淀粉酶活力的测定

淀粉酶活力测定淀粉酶活力测定 一 实验目的一 实验目的 以所筛选出的芽孢杆菌为实验菌株 通过种子扩大培养 选出生长力旺盛的 菌株进行液体摇瓶发酵 通过测定不同发酵时间生产的酶活 来初步估计发酵 最佳时期和终点 通过本实验要掌握测定酶活的方法 二 实验原理二 实验原理 淀粉酶是能够分解淀粉糖苷键的一类酶的总称 包括 淀粉酶 淀粉 酶 糖化酶和异淀粉酶 芽孢杆菌主要用来产生 淀粉酶和异淀粉酶 其中 淀粉酶又称淀粉 1 4 糊精酶 能够切开淀粉链内部的 1 4 糖苷键 将 淀粉水解为麦芽糖 含有 6 个葡萄糖单位的寡糖和带有支链的寡糖与 DNS 试剂 共热呈阳性反应 产生红棕色 而异淀粉酶又称淀粉 1 6 葡萄糖苷酶 分 枝酶 此酶作用于支链淀粉分子分枝点处的 1 6 糖苷键 将支链淀粉的整 个侧链切下变成直链淀粉 通过发酵实验 我们可以以酶活为依据 初步估计 发酵的最佳时期和发酵终点 酶活力也称酶活性 是以酶在最适温度 最适 pH 等条件下 催化一定的化 学反应的初速度来表示 本实验是以一定量的淀粉酶液 于 37 C pH6 8 的条 件下 在一定的初始作用时间里将淀粉转化为还原糖 然后通过与 DNS 试剂作 用 比色测定 求得还原糖的生成量 从而计算出酶反应的初速度 即酶的活 力 这里规定 一个淀粉酶活力单位定义为在 37 C pH6 8 的条件下 每分钟 水解淀粉生成 1mg 还原糖所需的酶量 三 三 实验材料及设备实验材料及设备 1 筛选出来的产淀粉酶芽孢杆菌 2 菌种 从商丘师院土壤中分离出的产淀粉酶的芽孢杆菌 3 种子培养基 蛋白胨 1 酵母浸出物 0 5 氯化钠 1 pH 自然 4 发酵培养基 按正交试验所选的最佳方案来配置 5 仪器 控温摇床 高压蒸汽灭菌锅 电子天平 分光光度计 烧杯 玻璃棒 锥形瓶 离心机 刻度试管 25mL 4 容 量 瓶 100mL 1 烧 杯 250mL 1 滴 管 2 支 洗耳球 2 支 洗瓶 试管架 移液管架 移液管 玻 棒 各 1 支 四 四 试剂的配制试剂的配制 1 培养基的配制 按上述配方称量 溶解 灭菌 2 淀粉溶液 0 5 称取 5g 可溶性淀粉 溶于 1000mL 热水中 临用前配制 蔗糖溶液 1 3 3 5 二硝基水杨酸试剂 DNS 试剂 将 5 0g 3 5 二硝基水杨酸溶于 200mL 2N NaOH 溶液中 不适宜用高温促溶 接着加入 500mL 含 130g 酒石酸钾钠的溶液 混匀 再加入 5g 结晶酚和 5g 亚硫 酸钠 搅拌溶解后 定容至 1000mL 暗处保存备用 4 磷酸缓冲液 0 2mol L pH6 8 5 NaOH 溶液 6mol L 6 NaCl 溶液 0 3 五 五 操作步骤操作步骤 1 1 淀粉酶的制备淀粉酶的制备 1 菌的培养 菌种活化 将保存的菌种转接到斜面培养基 37 培养 24 h 备用 种子液的制备 取一环活化的菌种 接入装量为 50 mL 种子培养基的 250 mL 三 角瓶中 37 180 r min 培养 18 h 摇瓶培养 分别取 1 mL 种子液 接入盛有 50 mL 发酵培养基的 200 mL 三角瓶 中 接种量为 2 V V 置摇床中 30 振荡培养 24 h 转速为 160 r min 2 酶的提取 液体培养基在 3000r min 的离心机中离心 10min 取上清 2 2 淀粉酶活力的测定 淀粉酶活力的测定 取 25mL 刻度试管 4 支 按下表编号并操作 记录实验结果 管号 试剂 ml 1 2 3 4 pH6 8 缓冲 液 1 2 1 2 蔗糖溶液 1 1 淀粉溶液 1 1 淀粉酶液 1 1 酶促反应 摇匀 37 水浴 5min DNS 试剂 2 显色反应 沸水浴 5min 光密度 D540 六 六 结果处理结果处理 根据上表的实验结果 以蔗糖浓度为横坐标 光密度值为纵坐标绘制出标 准曲线 淀粉酶活性由下式求得 A 500 f m 100 100 h lgD1 lgD2 t1 t2 500 f b m 100 100 h 式中 A 淀粉酶活性 m 100mL氯化钙提取的