遗传病的诊断2

遗传病的诊断,重 点,遗传病特有的诊断方法？及其应用范围？染色体检查适应症基因诊断产前诊断,1. 产前诊断(prenatal diagnosis),2. 症状前诊断(presymptomatic diagnosis)3. 现症病人诊断(symptomatic diagnosis),遗传病的诊断 （diagnosis of genetic disease）,第一节 病史、症状和体征,1.症状和体征：遗传病有其它疾病相同的体征和症状，往往又有其本身特异性症候群，为诊断提供初步线索。 2.病史采集：遗传病多有家族聚集现象，所 以采集病史除一般病史外，应着重患者的家族史、婚姻史和生育史。,1. 系统、完整,第二节 系谱分析,2. 去伪存真,3. 新的基因突变,系谱分析可以有效地记录遗传病的家族史，确定遗传病的遗传方式，还能用于遗传咨询中个体患病风险的计算和基因定位中的连锁分析。,第二节 系谱分析,一、孟德尔式遗传病-单基因病,1. 基因多效性(AD)2. 遗传异质性(AR)3. 临床表型杂合子(XR),系谱分析可以有效地记录遗传病的家族史，确定遗传病的遗传方式，还能用于遗传咨询中个体患病风险的计算和基因定位中的连锁分析。,第二节 系谱分析,二、非孟德尔式遗传病,1. 线粒体遗传病2. 多基因病,系谱分析可以有效地记录遗传病的家族史，确定遗传病的遗传方式，还能用于遗传咨询中个体患病风险的计算和基因定位中的连锁分析。,一、孟德尔式遗传病,第二节 系谱分析,1. 遗传印记 2. 动态突变 3. 单亲二体 4. 性别 5.修饰基因,三、特殊遗传方式,系谱分析可以有效地记录遗传病的家族史，确定遗传病的遗传方式，还能用于遗传咨询中个体患病风险的计算和基因定位中的连锁分析。,二、非孟德尔式遗传病,一、孟德尔式遗传病,染色体检查： 染色体检查亦称核型分析（karyotype analysis）是确诊染色体病的主要方法。 一、染色体检查标本的来源： 主要取自患者的外周血和身体的各种组织；胎儿的绒毛、羊水中胎儿脱落细胞和脐血、受精卵卵裂细胞、皮肤等各种组织。,第三节 细胞遗传学检查,第三节 细胞遗传学检查,二、染色体检查 的适应症：,1. 智能发育不全、生长迟缓或伴有其它先天畸形者,2. 夫妇中有染色体异常，如平衡易位、嵌合体等3. 家族中已发现染色体异常或先天畸形个体4. 多发性流产的妇女及其丈夫5. 原发闭经和男女不育症者6. 34岁以上的高龄孕妇7. 有两性内外生殖器畸形者,三、方法：略四、临床诊断标准： 15个分裂相，其中有2个异同将增倍。不仅对染色体的情况作出正确诊断，还要了解患者异常染色体的来源，而且对生育第二胎提供咨询。,第三节 细胞遗传学检查,二、性染色质检查：优点是方法简单，主要用于疑为两性畸形或性染色体数目异常的疾病诊断或产前诊断，有一定价值，但确认仍需依靠 染色体检查。,1. X 性染色质检查,2. Y 性染色质检查,一、染色体检查 核型分析,预测性别：98%。（X连锁遗传病）,第三节 细胞遗传学检查,三、染色体荧光原位杂交(FISH)： 应用标记的特异性DNA探针与玻片上的细胞中期染色体或间期核的DNA进行FISH检测可完成非整倍体的检测。,二、性染色质检查,一、染色体检查 核型分析,第三节 细胞遗传学检查,第三节 细胞遗传学检查,第四节 皮肤纹理分析,一、正常皮肤纹理（一）指纹（二）掌纹（三）指摺纹和手掌摺纹（四）脚掌纹,二、染色体病患者皮肤纹理特征,基因突变引起的单基因病往往表现在酶和蛋白质的质和量的改变或缺如。因此，酶和蛋白质的定性定量分析是诊断单基因病或分子代谢病的主要方法。,1）对酶和蛋白质的检查蛋白质的检查：血液。异常的血红蛋白酶的检查：肝、肾、皮肤、甲状腺、肠粘膜。