秀丽线虫的研究和饲养ppt课件.ppt

秀丽隐杆线虫的饲养及研究用途 By王传杰 1 介绍 秀丽隐杆线虫 Caenorhabditiselegans 属于线形动物门 线虫纲 体形非常小 成虫只有1mm左右 线虫是细胞定数动物 两性成虫只有959个体细胞 雄性成虫只有1031个体细胞 其中131个细胞注定要接一定的发育程序陆续死亡 神经系统解剖结构十分简单 仅有302个细胞 约占整个动物体细胞总数的三分之一 它身体透明 能感知气味和味道 对光线 温度有反应 研究者很容易在显微镜下对其细胞和组织进行跟踪观察 2 饲养与冻存 设备试剂 大肠杆菌OP50 大肠杆菌OP50是尿嘧啶渗漏突变型 作为秀丽隐杆线虫的食物 NGM培养基 1000ml的NGM培养基内加有 3gNaCl 2 5g蛋白胨 17g琼脂 1mol LK2HPO4 KH2PO4缓冲液 pH 6 0 25ml 975ml蒸馏水 灭菌后加入分别抽滤除菌的1ml胆固醇溶液 5mg ml乙醇 1mol LMgSO41ml 1mol L的CaCl21ml 3 M9缓冲液 每升缓冲液中含15 12gNa2HPO4 12H2O 或6gNa2HPO4 3gKH2PO4 5gNaCl 0 25gMgSO4 7H2O 宜现用现配S缓冲液 0 1mol LNaCl 0 05mmol LK2HPO4 KH2PO4缓冲液 pH 6 0 4 喂养方法用冰M9缓冲液清洗虫体置4 环境20min1000r离心 弃上清 沉淀物用M9缓冲液重悬置4 环境20min弃上清取200ul沉淀物以靠接法接种到涂有大肠杆菌OP50的NGM培养基上将培养基放置到16 生化培养箱中 72h后可繁育至第二代 5 冻存准备1mlEP管 加入700ul30 甘油 s缓冲液溶解 用冰M9缓冲液清洗虫体置4 环境20min 1000r离心弃去上清将虫体转入事先准备好的EP管中 置于 80 冰箱冻存 可保存2个月 需要时取出室温解冻重置培养基 6 研究方法及用途 7 研究范围 细胞程序性死亡的遗传调控机制RNAi及其作用机制秀丽线虫的功能基因组学及其他研究低氧应答模式生物基因组学和功能蛋白组学的研究其他 MAPK信号传导 TGF b信号传递途径 衰老和年龄及脂肪代谢等 8 方法 线虫基因显微注射 显微注射技术是线虫研究领域的常用技术 对线虫进行转基因操作的一种高效且相对简单的方法 主要用于研究线虫突变种系的功能恢复 mutantrescue 特定基因的过表达或异位表达 标签蛋白的表达 特定蛋白质结构域的功能 DNA或RNA调节元件的分析及RNA干扰等 此外 这项转基因技术对于特异表型的筛选也是个强有力的工具 并且它还可用于将人工合成mRNAs或其他分子接引入细胞 9 设备 显微注射全套仪器琼脂糖固定垫添加了4 葡萄糖 glucose 的M9缓冲液 10 11 注射步骤 制剂及破针 固定虫 将纯化的DNA溶解在Tris EDTA TE 缓冲液中即可接用于注射 在注射液中加入终浓度约10mg L的线虫基因组DNA 则会有效地提高转基因效率 将一小玻片放在加了注射油的固定垫上 操纵微操使注射针与玻片边缘相撞 若针头尖端撞破 可观察到有液泡自动渗出 注射时将线虫挑至琼脂糖固定垫上 调整线虫使性腺暴露 滴加注射油覆盖整个虫体 固定好后的操作要迅速 否则线虫容易脱水而死 将琼脂糖固定垫放在载物台上 40 x物镜下找到线虫 使性腺聚焦在正确的平面 操作微操或轻移滑动载物台 将注射针尖刺入性腺 启动微量加压器进行注射 能观察到注射液在性腺中快速流动 注射后的性腺被液体充满 在体视显微镜下 滴加恢复缓冲液至注射后的线虫正上方 由于与油互不相溶 缓冲液会渗入油下使线虫浮起 一般等待2 5min 线虫活力恢复 身体开始游动 即可挑至培养板上 20 常规培养 注射 恢复 12 琼脂糖固定垫 取约50ul加热溶解的2 琼脂糖 agarose 溶液滴在长宽50mmx24mm 厚0 13 0 17mm的载玻片上 用另一载玻片轻压其上 待琼脂糖凝固后 