也以包涵体的形式存在于细菌细胞内 除此之外 包涵体中还含有少量的DNA RNA和脂多糖等非蛋白分子 包涵体型异源蛋白的表达 以包涵体形式表达目的蛋白的优缺点优点在一定程度上保持表达产物的结构稳定能够避免细胞内蛋白水解酶的作用 有利于目标蛋白的富集简化外源基因表达产物的分离操作包涵体的水难溶性及其密度远大于其它细胞碎片和细胞成分 菌体经超声波裂解后 直接通过高速离心即可将重组异源蛋白从细菌裂解物中分离出来能够表达对大肠杆菌宿主有毒或有致死效应的目标蛋白 缺点以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物活性 必须通过有效的变性复性操作 才能回收得到具有正确空间构象 因而具有生物活性 的目标蛋白 因此包涵体变复性操作的效率对目标产物的收率至关重要 经过复性处理的目标蛋白不一定能完全恢复原来的生物学活性 有时甚至完全得不到有活性的蛋白蛋 尤其当目标蛋白分子中的Cys残基数目较高时 体外复性蛋白质的成功率相当低 一般不超过30 复性处理工艺可使目标蛋白的制备成本上升 包涵体的变性与复性操作包涵体的溶解与变性包涵体的溶解与变性的主要任务是拆开错配的二硫键和次级键 在人工条件下 使包涵体溶解并重新进入复性途径中 能有效促进包涵体溶解变性的试剂和条件包括 清洗剂SDS 正十二醇肌氨酸 廉价 但影响复性和纯化促溶剂盐酸胍 尿素 前者昂贵 尿素便宜 但常被自发形成的氰酸盐污染 后者能与多肽链中的氨基反应混合溶剂如尿素与醋酸 二甲基砜等联合使用 溶解力增强极端pH廉价 但许多蛋白质在极端pH条件下发生修饰反应包涵体的复性与重折叠 refolding 包涵体的复性与重折叠的主要任务 将多肽链中被拆开的游离巯基重新折叠通过次级键的形成使蛋白质复性 在细胞内表现为可溶性的蛋白质目标蛋白以可溶性蛋白质形式表达虽然可以避免包涵体复性带来的问题 但是也有一定的缺陷 主要表现为大肠杆菌本身存在于细胞质中的蛋白质往往只含有少量的 甚至没有半胱氨酸残基 富含半胱氨酸残基 需要形成二硫键的蛋白质大部份被转运到细胞的其他部位 分泌型异源蛋白的表达 这是因为大肠杆菌细胞质微环境的氧化还原态势不利于蛋白质二硫键的形成 而且缺少一种形成二硫键所必须的体系 一些需要通过二硫键的形成来维持其构象的目标蛋白在大肠杆菌的细胞质中往往不能正确折叠 解决这一问题的途径之一是用大肠杆菌氧硫还蛋白还原酶基因trxB缺陷株作为宿主菌表达目标蛋白 研究表明trxB缺陷株细胞质的氧化还原态势发生了变化 蛋白质在trxB缺陷株的细胞质中能够形成二硫键 这一菌株对于表达结构复杂的蛋白质而言是一 个相当重要的工具 在细胞质中直接表达不带有前导序列的成熟蛋白质在细胞质中直接表达不带有前导序列的成熟蛋白质需要起始密码 通常为编码甲硫氨酸的ATG 在多数情况下 N端附加的甲硫氨酸对蛋白质的性质没有特别的影响 但是也有附加的甲硫氨酸严重影响蛋白质生物学活力的报道 另外 附加的甲硫氨酸也可能改变蛋白质的免疫性质和药理性质 从制备用于医疗目的的蛋白质的角度来看 这是一个需要引起重视的问题 去除附加的甲硫氨酸有二种方法 在表达系统中共表达甲硫氨酸氨肽酶基因 在分离纯化后在体外用外肽酶处理 但它们都对与甲硫氨酸相邻的氨基酸残基类型有一定要求 因此在使用上有一定的限制 目标蛋白与有亲合配基的序列融合表达与纯化包涵体相比 细胞质中以可溶性形式表达蛋白质的分离纯化过程比较复杂 一般要通过亲合层析才能达到比较高的纯度 