,A B C,酶,第五节 生物化学检查,苯丙酮尿症（PKU)（AR),病因：肝中苯丙氨酸羟化酶缺乏（PAH) , PAH基因12q24 13个外显子,苯乙酸,苯乙酰谷氨酰氨,L-谷氨酸脱羧酶,r氨基丁酸减少,抑制,5-羟色氨脱羧酶,5-羟色氨减少,抑制,影响大脑的发育,2）代谢产物检查,分子代谢病可以从三个层次检测和分析,1酶和蛋白质的分析：基因突变引起的单基因病主要是特定的酶和蛋白质的质和量改变的结果。 2代谢产物的检测：酶缺陷导致一系列生化代谢紊乱，从而使代谢中间产物、底物、终产物旁路代谢产物发生变化。因此，检测某些代谢产物的质和量的改变。可间接反映酶的变化而作出诊断。 3基因分析 ：基因诊断（gene diagnosis）是利用DNA分析技术直接从基因水平（DNA或RNA）检测遗传的基因缺陷。,上海：19811987年对284,396名新生儿进行PKU筛查，查出PKU患儿15名，高苯丙氨酸血症4名。,第五节 生物化学检查,第六节 基因诊断,和传统的诊断方法主要差异在于直接从基因型推断表型，即可以越过产物（酶和蛋白质）直接检测基因结构而作出诊断，这样就改变了传统的表型诊断方式，故基因诊断又称为逆向诊断（reverse diagnosis）。 这一诊断方法不仅可对患者，还可以在发病前作出症状前基因诊断，也可对有遗传病风险的胎儿作出生前基因诊断。此外基因诊断不受基因表达的时空限制，也不受取材的细胞类型和发病年龄的限制。这一技术还可以从基因水平了解遗传病异质性，有效地检出携带者。因此近年来这一技术日新月异地迅速发展，并已经在遗传病诊断中发挥了巨大作用。,第六节 基因诊断,1978年，Kan YW 镰状细胞贫血,症状前诊断 外周静脉血,产 前 诊 断 孕早期的绒毛细胞,孕中期的羊水胎儿脱落细胞,母亲外周血中的胎儿有核红细胞,植入前诊断 受精卵卵裂细胞,定义： 应用分子生物学方法检测患者体内遗传物质的结构和功能变化而作出的或辅助临床诊断的技术，称为基因诊断。,思路：用一段已知基因的核酸序列作出探针，与变性后的单链基因组DNA接触时，如果两者的碱基完全配对，它们即互补地结合成双链，从而表明被测基因组DNA中含有已知的基因序列。,基因诊断的原理,核酸分子杂交是基因诊断的最基本的方法之一。 基本原理是：互补的DNA单链能够在一定条件下结合成双链，即能够进行杂交。 这种结合是特异的，即严格按照碱基互补的原则进行，它不仅能在DNA和DNA之间进行，也能在DNA和RNA之间进行。,进行基因检测有两个必要条件：一、是必需的特异的DNA探针；二、是必需的基因组DNA。 当两者都变性呈单链状态时，就能进行分子杂交。,基因探针的定义：,基因探针（probe）就是一段与目的基因或DNA互补的特异核苷酸序列。它可以包括整个基因，也可以仅仅是基因的一部分；可以是DNA本身，也可以是由之转录而来的RNA。,1、来自基因组中有关的基因本身，称为基因组探针（genomic probe）。2、是从相应的基因转录获得了mRNA，再通过逆转录得到的探针，称为cDNA 探针（cDNA probe）。与基因组探针不同的是，cDNA探针不含有内含子序列。3、可在体外人工合成碱基数不多的与基因序列互补的DNA片段，称为寡核苷酸探针。长约20个bp左右。,探针的来源：,探针的标记：放射性同位素标记（32P、35S）、地辛高、辣根过氧化物酶、生物素。 方法：缺口平移、六核苷酸引物标记法。,基因探针的标记：,一、分子杂交,1. Southern印迹杂交,第六节 基因诊断,一、分子杂交,1. Southern印迹杂交,第六节 基因诊断,2. ASO杂交,1、Southern 杂交法,细胞,Southern印迹杂交,一、分子杂交,1. Southern印迹杂交,第六节 基因诊断,2. ASO杂交,二、聚合酶链式反应,聚合酶链反应：（polymerase chain reaction,PCR）原理：1）引物的设计：合成2个与目的DNA序列两侧 互补的寡核苷酸，一般长约15-25bp。 