约2min 将上面的玻片从侧面滑下即可 制作好的固定垫室温过夜或65 干燥1h后可叠放起来备用 13 恢复缓冲液 5 8gNa2HPO4 3 0gKH2PO4 0 5gNaCl 1 0gNH4Cl加水至1L 高压灭菌 用于注射后线虫的恢复 14 注射 15 子代目的基因表达检测 注射后约3天 观察孵出的F1代是否有目的DNA表达 目前 线虫外源基因表达的标记通常用 a 荧光蛋白与目的蛋白形成融合蛋白 但需要确定荧光蛋白的连接不影响目的蛋白的功能 b 目的基因与荧光标记基因共注射 c 目的基因与具有明显表型的标记基因共注射 我们通常使用易观察的pmyo 3 TDimerII作为荧光标记 它在所有体壁肌肉细胞表达 转基因效率高且本身对线虫的行为和功能没有影响 16 显微注射后的整合 目前常用的整合方法有 用y射线和X射线照射 或用光敏剂补骨脂素加长波紫外线照射整合 TMP UVintegration 基本策略是大量筛选经射线照射过的转基因线虫 一般挑取数百只F1代繁殖 筛选F4代 检测是否有100 的转基因表达 若是则说明整合成功 一般一次整合能得到若干个独立种系 可选择最好的一个进行实验 17 整合 TMP UV整合无需酌或X射线源 可在普通实验室进行 诱变剂TMP Trioxsalen或4 5忆 8 Trimethylpsoralen 三甲基补骨脂素 剧毒 避光 对其操作都需避光进行 TMP UV的处理可使线虫DNA发生随机断裂 从而使染色体外的DNA片段整合至染色体上 TMP UV整合法的流程为 a 用M9缓冲液将同步好的L4龄线虫从培养板中清洗下来 加TMP 溶于DMSO 现用现配 存于 80 使其终浓度为50mg L b 室温下轻柔振荡15min 将线虫转至未铺菌的9cm培养板上紫外线照射 照射能量为35000滋J cm2 换算成瞬时功率即350滋W cm2 100s c 照射完毕后 在培养板上加大肠杆菌OP50 室避光培养5h 使线虫活力恢复 d 挑取15 25只状态较好的P0代个体 每板1只 等待大肠杆菌被吃完 挑100 300只F2代 每板1只 观察F4代是否全部表达注射DNA 根据我们的经验 如果经紫外线照射后 后代出现很多具有短粗 致死表型的线虫 甚至1 4没有后代 则预示整合成功 整合成功的标准是F4代全部表达目的基因 若没有 一般没必继续筛选 可认为该克隆的整合不成功 18 细胞程序性死亡的遗传调控机制 现阶段研究已发现了十几个控制细胞凋亡的基因 这些凋亡基因之间通过遗传相互作用组成一条线性的调控途径控制细胞程序性死亡 包括凋亡的激活阶段 凋亡的起始 凋亡细胞的清除及凋亡细胞内部的DNA降解 19 线虫PCA关键阶段 EGL 1 促凋亡蛋白 属BCl 2蛋白家族 与哺乳动物BAD BIK NBK及HRK同源 CED 9 抗凋亡蛋白 与人体bcl 2同源 CED 4 促凋亡蛋白 同源体为Apaf 1 CED 3 凋亡蛋白 与ICE caspase家族 同源 20 低氧应答模式生物 低氧能够引起秀丽线虫发生相应的生理和行为学变化 并可保护机体免受缺氧损伤 秀丽线虫的低氧诱导因子 HIF 1 的恒定性调控通路和人类的相应通路之间具有高度保守性 因此秀丽线虫也已成为研究低氧应答调控通路进化保守性的重要工具之一 阐明秀丽线虫的低氧应答机制将为了解人类低氧相关疾病的发病机制提供有价值的线索 21 相关机制 22 miRNA作用机制的研究 首个时序调控的miRNA基因lin 4发现于线虫 转录后形成两种长度的RNA 较小的一个与基因lin 14的mRNA互补配对阻碍其翻译 随后又发现了类似作用的let 7 通过研究miRNA在线虫细胞内对于靶基因翻译表达的阻碍作用 为疾病治疗提供新手段 特别是探究其对RNA病毒侵染的抑制作用 23 其他方面 衰老和寿命控制机制DAF 16蛋白可以转运到细胞核中激活靶基因转录时线虫的寿命就可延长反之则缩短 药物筛选基于秀丽线虫与人在多种生命活动调控机制上的相似性可以用秀丽线虫为动