目标蛋白与有亲合配基的序列融合表达既可以提高分离纯化的效率 又能在融合蛋白切离的过程中得到没有附加甲硫氨酸目标蛋白 金黄色葡萄球菌蛋白G A和衍生物Z 日本血吸虫谷胱甘肽 S 转移酶 大肠杆菌麦芽糖结合蛋白 His tag等是目前常用的与目标基因融合表达的序列 目标蛋白在周质空间中表达目标蛋白在周质空间中表达的优点 大肠杆菌周质空间中自身蛋白质的数量约为100种 只占菌体总蛋白数量的4 蛋白水解酶的含量与在细胞质中相比也少得多 因此目标蛋白在周质空间中表达有利于分离纯化和减少蛋白水解酶的降解 目标蛋白从细胞质转运到周质空间过程中信号肽被加工切除 有效地避免了N端附加的甲硫氨酸的产生 周质空间中呈氧化型的氧化还原态势使目标蛋白能够较好折叠 维持正确的构象 目标蛋白外泌表达把所表达的目标蛋白外泌到细胞外的培养基中可以进一步减少蛋白水解酶的降解 也有利于分离纯化 目前成功的例子主要是采用以下方案 1 与大肠杆菌本身的外泌蛋白基因融合表达 2 与一些能提高细胞外膜通透性的因子融合或共表达 3 改变培养基的成分归纳现有的研究结果显示这些方法仅对外泌分子量较小的蛋白有效 而且外泌效率一般都比较低 高效表达目标基因的战略和技术 1选择强启动子组建表达载体2适当增加表达质粒的拷贝数以增加基因剂量3使用大肠杆菌偏爱的密码子 同事优化SD序列与AUG之间的距离4采用蛋白酶缺失的宿主菌 尽可能降低表达产物的降解5采用诱导表达 共表达大肠杆菌稀有密码子tRNA基因表达水平高的基因呈现的密码子偏爱性高于表达水平低的基因 现已阐明的在大肠杆菌中的稀有密码子有 编码Arg的密码子AGA AGG CGA CGG编码Pro的密码子CCC CCU CCA编码Cys的密码子UGU UGC 编码Gly的密码子GGA GGG编码Leu的密码子CUA CUC编码Ile的密码子AUA编码Ser的密码子UCA AUG UCG UCC编码Thr的密码子ACA 共表达大肠杆菌稀有密码子tRNA基因由于同义密码子的使用频率与细胞内对应的tRNA的丰度有正比关系稀有密码子对应的tRNA的丰度很低 有可能在翻译过程中发生中止和移码突变 解决这一问题的办法 通过基因突变把稀有密码子改变为其他使用频率高的同义密码子 在表达系统中共表达稀有密码子tRNA基因 以提高大肠杆菌细胞内稀有密码子tRNA的丰度 在所有的大肠杆菌稀有密码子tRNA中 tRNAArg AGG AGA 含量最少 而AGG和AGA密码子在真核基因中经常出现 人尿激酶原ProUK 新型组织纤溶酶原激活剂NTA等基因中都含有较多的AGG和AGA密码子 在大肠杆菌中直接表达的水平很低 但在大肠杆菌中共表达tRNAArg AGG AGA 基因argU后 这些基因的表达水平能明显得到提高 现在还没有一个固定规则来判定稀有密码子的存在是否确实会对翻译过程产生明显的不利影响 因为稀有密码子存在的位置 分布的均匀性 mRNA的二级结构的不同决定了它对翻译过程的影响是有差别的 所有的结论要通过实验才能得出 二 酵母表达系统 甲醇酵母表达系统 酿酒酵母表达系统 一 酿酒酵母表达系统 酿酒酵母分泌系统 酿酒酵母系统启动子 酿酒酵母表达系统存在的问题 酿酒酵母糖基化系统 1 酿酒酵母启动子 UAS URS TATA 起始位点 编码序列 mRNA 40 120bp 20 40bp 100 1400bp 1 转录起始位点 4 URS 上游阻遏序列2 TATA盒 富含AT 5 DAS 下游激活序列3 UAS 上游激活序列 DAS 