2）基本条件：引物、DNA前提物质、含有一 定离子（Mg）的反应体系 、DNA聚合酶、 模板。 3）三段循环：变性：93-95；复性：50-70 延伸：70-75。n个周期，2n个DNA,聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）,PCR原理,PCR原理,变性,PCR原理,复性,PCR原理,延伸,PCR原理,变性,PCR原理,复性,PCR原理,延伸,PCR原理,变性,PCR原理,复性,PCR原理,延伸,预变性(93-95C,2-5m),变性(93-95C,30s),复性(50-70C,30s),延伸(75C,30-60s),总延伸(75C,7m),(25-35),PCR的一般过程：,经过30次的循环, 扩增的DNA片段可达100万倍以上。,直接分析法,Mst： CCTNAGG,镰状细胞贫血(HbS)： 第57位密码子,A： CCTGAGGAGS： CCTGTGGAG,RFLP连锁分析,Back,ASO斑点杂交,1986年，胡流清等基于点突变原理，用寡核苷酸探针进行基因诊断。,Back,基因诊断的临床检测应用,基因诊断在肿瘤检测中的应用：在许多肿瘤中存在的：癌基因 ras、myc等的突变；抗癌基因P53、Rb等的突变、丢失的检出。 基因诊断在个体识别中的应用：亲子鉴定、个体识别、法医物证。,产前诊断（prenatal or antenatal diagnosis）又称宫内诊断（intrauterine diagnosis）是对胚胎或胎儿在出生前是否患有某种遗传病或先天畸形作了准确的诊断。产前诊断的适应症的选择原则一、是有高风险而危害较大的遗传病二、是目前已有对该病进行产前诊断的手段。,第七节 产前诊断,第七节 产前诊断,产前诊断的适应症:1、染色体病：夫妇之一有染色体异常、生育过染色体病的 患儿夫妇之一为平衡易位携带者、脆性X家 系的孕妇。2、单基因病：特定酶缺陷所致的遗传性代谢病。3、多基因病：NTD4、不明原因的自然流产史、畸胎史、死产、新生儿死亡、羊水过多；35岁以上孕妇、有明显制畸史的孕妇。5、有明显形态改变的先天畸形。,几种主要产前诊断方法,1、超声波检查：是一项简便对母体无痛无损伤的产前诊断方法。B型超声波应用最广，利用超声波能作出的产前诊断或排除性诊断。此外还可直接对胎心和胎动进行动态观察，并可摄象记录分析，亦可作胎盘定位，选择羊膜穿刺部位，可引导胎儿镜操作，采集绒毛和脐带血标本供实验室检查。 范围：多胎妊娠、羊水过多、NTD、脑积水、多囊肾、肢体短小；18周测性别：XR男性选择性流产。,第七节 产前诊断,2、X线检查 ：主要用于检查24周以后胎儿骨骼先天畸形。但因X线对胎儿有一定影响，现已极少使用。,3、胎儿镜 （fetoscope） ：又称羊膜腔镜或宫腔镜，是一种带有羊膜穿刺的双套管光导纤维内窥镜。能直接观察胎儿，可于怀孕1521周进行操作。由于B超的应用，此方法易引起流产、母体免疫反应，已少用。 范围： 各种类型的地中海贫血、DMD,4、羊膜穿刺 ：（amniocentesis）亦称羊水取样。最佳时间：是妊娠1618周。范围：经体外培养后，可进行染色体分析、酶和蛋白质检测、性染色质检查、提取DNA作基因分析，也可不经培养，用微量技术作酶和蛋白质分析或直接提取DNA作基因诊断。,第七节 产前诊断,方法：B超、腰穿针穿刺、穿过腹壁和子宫壁进 入羊膜腔。 20-30ml。,应用：1、生活的脱落细胞。- 染色体分析、酶和蛋白质检 测、性染色质检查、提取DNA作基因分析 2、羊水：AFP、乙酰胆碱脂酶。,1 2 3 4 CHE ACHE1、2正常3、4患者,5绒毛吸取：绒毛取样（chorionic villi aspiration sampling,cvs）方法：绒毛可经宫颈部取样，最好在B超监视下进行。绒毛枝经处理（与蜕膜严格分