DNA甲基化和肿瘤的关系

DNA 甲基化与肿瘤,一、DNA甲基化与基因表达,5-甲基胞嘧啶是天然存在的修饰碱基，甲基化的mCpG ，在DNA 双链中对称出现。哺乳类动物基因组约60 %的表达基因5端启动子存在未被甲基化的CpG岛,而启动子区域外的CpG岛大都为mCpG。正常情况下，非活化的X染色体、印迹基因等的启动子区域的CpG岛为甲基化状态，而看家基因的CpG岛则是去甲基化状态。DNA 甲基化状态与基因表达呈负相关。其调控作用主要在转录水平抑制基因表达。,经过亚硫酸盐处理后的DNA中胞嘧啶（C）转变为胸腺嘧啶（T）,但是甲基化的中的CpG二核苷酸C未转变为T，而无甲基化的CpG二核苷酸则发生这种转变，由此可以推断DNA是否发生甲基化。,DNA甲基化的检测方法,TATAGGGCGAATTGGGCCCTCTAGATGCATGCTCGAGCGGCCGCCAGTGTGATGGATATCTGCAGAATTGCCCTTTAGTATTGTTTGGTGAAATGGTACGTGTTTATAATTTTAGTTATTTAGGAGGTTGAGGTAGGAGGATTTTTTGAGTTTAGGAGTTTAAGTTTAGTTTGGGTAATATAGTTTAGTGGTTATATTAAAAAAAGTAAAATAGTCGGGCGCGGTGGTTTACGTTTGTAATTTTAGTATTTTGGGAGGTCGAGGCGGGTGGATTACGAGGTTAGGAGGTTGAGATTATTTTAAGGGCAAT,DNA 甲基化抑制基因转录的分子机制 DNA 双螺旋结构的大沟为DNA 与多种转录因子的作用部位，mCpG的甲基化胞嘧啶突入大沟，抑制转录因子的结合而抑制转录。 mCpG激活阻遏蛋白因子，如DMAP1、TSG101、Mi2等，通过阻遏蛋白因子的作用抑制转录。DNA甲基化与组蛋白乙酰化的研究发现，组蛋白H3、H4 的赖氨酸去乙酰化后带负电荷,与带正电荷的DNA结合更紧密,不利于转录过程中的聚合物解聚，从而抑制基因转录。甲基化的CpG 结合蛋白(MeCPs) 与DNA的mCpG结合,并与组氨酸去乙酰化酶(HDAC) 形成复合物共同抑制转录。,二、DNA甲基化与肿瘤,以往的研究认为癌基因激活、抑癌基因失活主要是基因突变、缺失导致的DNA 序列改变。在肿瘤研究中，检测到许多肿瘤的重要基因并未发生突变、缺失， 基因表达的异常主要通过DNA 甲基化实现。癌基因的去甲基化和抑癌基因的甲基化状态，可导致癌基因激活、抑癌基因的失活。癌基因的低甲基化和抑癌基因的高甲基化改变是肿瘤细胞的一个重要特征。 DNA 甲基化状态的改变导致基因结构和功能的异常，与肿瘤发生的关系是近年来研究的热点。,DNA甲基化的异常与基因突变、缺失等基因组异常也有密切的关系甲基化异常可能通过以下途径导致的基因不稳定:DNA甲基化使基因突变率升高,5-甲基胞嘧啶可自发脱氨形成胸腺嘧啶,这一频率高于胞嘧啶转变为尿嘧啶的频率,并常导致C T 突变。p53、Rb、c-H-ras-1基因中均发现该类型突变。启动子甲基化使一些重要的基因渐成失活,倾向基因不稳定。肿瘤的一个重要特征是DNA启动子局部甲基化增强的同时,基因组总甲基化水平却低于正常细胞。 基因组总甲基化水平低也是基因不稳定的原因之一。,三、乳腺癌中基因的甲基化,1. ER基因ER的表达与否是乳腺癌激素治疗的一个肿瘤标记物。 ER基因启动子和1号外显子上分布有CpG岛。乳腺癌中ER失表达是经常性事件,约1/3的乳腺癌患者初诊时ER表达阴性；相当一部分的乳腺癌患者随着肿瘤病情的进展, ER由阳性变成阴性。 基因组的改变, 在ER基因失表达中作用不大。近来的研究认为, ER基因的甲基化异常是其失活的主要机制。,应用Southern 印迹杂交及MS-PCR法研究,显示在正常乳腺组织和ER表达阳性的肿瘤细胞株,如MCF-7、T47-D、ZR75-1 均未检测到启动子的高甲基化,而在原发性乳腺癌和许多ER阴性的乳腺癌细胞株MDA-MB-231、MDA-MB-435、MDA-MB-468、Hs578t 中,近50 %的ER启动子高甲基化。可见,DNA甲基化在乳腺癌的ER基因失活中起着十分重要的作用。一系列乳腺癌细胞株中DNA甲基转移酶1 (DNMT1) 的活性水平检测结果显示, ER阴性的乳腺癌细胞株和ER 阳性的比较， DNMT1的表达水平无论RNA 水平或是蛋白水平都显著升高。