1 糖酵解途径中关键酶的强启动子 受葡萄糖诱导 甘油醛 3 磷酸脱氢酶基因GAPDH磷酸甘油激酶基因PKG乙醇脱氢酶基因ADH 酿酒酵母表达系统常用启动子 2 半乳糖激酶启动子 GAL1 GAL1 GAL7 GAL10 UAS GAL4 GAL80 A GAL1 GAL7和GAL10基因连锁在一起 独立转录 共同调控B GAL4产物与UAS结合 促进转录 GAL80产物抑制GAL4产物的活性 阻遏转录C 野生型GAL4表达水平低 产物活性可被GLAL80产物完全抑制 半乳糖诱导效果差 半乳糖诱导 葡萄糖抑制 GAL1 GAL7 GAL10 UAS GAL4 GAL80 A 将GAL4的启动子换成GAL10的诱导型强启动子B 半乳糖诱导GAL4高表达 不受GAL80产物抑制 激活GAL1等高效转录 半乳糖诱导 葡萄糖抑制 Promoter GAL10 3 pho4TS PHO5启动子 A PHO5启动子在培养基缺磷酸盐时启动转录B PHO4基因编码产物是PHO5启动子的正调控因子C pho4TS温度敏感 35 时失活 PHO5关闭D pho4TS PHO5启动子通过降温 23 诱导表达 低温诱导 磷酸盐抑制 酿酒酵母系统常用分泌信号肽来源 性结合因子 MF 酸性磷酸酯酶 PHO5蔗糖酶 SUC2杀手毒素因子 KIL 2 酿酒酵母分泌系统 保守性低 大多异源宿主系统的信号肽不能互用 信号肽结构 酿酒酵母信号肽特点 正电荷区 疏水区 极性区 Met 目的蛋白 信号肽剪切位点 分泌效率高 在酵母系统具有通用性 88个残基组成 MF 信号肽 Met 目的蛋白 Lys Arg Glu Ala Glu Ala KEX2 DAP DAP DAP STE13编码的二肽酶 糖基化位点 Asn X Thr Ser X代表任何氨基酸 N 型糖基化 天门冬酰氨酸残基上的酰胺氮进行糖基化 对蛋白质的折叠 稳定性及活性较重要 O 型糖基化 苏氨酸 丝氨酸上的羟基氧进行糖基化 3 酿酒酵母糖基化系统 过糖基化 超糖基化修饰 N型或O型糖基的外链进一步形成庞大的 由甘露糖组成的 复杂分支结构的现象 增加了免疫原性 对活性与药代稳定性均有影响 糖链组成O型糖链仅由甘露糖组成 而哺乳细胞的还含唾液酸基团 酿酒酵母糖基化特点 1 表达水平普遍不高A 表达载体传代不稳定 YEp YRp B 所采用的强启动子调控不严谨C 不能利用简单的无机培养基进行高密度发酵2 分泌表达产物过糖基化 4 酿酒酵母表达系统的缺陷 二 甲醇酵母表达系统 甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子 甲醇酵母表达系统的应用 甲醇酵母表达系统操作原理 甲醇酵母系统高效表达影响因素与对策 甲醇酵母表达系统的优缺点 1 甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子 甲醇酵母 methylotrophicyeast 指可利用甲醇作单一碳源的一类酵母 毕赤酵母 Pichiapastoris 汉森酵母 Hansenulaploymorpha 假丝酵母 Candiaboidinii 甲醇氧化酶甲醇代谢关键酶 占可溶蛋白的30 以上 AOX1与AOX2 毕赤酵母和假丝酵母基因组存在二个AOX基因AOX1 AOX2 AOX1与AOX2基因97 同源 AOX1占主导地位 负责AOX99 以上活性 甲醇氧化酶启动子A 目前已发现的 最强的真核启动子B 