生物药物分析与检验酶分析法

酶 分 析 法,教学目的和要求,熟悉： 1酶活力的测定方法 2酶法分析的测定方法了解：酶分析法的原理,概 述,1.酶的概念是生物体内产生并具有催化活性的一类蛋白质，由于表现出特异的催化功能，因此酶被称为生物催化剂。2.酶的应用：在体外进行催化反应用以制造某些产品用以去除某些物质用以识别某种化合物 属于“酶分析法”用以测定某种物质,酶是由活细胞产生的具有催化作用的特殊物质，又称生物催化剂。除极个别RNA为催化自身反应的酶外，其余所有的酶都是蛋白质。生物体内一切生化反应都需要酶的催化才能进行！性能远远超过人造催化剂。产物（product，P）底物（substrate，S ）,酶 的 概 念,酶是特殊的催化剂 (1) 生物大分子 (2) 催化条件温和 (3) 强酸、碱或高温下失活 (3) 高选择性 (4) 高催化效率机理：降低反应活化能，提高反应速度，不改 变平衡点。只起催化作用，本身不消耗。,酶 的 特 点 概 括 如 下 ：,概 述,3.酶分析法包括两种类型：一是以酶作为分析对象，这类分析方法称为“酶活力测定”。二是以酶作为分析手段，用以测定样品中用一般化学方法难于检测的物质，通常将这类分析方法称为“酶法分析”；,4.两类酶分析法的区别,相同：从原理到方法不同： 酶活力测定法中，是以酶为分析对象。使用的底物应该过量。酶法分析中，是以酶为分析工具或分析试剂,被检化合物（如：底物）是反应的限制因素,酶法分析的优点,1 用于复杂组分中结构或物理化学性质比较相近的同类物质的分离鉴定和分析。2 特异性强、干扰少、操作简单、样品和试剂用量少，测定快速精确，灵敏度高等特点。3 通过了解酶对底物的特异性，可以预料可能发生的干扰反应并设法纠正。4 可用偶联反应。5 无污染或污染很少的分析方法。,共同点：原理和方法相同，以酶的专一高效催化某化学反应为基础，通过测定酶反应的速率或生成物浓度来检测相应物质的含量。,第一节 酶活力测定法,一、基本概念 二、酶促反应的条件 三、酶活力的测定方法 四、测定过程中应注意的问题,一、基本概念,1.酶活力：指酶催化一定化学反应的能力。2.酶活力的测定：是测定一个被酶所催化的化学反应的速度。3.酶活力测定的目的：通过酶反应速度的测定，求得酶的浓度或含量,酶活力(enzyme activity)的测定,酶活力是指酶催化某一化学反应的能力，酶活力的大小可以用在一定条件下所催化的某一化学反应的反应速率来表示，酶催化的反应速率愈大，酶的活力愈高；反应速率愈小，酶的活力就愈低。两者呈线性关系。所以测定酶的活力就是测定酶促反应的速率。,酶催化的反应速率可用单位时间内底物的减少量或产物的增加量来表示。在实际酶活测定中一般以测定产物的增加量为准。V = p / t p = v t,引起酶促反应速率降低的原因,(1)底物浓度的降低；(2)产物浓度增加加速了逆反应的进行；(3)产物对酶的抑制或激活作用(4)随着时间的延长引起酶本身部分分子失活等。因此测定酶活力，应测定酶促反应的初速率，反应初速率与酶量呈线性关系，因此可以用初速率来测定制剂中酶的含量。,检验酶反应和测定系统是否适宜的标准,测得的反应速度必须和酶浓度间有线性的比例关系,一、基本概念,4.酶反应的速度：用单位时间内反应底物的减少或产物的增加来表示，酶反应的速度愈快所表示的酶活力愈高。5.测定酶活力的方法：可用物理法、化学法或酶分析法等方法。,一、基本概念,6.