ER阴性的乳腺癌DNMT1在整个细胞周期都表达,ER阳性的细胞株则DNMT1多数出现于S 期。,2.PR 基因,PR 基因1号外显子上分布有CpG岛。该基因编码两种同源性的蛋白质hPRa和hPRb。二者的区别在于N-末端序列和生物活性。hPRb的转录需要ER激活,而hPRa不必。Southern印迹杂交及MS-PCR法分析PR表达阴性的原发性乳腺癌及乳腺癌细胞株,约40%的PR基因启动子甲基化。应用DNMT1抑制剂5-aza-Dc和雌激素作用于PR阴性的乳腺癌细胞株MSA-MB-231, PR基因启动子部分去甲基化且基因重新表达。,3. BRCA1基因 BRCA1 基因于1994年最早报道, 为具有遗传倾向的乳腺癌、卵巢癌的易感基因,在乳腺癌中最主要的改变形式为等位基因杂合型缺失和突变。目前的研究认为,在约50%的遗传性乳腺癌中，BRCA1基因的可遗传性突变是主要的分子机制。 散发性乳腺癌病例中,BRCA1基因突变罕见。DNA甲基化机制可以合理地解释散发性乳腺癌的BRCA1基因转录与翻译水平异常。应用Southern印迹和甲基化敏感特异单链构象分析法(MS-SSCA法)分析散发性乳腺癌中BRCA1基因启动子甲基化情况,1124.2%的病例的BRCA1基因启动子高度甲基化。在散发型乳腺癌中,甲基化改变是BRCA1基因失表达的重要机制之一。,4.上皮钙黏附蛋白( E-cadherin) 黏附分子的异常，使细胞和细胞间失去黏附作用，在肿瘤的转移和侵润中起关键作用。 E-cadherin是一种重要的钙依赖性的黏附分子, 该蛋白在上皮细胞之间起着黏附及维持组织结构完整性的作用。正常上皮中该蛋白在细胞边缘区呈强阳性表达,而在大多数肿瘤中表达异常。该蛋白的表达与肿瘤的浸润、转移呈负相关。,基因的突变、缺失可以解释部分E-cadherin失表达,但是在约50%的原发性乳腺癌和乳腺癌细胞株MDA-MB-435中未检测到基因的突变、缺失,应用MS-PCR法却发现E-cadherin基因5端CpG的高甲基化现象,表明E-cadherin基因启动子甲基化与该基因失活密切相关。乳腺原位导管癌中E-cadherin启动子30%甲基化,而转移病灶上升到60% ,提示E-cadherin基因的甲基化情况与肿瘤的恶性程度相关。研究显示口部鳞癌淋巴结转移细胞系的E-cadherin的低表达和甲基化有关。,5.P16INK4a/CDKN2A/MTS,DNA 甲基化在抑癌基因失活中起着重要的作用。P16INK4a 编码的蛋白是细胞周期依赖性激酶4 的抑制物(CDKI4) ,通过Rb蛋白的磷酸化/去磷酸化作用调节细胞G1 S 期的转化。该基因转录产物是P16INK4a与P19ARF 两种蛋白。P16INK4a失活存在于大多数肿瘤中,但是乳腺癌中纯合性缺失、点突变极低，分别为1.9%和1.0%。有20%30%的原发性乳腺癌及乳腺癌细胞株T47-D、HMECs、ZR75-1检测到5端启动子和1号外显子的甲基化情况。在40例浸润性导管癌占30%发生P16INK4a基因甲基化，与肿瘤分级、淋巴结转移有关。,6.候选抑癌基因脾酪氨酸激酶syk启动子甲基化与乳腺癌发生和转移的关系,在细胞的信号传导途径中,酪氨酸激酶起着很重要的作用。syk在造血细胞上广泛表达, 作为信号传导过程中一个影响因子而被广泛研究。B 细胞抗原受体(BcR)激活以后,依赖syk 的信号传导途径调节B 细胞的克隆表达, 分化和凋亡。磷脂酶C(PLC)-2 和磷脂酰肌醇3 激酶(PI3-K) 是syk 的关键靶位。B 细胞内PLC-2 syk的磷酸化导致ERK 和JNK激酶活性的下降,相反,通过syk 介导Akt 激活可致PI3-K磷酸化。国外研究认为syk,在T 细胞分化成熟过程中也起着很重要的作用采用。,syk 也可使微管的-微管蛋白亚基磷酸化,-微管蛋白亚基磷酸化有调节微管细胞骨架的功能,而微管细胞骨架是作为信号复合物装配的基础。RT-PCR和 MS-PCR检测了40例乳腺癌组织癌旁组织及15 例乳腺纤维瘤组织中syk基因 mRNA 的表达及syk基因启动子甲基化情况。syk mRNA 在乳腺正常组织中可检测到,而在乳腺癌组织中检测率很低,两组差异有显著意义,这表明syk mRNA 的表达缺失可能与乳腺癌的发生有关。同时，有淋巴结转移的乳腺癌组织的syk mRNA 的检出率显著低于无淋巴结转移组,这表明syk mRNA 的表达缺失可能与乳腺癌的转移有关。