严谨调控型启动子AOX1 葡萄糖和甘油脱阻遏 甲醇诱导MOX 葡萄糖阻遏 甘油脱阻遏 甲醇诱导 2 甲醇酵母表达系统的优缺点 A 表达水平高 最高水平的系统 B 产物可翻译后修饰 糖基化 磷酸化 酰脂化C 过糖基化程度比酿酒酵母少 8 15个vs100 150个甘露糖 D 产物可正确折叠和高效分泌 最高分泌表达系统 E 可利用简单无机盐培养基高密度发酵 生物量大 F 实验室和工业操作简单G 不能满足结构要求严格的糖基化 3 甲醇酵母表达系统操作原理 宿主株与标记基因甲醇酵母系统的整合事件胞内表达与分泌表达 甲醇酵母系统宿主 二大宿主系统主要特点 项目毕赤酵母汉森酵母 最适温度30 37 最适pH值4 54 5甘油阻遏是否糖基化部分过度较正常高密度发酵100g L100g L 二大宿主系统主要选择标记 宿主选择标记 毕赤酵母his4 G418 Zeocin Cu 汉森酵母leu2 his3 ura3 G418 毕赤酵母系统主要宿主株 宿主株特点 Y11430野生型 Mut GS115his4 Mut KM71his4 aox1 ARG4 AOX1 MutsSMD1168his4 胞外蛋白酶缺陷 高分泌MC1003his4 AOX1 AOX2 甲醇不生长 甲醇酵母系统的整合事件 YRp型载体 汉森系统传代不稳定 传代过程同源或非同源重组 高选择压力迫使高拷贝数整合 可达100拷贝 YIp型载体 A 在靶序列处线性化载体DNA 诱导同源重组B 有 插入 和 取代 二类整合模式C 主要为单拷贝整合 1 10 为多拷贝整合 毕赤酵母系统模式表达载体 1 AOX1位点插入 宿主株 GS115 KM71可插入位点 5 AOX13 AOX1TT 转化子 GS115 His Mut KM71 His Muts 2 His4位点插入 转化子 GS115 His Mut KM71 His Muts 宿主株 GS115 KM71可插入位点 5 His43 His4 3 多基因插入事件 串联整合 宿主株 GS115 KM71可插入位点 5 AOX13 AOX1TT 转化子 GS115 His Mut KM71 His Muts 4 基因取代 GS115 AOX1 转化子 His4 Muts 汉森酵母系统的高拷贝整合型表达载体 高拷贝整合元件 A 高度重复序列 rDNA提供多个整合位点B 缺陷型标记基因 Leu2d提高选择压力C 抗性标记 neo提高选择压力 甲醇酵母系统胞内表达载体 表达载体类型 需要带入ATG 多位点 甲醇酵母系统分泌表达载体 信号肽 MF 甲醇酵母系统分泌表达载体 信号肽 MF 标记 Kan 4 甲醇酵母系统高效表达影响因素与对策 载体稳定性基因剂量整合位点甲醇利用表型mRNA5 端AT含量分泌信号表达产物稳定性 1 载体稳定性 同拷贝数时 整合型的比自主复制型的表达水平高YRp型载体的稳定化 选择 非选择培养交替数十代可得稳定的整合子 但费时 整合位点不确定 采用YIp型载体 更易实现整合 整合位点清楚 2 基因剂量 外源基因表达存在基因剂量效应筛选多拷贝整合子载体引入G418 Zeocin抗性标记 整合子拷贝数与抗性成正相关 采用高G418 Zeocin抗性转化子 体外串联多个表达盒 直接获多拷贝整合子采用YRp型载体稳定化技术获高拷贝整合子构建高拷贝整合型表达载体 3 整合位点 外源基因表达盒整合于AOX MOX或标记基因处 均可高效表达毕赤酵母中个别情况整合于His4位点的比AOX1位点的低 