常用的酶分析法第一，终点法第二，取样测定法第三，连续测定法,一、基本概念,7.酶的活性单位（国际单位U）：在25及最适条件下，每分钟能转化一个微摩尔(mol)底物的酶量定为一个活性单位。8.酶的比活性：为一毫克(mg)酶的活性单位数目。,国际酶活力单位,1961年,国际生物化学协会酶学委员会提出采用统一的“国际单位”(U)来表示酶活力，规定为：在最适反应条件(温度25)下，每分钟内催化1微摩尔(umo1)底物转化为产物所需的酶量,定为一个酶活力单位，即 1 U = 1 umolmin。,酶的比活力(specific activity),比活力:每mg蛋白质所含的酶活力单位数表示，比活力=活力Umg蛋白=总活力U/总蛋白mg有时用每g酶制剂或每m1酶制剂含有多少个活力单位来表示(Ug或Uml)。比活力大小的含义：可用来比较每单位质量蛋白质的催化能力。比活力愈大，表示酶的纯度愈高。,活力单位(U)与比活力,U速度单位每小时催化1克底物每小时催化1ml某浓度溶液每分钟催化1ug底物酶产品质量评价中常使用比活力单位质量酶产品中酶活力称比活力。 u/mg酶蛋白 u/ml酶蛋白国际单位（IU）：在实验规定的条件下（25，最适pH、最适底物浓度时），1ul标本，以每分钟能催化1微摩尔底物的酶量为1个国际单位。,酶促反应速度的测定方法,产物浓度变化曲线,提问：为什么反应速度会随时间减小？,答案：1.S降低； 2.酶受到产物抑制,提问：用哪一个速度来表示该酶促反应的速度特征呢？,反应初速度 Vo,反应初速度表示酶活力。,提问：仅用反应初速度大小对比酶活力行吗？,答案：不行，还与酶的加入量及条件有关。,酶活力测定实例,首先 确定反应条件 20、pH=7，底物浓度 6g/l（过量），加入2mg固体脂肪酶第二 确定活力单位 如每小时催化1克底物 1u= 1g/h第三 测算反应初速度 作产物甘油随时间增加的曲线，量出反应初速度值 ，换算为脂肪的消耗速度 如 8g/h第四 换算活力 8g/h / 1g/h=8u第五 计算比活 8u/2mg酶蛋白=4u/mg酶蛋白,二、酶促反应的条件,基本要求：反应系统中除了待测酶的浓度是影响速度的惟一因素外，其他因素都处于最适于酶发挥催化作用的水平。,确定反应条件时应考虑：,（1）底物 选用的底物在物理化学性质上和产物不同。 一般选用底物的浓度S=100 Km 一般选择Km小的作测定的底物。,（2）pH值 注意选择适宜的反应pH值，并将反应维持在这一pH值。例：丙酮酸 乳酸,乳酸脱氢酶,pH对酶反应的影响,pH影响酶活力的原因,(1) 过酸或过碱可以使酶的空间结构破坏，引起酶构象的改变，酶活性丧失。(2) 当pH改变不很剧烈时，酶虽未变性，但活力受到影响。影响了底物的解离状态；影响酶分子活性部位上有关基团的解离；影响到中间络合物ES的解离状态，不利于催化生成产物。,二、酶促反应的条件,（3）温度 实验中温度变动应控制在0.1以内。酶反应的温度通常选用25、30、37。 （4）辅助因子 为了提高酶在反应系统中的稳定性，有些也需要某些相应的物质。,最适温度,机理：温度导致酶蛋白变性,温度对酶反应的影响,温度对酶反应的影响,在最适温度之前，一般温度越高，反应速度就越快。酶的固体状态比在溶液中对温度的耐受力要高。通常酶制剂以固体保存为佳。,（5）空白和对照 空白 指杂质反应和自发反应引起的变化量，提供未知因素的影响 对照作为比较或标定的标准。