,研究发现，转染了野生型syk 的乳腺癌细胞株有抑制乳腺癌生长和转移的作用。Okamura 等认为Syk 基因的表达是p53 依赖性的。在肿瘤生成过程中，p53的功能丧失会导致syk 的活性下降,从而使肿瘤易于生成和转移。Carter 等认为syk 与HER2/ neu 是一对功能相反的抑癌/癌基因，HER2/ neu 的过度表达可诱导血管内皮细胞的收缩，从而使肿瘤细胞易于穿过血管屏障发生转移，而syk 可抑制HER2/ neu 的收缩血管内皮细胞作用，从而抑制肿瘤的转移。Mahabeleshwar 等研究认为，syk通过抑制磷脂酰肌醇3 (PI-3) 激酶的活性，从而抑制肿瘤细胞的分裂和核因子NF-B 调节的尿激酶型纤溶酶激活物(u-PA) 的激活分泌,而u-PA 的激活分泌与多种恶性肿瘤的发生、发展及转移相关。,7. 乳腺癌Nm23-H1 转移抑制基因,Nm23-H1基因的启动子有2个 CpG岛。DNA 甲基化抑制剂 5-Aza-CdR，使11个乳腺癌细胞系中5个细胞系的Nm23-H1 表达升高，其中3个有转移能力。 Nm23-H1表达升高的同时细胞系体外转移能力下降。,8. hDAB2IP （人DOC-2/DAB2 interactive protein ）,hDAB2IP 肿瘤抑制基因是 Ras GTPase活化家族的新成员。乳腺癌、前列腺癌中，hDAB2IP 甲基化率高，与表达负相关，甲基化状态在 hDAB2IP 基因失活中起关键作用。 5-aza-2-deoxycytidine处理 后，基因表达恢复。hDAB2IP 的启动子区分成m2a 和 m2b。 m2a区甲基化异常：25个乳腺癌细胞系中，有11个，占44%。39个原发乳腺癌中有15个，占 38%； m2b区甲基化异常：25个乳腺癌细胞系中，有12 个，占48%。39个原发乳腺癌中有13个，占 33%。 m2b区甲基化异常和乳腺癌淋巴结转移有关 。,9.其它基因的甲基化,14-3-3基因PHME1(human mammary epithelial 1) 、RAR2 基因(即视黄酸受体基因) 等许多关键的抑癌基因和生长因子调节基因的研究都肯定了DNA 甲基化异常是基因失活的重要机制。这些基因的表达蛋白产物涵盖了诸如DNA 修复、细胞周期调节、细胞生长调节、细胞间黏附等各环节。,Cyclin D2, RAR-, Twist, RASSF1A, HIN-1 在乳腺原发癌及其淋巴结(25例)、骨（12例）、脑（8例）、肺转移（10例）的配对标本中检测Cyclin D2, RAR-, Twist, RASSF1A, 和HIN-1 基因的高甲基化情况。与原发癌相比，转移癌均有甲基化率高的趋势，其中淋巴结转移癌HIN-1 的甲基化状况有显著差异，骨、脑、肺转移癌HIN-1 和 RAR-有显著差异。转移癌中，上述基因的低表达与其启动子区的高甲基化相关。甲基化率高的转移癌对甲基化抑制剂和组蛋白去已酰酶抑制剂治疗敏感。,RASSF1A, APC, DAP-kinaseRAS association domain family protein 1A (RASSF1A), adenomatous polyposis coli (APC), death-associated protein kinase (DAP-kinase) 在原发导管癌和小叶癌及不同阶段和等级的侵润癌中， RASSF1A, APC, DAP-kinase 的高甲基化34例标本中，32例有一个或多个基因高甲基化，占94%。 RASSF1A 高甲基化22例，占65%；APC 高甲基化15例，占47%；DAP-kinase 高甲基化17例，占50%。,Urokinase （uPA ） uPA 只在高转移癌(包括乳腺癌)中表达， uPA的高表达和其启动子低甲基化有关。S-Adenosyl-L-methionine (AdoMet) 抑制去甲基化且促进甲基化，使uPA甲基化，表达降低，显著抑制肿瘤转移。 5-azacytidine 抑制了AdoMet对uPA的作用。,四.DNA甲基化在乳腺癌诊断中的应用,DNA 甲基化在乳腺癌的诊疗中至少可在两方面得到应用。 作为临床诊断,病程监控的分子标志物。 逆转基因甲基化作为肿瘤治疗的新方向。目前,基因甲基化在乳腺癌诊断中应