4 甲醇利用表型 在分泌表达情况下 甲醇慢生长型更利于表达 5 mRNA5 端 mRNA5 端非翻译区 UTR 的组成与长度应尽量与AOX1 MOX的一致应尽量避免在UTR区出现AUG和次级结构 6 基因序列的AT含量AT含量越高 越容易出现类似于终止子的结构 7 分泌信号 分泌表达效率与所用分泌信号高度相关可采用酿酒酵母来源的MF PHO或SUC等的信号肽 或野生型信号肽 但适用性要比较分析 8 表达产物稳定性分泌表达时 胞外蛋白酶是要影响因素降低培养基pH值 蛋白酶在酸性条件下活性较低培养基中添加蛋白水解产物 竞争性抑制采用蛋白酶缺陷宿主株 如P pastorisSMD1168 蛋白质工程 蛋白质工程概述 一 蛋白质工程的概念蛋白质工程 ProteinEngineering 是指通过蛋白质化学 晶体学和动力学的研究 获取关于蛋白质物理 化学等各方面的信息 在此基础上 对编码该蛋白质的基因进行有目的的改造 并通过基因工程等手段将其进行表达和分离纯化 最终得到比天然蛋白质更好的产物 是在基因工程的基础上延伸出来的第二代基因工程 基因DNA 氨基酸序列多肽链 蛋白质三维结构 预期功能 生物功能 mRNA 转录 翻译 折叠 DNA合成 分子设计 基因工程与蛋白质工程的区别 基因工程通过分离目的基因重组DNA分子 使目的基因更换宿主得以异体表达 从而创造新类型 但这只能合成自然界固有的蛋白质 蛋白质工程则是运用基因工程的DNA重组技术 将克隆后的基因编码序列加以改造 或者人工合成新的基因 再将上述基因通过载体引入适宜的宿主系统内加以表达 从而产生数量几乎不受限制 有特定性能的 突变型 蛋白质分子 甚至全新的蛋白质分子 蛋白质工程的研究内容 蛋白质工程4大类研究 1 利用已知的蛋白质一级结构的信息开发应用研究 2 定量确定蛋白质结构 功能关系 包括蛋白质三维结构模型的建立 酶催化性质 蛋白质折叠和稳定性研究 蛋白质变异的探讨等 3 从混杂变异体库中筛选出具有特定结构 功能关系的蛋白质 4 根据已知结构 功能关系的蛋白质 用人工方法合成它及其变异体 完全人为控制蛋白质的性质 酶绝大多数是蛋白质 天然的生物酶虽然能在生物体内发挥各种功能 但在生物体外 特别是在工业条件 高温 高压 机械力 重金属离子 有机溶剂 氧化剂 极端pH等 下 则常易遭到破坏 需要改造天然酶 使其能够适应特殊的工业过程 或设计制造出全新的人工酶或人工蛋白 以生产全新的医用药品 农业药物 工业用酶和一些天然酶不能催化的化学催化剂 对蛋白质可以进行10个方面的改造 1 改变酶的Km与Vmax 以改变酶的催化效率2 改变蛋白质的pH或温度稳定范围 改变蛋白的作用条件3 改变酶在非水溶剂的反应性4 使酶不需要加入辅助因子 简化持续生产过程5 提高酶对底物的亲和力 以增强酶的专一性 减少不必要的副反应6 增强蛋白对胞内蛋白酶的抗性 从而简化操作过程 提高产率7 改变酶的别构调节部位 减少反馈抑制 提高产率8 提高蛋白的抗氧化能力9 根据需要改变酶的底物专一性10 改变蛋白发生作用的种属特异性 蛋白质工程的发展 蛋白质工程是20世纪80年代处诞生的一个新兴生物技术领域 1983年 Ulmer在 Science 上发表以 ProteinEngineering 蛋白质工程 为题的专论 一般将此视为蛋白质工程诞生的标志 当前 蛋白质工程是发展较好 较快的分子工程 这是因为在进行蛋白质分子设计后 已可应用高效的基因工程来进行蛋白的合成 