,三、酶活力的测定方法,按取样及检测的方式（一）取样测定法（二）连续测定法,（一）取样测定法,1.取样测定法：求得单位时间内酶促反应变化量的方法。 2.常用的检测方法：紫外-可见分光光度法、荧光分析法等。,取样测定法,在酶反应开始后不同的时间，从反应系统中取出一定量的反应液，并用适当的方法（添加酶的变性剂或使酶失活）停止其反应后，再根据产物和底物在化学性质上的差别，选用适当的检测方法进行定量分析，求得单位时间内酶促反应变化量的方法。,取样测定法,取样测定法一直沿袭至今是因为：不需要特殊仪器几乎所有酶反应都可根据产物或底物的化学性质找出具体的测定方法由于色源底物和荧光源底物的发展，可在原来的底物分子上接上相应的有色基团、发色基团或荧光基团。,3、终止酶反应：添加酶的变性剂三氯醋酸：紫外光区有吸收高氯酸：对酸和氧化剂敏感的对象不适用,4、特点：不需要特殊仪器容易找到具体测定方法色源底物和荧光源底物发展快,（二）连续测定法,1.连续测定法：基于底物和产物在物理化学性质上的不同，在反应过程中对反应系统进行直接连续检测的方法。2.常用的检测方法,连续测定法,基于底物和产物在物理化学性质上的不同，在反应过程中对反应系统进行连续检测的方法。 连续测定法的准确性和测定效率比较好,酶活不能反映酶的使用效果 只能用于产品质量的控制,测定过程中应注意的问题,产物的测定反应速度的测定测定要达到的要求,酶分析法的检测方法,最常用的方法介绍如下：(1) 紫外-可见分光光度法(2) 荧光分析法(3) 旋光度法(4) 酶偶联测定法(5) 其他检测法,酶分析法的检测方法,一、紫外-可见分光光度法,NAD+ (烟酰胺-腺嘌呤二核苷酸，又称为辅酶I) 和NADP+(烟酰胺-腺嘌呤磷酸二核苷酸,又称为辅酶II )是维生素烟酰胺的衍生物，,还原,氧化,NAD+,NADH,在338.5nm与340.5nm之间有一个最大吸收峰,300-400nm无吸收,丙酮酸+NADH+H+,LDH,乳酸+NAD+,例 1、,例 2、,天冬氨酸+a-草酰酮戊二酸,谷氨酸+草酰乙酸,GOT,草酰乙酸+NADH+H,苹果酸+NAD+,MDH,酶偶联测定法：是应用过量、高度专一的“偶联工具酶”使被测酶反应能连续进行到某一可直接、连续、简便、准确测定阶段的方法。,被测反应,偶联指示反应,被测反应,肌激酶,辅助反应,丙酮酸激酶,指示反应,乳酸脱氢酶,二、荧光分析法,三 华勃氏呼吸仪检压法,四、放射性同位素测定法,华勃氏微量呼吸仪（瓦氏呼吸仪）,五 电化学法（electrochemical）,pH测定法：用高灵敏度的pH计，跟踪反应过程中H+变化的情况，用pH的变化来测定酶的反应速率。离子选择电极法：测定某些酶的酶活力，用氧电极可以测定一些耗氧的酶反应，如葡糖氧化酶的活力就可用这个方法很方便地测定。,第二节 酶法分析,一、终点测定法 二、反应速度法,一、原理,是在以待测物质为底物的酶反应中，如果能使底物能够接近完全地转化为产物，而且底物或产物又具有某种特征性质，通过直接测定转化前后底物的减少量，产物的增加量或辅酶的变化就可以定量待测物平衡法,用于复杂组分中结构或物理化学性质比较 相近的同类物质的分离鉴定和分析。特异性强、干扰少、操作简单、样品和试 剂用量少，测定快速精确，灵敏度高等特 点。通过了解酶对底物的特异性，可以预料可能 发生的干扰反应并设法纠正。可用偶联反应。无污染或污染很少的分析方法。,优 点 ：,一、终点测定法,1.