最早的蛋白工程是福什特 Forsht 等在1982 1985年间对酪氨酰 t RNA合成酶的分子改造工作 他根据XRD X射线衍射 实测该酶与底物结合部位结构 用定位突变技术改变与底物结合的氨基酸残基 并用动力学方法测量所得变体酶的活性 深入探讨了酶与底物的作用机制 佩里 Perry 1984年通过将溶菌酶中Ile 3 改成Cys 3 并进一步氧化生成Cys 3 Cys 97 二硫键 使酶热稳定性提高 显著改进了这种食品工业用酶的应用价值 1987年福什特通过将枯草杆菌蛋白酶分子表面的Asp 99 和Glu 156 改成Lys 而导致了活性中心His 64 质子pKa从7下降到6 使酶在pH 6时的活力提高10倍 1988年杜邦公司宣布 成功设计并合成了由四段反平行 螺旋组成为73个氨基残基的成果 这显示 按人们预期要求 通过从头设计以折叠成新蛋白的目标已是可望又可及了 这显示 按人们预期要求 通过从头设计以折叠成新蛋白的目标已是可望又可及了 预测结构的模型法 在奠定分子生物学基础时起过重大作用 蛋白的一级结构 包含着关于高级结构的信息这一点已日益明确 结合模型法 通过分子工程来预测高级结构 已成为人们所瞩目的问题了 蛋白质工程汇集了当代分子生物学等学科的一些前沿领域的最新成就 它把核酸与蛋白质结合 蛋白质空间结构与生物功能结合起来研究 蛋白质工程将蛋白质与酶的研究推进到崭新的时代 为蛋白质和酶在工业 农业和医药方面的应用开拓了诱人的前景 蛋白质工程开创了按照人类意愿改造 创造符合人类需要的蛋白质的新时期 蛋白质工程的基本步骤 1 分离纯化需改造的目的蛋白2 了解其一级结构及高级结构 了解其结构 功能关系3 获取编码该蛋白的基因序列4 设计改造方案5 对基因序列进行改造6 将经过改造的基因序列重组入表达载体 进行表达7 分离纯化表达产物 并对其功能进行检测 蛋白质工程的程序 二 蛋白质工程的改造策略与方法 1 疏水性氨基酸常常出现在蛋白质的活性中心区域 螺旋和 折叠区通常不会是酶的活性中心或配体以及底物结合的中心 而是作为结构的支架 环 Loop 区 转角 turn 区域和带电荷区域通常位于蛋白质的表面 基于这种经验 在设计突变时要注意保留脯氨酸或半胱氨酸残基 因为脯氨酸常被用来终止 螺旋区 而半胱氨酸酸常形成起稳定作用的二硫键 同时二硫键又是许多分泌性蛋白的标志 2 进行定点突变时 应注意保守氨基酸残基 如果要改变酶活性 底物结合活性等高度特异性的性质 则应尽量保留保守残基 3 应注意保留潜在的N糖基化位点 Asn X Ser Thr X Pro 中的Asn 天门冬酰胺 Ser 丝氨酸 或Thr 苏氨酸 在很多情况下 特别是分泌性蛋白和穿膜蛋白 能否正确糖基化对蛋白活性物影响很大 4 对于含有内含子的序列 可以删除某一外显子或外显子组合 因为单个外显子通常编码独立折叠的结构域 删去该结构域后可能不会影响蛋白其余部分的正确折叠 5 构建两个同源蛋白的嵌合体时 应尽量使其接合部位处在具有相同或相近功能的氨基酸序列中 而当两个非同源蛋白组成嵌合体时 则应使接合部分尽量位于所预测结构的边缘 6 如果对目的蛋白的三维结构一无所知 那么可以在目的序列中随机插人六聚体接头以鉴定功能件结构域 插人六聚体接头后 在原蛋白质序列中添加两个氨基酸 比插人更多的氨基酸对蛋白质整体功能的破坏要轻 7 进行缺失突变时 应避免直接利用天然存在的限制性酶切位点进行删除 如果直接利用这种限制性内切酶位点 很容易破坏正确的开放读码框 或得到的缺失突变体边界不能落在适当的位置 而使蛋白质不能正确折叠 蛋白质改造方法 蛋白质工程研究的内容是以蛋白质结构功能关系的知识为基础 通过周密的分子设计把蛋白质改造为有预期的新特征的突变蛋白质 在基因水平上对蛋白质进行改造 按改造的规模和程度可以分为 个别氨基酸的改变和一整段氨基酸序列的删除 置换或插入 初级改造 蛋白质分子的剪裁 如结构域的拼接 高级改造 从头设计合成新型蛋白质 初级改造 为了实现氨基酸的置换 需要采用DNA碱基突变的方法 改变编码氨基酸的密码子 以达到改变氨基酸进而改造蛋白质的目的 蛋白质工程研究中主要采用的基因突变方法包括基因定位突变和盒式突变 一般 含有单一或少数几个突变位点的基因定向改变可以采用M13 DNA寡聚核苷酸介导诱变技术 寡核苷酸介导的PCR诱变技术 随机诱变技术和盒式突变技术 而大面积的定位突变则需要采取基因全合成的方法 寡聚核苷酸介导诱变技术 寡核苷酸介导的PCR诱变技术 克隆基因的随机诱变 盒式突变技术 结构域的拼接 蛋白质分子的高级改造 蛋白质分子种类繁多 结构复杂 其分子大小 形状也各个相同 在结构 通常认为 蛋白质分子的一级结构氨基酸序列一定规则构成二级结构 再由二级结构折叠成三级结构 研究证明 在二级结构和三级结构之间 还有一个结构层次 即结构域 domain 结构域是由 螺旋 折叠等二级结构单位按一定的拓扑学规则构成的三维空间结构实体 有些小分子量的蛋白质分子 如蝎毒 蛇毒和蜘蛛毒素等多肽类神经毒素 只包含一个结构域 而大部分蛋白质分子 则是由干个结构域构成的 结构域是蛋白质分子中一种基本的结构单位 结构域拼接是通过基因操作把位于两种不同蛋白质上的几个结构域连接在一起 形成融合蛋白 它兼有原来两种蛋白的性质 这是研究蛋白质功能的一种非常有力的手段 同时也为提高某些蛋白类药物的功效 改善其性能提供了一种思路 如今我们可以利用蛋白质工程的手段 加快自然界中的结构域拼接过程 以达到人们所预期的目标 1 HGP简介 人类基因组计划是由美国科学家于1985年率先提出 于1990年正式启动的 美国 英国 法国 德国 日本和我国科学家共同参与了这一价值达30亿美元的人类基因组计划 这一计划旨在为30多亿个碱基对构成的人类基因组精确测序 发现所有人类基因并搞清其在染色体上的位置 破译人类全部遗传信息 人类基因组计划和新药研究 科学家的胆略 诺贝尔奖获得者RenatoDulbecco于1986年发表短文 肿瘤研究的转折点 人类基因组测序 Science 231 1055 1056 文中指出 如果我们想更多地了解肿瘤 我们从现在起必须关注细胞的基因组 从哪个物种着手努力 如果我们想理解人类肿瘤 那就应从人类开始 人类肿瘤研究将因对DNA的详细知识而得到巨大推动 什么是基因组 Genome 基因组就是一个物种中所有基因的整体组成人类基因组有两层意义 遗传信息 遗传物质从整体水平研究基因的存在 基因的结构与功能 基因之间的相互关系 HGP的诞生 1984年12月Utah州的Alta WhiteR受美国能源部的委托 主持召开了一个小型会议 讨论DNA重组技术的发展及测定人类整个基因组的DNA序列的意义 1985年6月 在美国加州举行了一次会议 美国能源部提出了 人类基因组计划 的初步草案 1986年6月 在新墨西哥州讨论了这一计划的可行性 随后美国能源部宣布实施这一草案 1987年初 美国能源部与国家医学研究院 NIH 为 人类基因组计划 下拨了启动经费约550万美元 