原理：先借助酶反应（单独的反应或几种酶构成的偶数酶反应）使被测物质定量地进行转变，然后在转化完成后，测定底物、产物或辅酶物质（第二底物）等的变化量。2.一般采用的测定方法：光吸收、荧光之类的分光光度法测定气体产生与吸收的测压量气法（华勃氏呼吸仪检压法）检知pH值变化的滴定法同位素跟踪测定法,（一）终点法条件,1酶的底物特异性（专一性）：具有高度的底物专一性，有一些酶是呈族特异性； 2反应的平衡 ：酶反应若平衡十分偏向进行方向，则可方便地用终点测定法检测；但若反应的平衡并不十分偏向进行方向，或者偏向逆方向，此时由于反应不能完全，因而反应就不能正确定量，解决这一问题，通常可采取一些措施。,反应的平衡,谷氨酸+NAD+H2O,a-酮戊二酸+NADH+NH+,谷氨酸脱氢酶,NADH+丙酮酸,乳酸+ NAD+,乳酸脱氢酶,3反应液中的酶量 ：要使酶反应在短时间内完成，只有使用对底物亲和性很大的酶（即Km要小），酶用量（即Vmax）必须大才能达到此点。工作中，在10min内反应完成99%，则常数K以1.0min-1为宜。 4反应产物抑制：如果产物对反应本身有抑制作用，则会妨碍反应进行，在这种情况下可将该产物除去或者和再生系统偶联等办法解决。,反应产物抑制,S+ATP,P+ADP,丙酮酸,丙酮酸激酶,磷酸烯醇式丙酮酸,S激酶,（二）终点法种类,1单酶反应定量法：（1）底物减少量的测定：在以待测物质为底物的酶反应中，如果底物能接近完全地转化为产物，且又具有某种特征性质（例如特征的吸收谱带）时，则就可能简便地通过直接测定底物的减少量，而定量待测物。,（二）终点法种类,（2）产物增加量的测定：在以被测物为底物的酶的反应中，如果底物基本上都能转变为产物，而产物又具有可以专一地进行定量测定的性质，那么根据产物增加就能检知底物的量。（3）辅酶变化量的测定：以NAD或NADP为辅酶的脱氢酶反应，通过测定340nm吸收度的变化，就能对作为相应脱氢酶底物的物质进行定量分析。,1. 羟基丙酮酸的定量测定,羟基丙酮酸+NADH+H,D甘油酸,+NAD+,L-谷氨酸+NAD+H2O,甘油酸脱氢酶,2. L-谷氨酸的定量测定,a-酮戊二酸+NADH+NH4+,谷氨酸脱氢酶,2和指示酶反应偶联的定量法（1）以脱氢酶为指示剂：用来作为偶联指示剂的酶中应用得最广泛的是以NAD或NADP为辅酶的脱氢酶类 （2）以脱氢酶以外的酶作指示剂：参与某些色素氧化还原的酶中有的可用作指示剂，反应的进行可由吸收度的变化来测定。,2、和指示酶反应偶联的定量法,以脱氢酶为指示剂,1-磷酸-葡萄糖,6-磷酸-葡萄糖,磷酸葡萄糖变位酶,1，6-二磷酸葡萄糖,6-磷酸-葡萄糖+NADP,6-磷酸-葡萄糖醛酸+NADPH+H+,6-磷酸-葡萄糖脱氢酶,D-2-磷酸甘油酸,磷酸烯醇丙酮酸,烯醇化酶,磷酸烯醇丙酮酸+ADP,丙酮酸激酶,丙酮酸+ATP,丙酮酸+NADH+H+,乳酸脱氢酶,乳酸+NAD+,以脱氢酶以外的酶为指示剂,D-葡萄糖的定量测定,葡萄糖,葡萄糖醛酸+H2O2,H2O2 +4-氨基安替比林酚,醌亚胶色素+4H2O,葡萄糖氧化酶,过氧化物酶,二、反应速度法,反应速度法是在一定条件下（一定pH值和温度），测定反应的初速度，而反应的初速度与被测物质的浓度成正比关系，因此可根据初速度计算被测物质的量，也可利用标准品对照法计算被测物质的量。,特 点 ：,测定速度快,试剂用量少,成本低,对浊度和色素的干扰不敏感,不需要考虑反应是否进行完全,具体测定