1987年总额近1 66亿美元 同时 美国开始筹建人类基因组计划实验室 1989年美国成立 国家人类基因组研究中心 诺贝尔奖金获得者J Waston出任第一任主任 1990年 历经5年辩论之后 美国国会批准美国的 人类基因组计划 于10月1日正式启动 美国的人类基因组计划总体规划是 拟在15年内至少投入30亿美元 进行对人类全基因组的分析 2000年6月26日美 英 日 德 法 中六国共同宣布人类基因组工作草图绘制成功 2019年 1 2月 HGP和美国塞莱拉 Sequencing 公司将各自测定的人类基因组工作框架图分别发表在Nature和Science上 这表明人类基因组计划 HGP 进入了一个展新的阶段 2019年4月14日美 英 日 德 法 中六国科学家完成了人类基因组序列图的绘制 实现了人类基因组计划的所有目标 2019年人类表观基因组计划 HumanEpigenomeProject 于10月7日正式启动 这是世界上首项针对控制人类基因 开 和 关 的主要化学变化进行的图谱绘制工作 它将帮助科学家建立人类遗传与疾病之间的关键联系 2019年10月国际人类基因组计划合作组织在 Nature发了杂志上宣布误差小于10万分之一的人类基因组完成图已成功绘就 已将原来15万个 缺隙 减少到341个 完成图显示人类基因组只含有2 2 5万个基因 比原来的估计要少 HGP对医药事业的影响发现新的致病基因发展一些复杂疾病的早期基因诊断方法 如 肿瘤基因组解剖计划 通过基因治疗解决传统方法无法解决的疑难杂症疾病易感基因的识别及对风险人群进行生活方式 环境因子的干预人类基因组多样性与个体化医学 所有的疾病 都可以说是基因病 基因病 概念 基因相关论 所有疾病都与人类基因有关 基因修饰论 所有药物都是通过修饰基因本身结构 改变基因的表达调控 影响基因产物的功能而起作用的 基因的外调性 基因的多态性 科学家在对一些遗传性很高或较高的疾病的研究中 如地中海贫血 肌肉萎缩 乳腺癌等疾病的研究中 各国科学家已找到了 至 个致病基因 约占遗传病的 其它疾病如白血病通过基因分析 也对发病机理有了新的认识 各国科学通过基因检测和使用基因药物 已能治疗一些疾病 如用基因注射法治疗一碰就出血的血友病 美国科学家运用破坏性基因治疗脑肿瘤 将外来破坏性基因接入脑肿瘤细胞 已取得了比单纯开刀更好的疗效 在今后 至 年中 各国科学家在基因研究中将携手攻关的重点放在糖尿病 动脉硬化 焦虑症与抑郁症 高血压 老年痴呆 精神分裂症 乳腺癌 以及其它一些癌症的探索上 血栓形成也与基因有关 迄今为止 我们只知道老年人 血脂高者和缺乏锻炼者 其体内较容易形成血栓 但最新一期 自然 杂志却报道说 科学家们已识别并成功地定位出了一个名为 VKORC1 的基因 它在危害人体的血栓形成的过程中发挥着重要作用 这一发现将有助于人们进一步寻找出治疗心律不齐及冠心病等疾病的新疗法 德国 英国和美国的科学家在各自独立的实验中 以产生了抗药性的实验鼠和血栓患者的基因为研究对象 并与天生就具有抗血栓特性人的基因进行比较 结果科学家们说 这个基因可以帮助人们理解血液稀释药物的工作原理 我国国际上首次确定雀斑致病基因位置 人人都想拥有一张净白无瑕的脸 雀斑一直困扰着这些爱美人士 最近 我国科学家在国际上首次确定雀斑致病基因位置 发现在人类第4号染色体的某个区域中存在雀斑致病基因 为找到雀斑致病基因并最终根治雀斑奠定了重要的基础 所以 市面上的激光去斑 药物去斑等