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液相色谱 质谱联用的原理及应用 中心实验室 样品的预处理常用方法 a 超滤b 溶剂萃取 去盐c 固相萃取d 灌注 Perfusion 净化 去盐e 色谱分离反相色谱分离亲和技术分离f 甲醇或乙腈沉淀蛋白g 酸水解 酶解h 衍生化 化合物鉴别 全扫描方式 Q1扫描 全扫描数据采集可以得到化合物的准分子离子 从而可判断出化合物的分子量 用于鉴别是否有未知物 并确认一些判断不清的化合物 如合成化合物的质量及结构 子离子分析 MS MS 子离子 用于结构判断 得到化合物的二级谱图即碎片离子 和选择离子对作多种反应监测 MRM 子离子谱图与锥体电压断裂谱图 源内CID 可能十分相似 所不同的是子离子质谱图已知只有一种质量通过MS1 因此也已知所有碎片离子都是由我们所选定的母离子所产生的 所以我们更相信由MS MS产生的谱图的纯度 用大气压电离质谱仪可以得到分子量信息 正离子方式常出现如下离子 Na22Da higherthanM H K38Da higherthanM H Li6Da higherthanM H NH417Da higherthanM H ACN40Da higherthanM H2M H 2M Na等负离子方式常出现如下离子 TFA114Da higherthenM H 113and227background Acetate60Da higherthenM H Formic46Da higherthenM H Cl36Da higherthanM H 影响分子量测定的因素 1 pH的影响 正离子方式pH要低些 负离子方式pH要高些 除对离子化有影响外 还影响LC的峰形 2 气流和温度 当水含量高及流量大时要相应增加 3 溶剂和缓冲液流量 流速适当高可以提高出峰的灵敏度 4 溶剂和缓冲液的类型 通常正离子用甲醇好 负离子乙腈好些5 选择合适的液相色谱类型 正相 反相 选择合适的色谱柱6 合适的电压 DP电压高时 样品在源内分解或碎裂 高DP电压时回使多电荷离子比例低 多聚体也减少7 样品结构和性质8 杂质的影响 溶剂的纯度 水的纯净程度等 当成分复杂 杂质太多时 竞争使被测物离子化不好 同时使LC分离不好9 样品浓度不够 有时需要浓缩 分子量测定中的误判 溶剂中的杂质来自于塑料添加剂的峰样品容器不干净 常见表面活性剂的峰进样系统污染样品在源内碎裂 形成碎片离子 LC MS中常见的本底离子 m z50 150 溶剂离子 H2O nH n 3 112 m z102 H 乙腈 乙酸 C4H7NO2H 102 0549m z149 管路中邻苯二甲酸酯的酸酐 C8H4O3H 149 0233m z288 2mm离心管的产生的特征离子m z279 管路中邻苯二甲酸二丁酯C16H22O4H 279 1591m z316 2mm离心管的产生的特征离子m z384 瓶的光稳定剂产生的离子m z391 管路中邻苯二甲酸二辛酯 C24H38O4H 391 2843m z413 邻苯二甲酸二辛酯 钠 C24H38O4Na 413 2668m z538 乙酸 氧 铁 喷雾管 Fe3O O2CCH3 6 537 8793 分子量测定失败的原因 a 流动相不合适b 不挥发性盐的影响c 成分复杂 杂质太多d 样品浓度不够e pH值不合适f 样品在源内分解或碎裂 目标化合物分析 1 选择离子监测 SIM SIM用于检测已知或目标化合物 比全扫描方式能得到更高的灵敏度 这种数据采集的方式一般用在定量目标化合物之前 而且往往需要已知化合物的性质 若几种目标化合物用同样的数据采集方式监测 那么可以同时测定几种离子 目标化合物分析 1 选择离子监测 SIM SIM用于检测已知或目标化合物 比全扫描方式能得到更高的灵敏度 这种数据采集的方式一般用在定量目标化合物之前 而且往往需要已知化合物的性质 若几种目标化合物用同样的数据采集方式监测 那么可以同时测定几种离子 3 母离子扫描 母离子分析可用来鉴定和确认类型已知的化合物 尽管它们的母离子的质量可以不同 但在分裂过程中会生成共同的子离子 这种扫描功能在药物代谢研究中十分重要 4 中性丢失扫描 中性丢失扫描分析可用来鉴定和确认类型已知的化合物 例如新生儿遗传疾病筛查中某些检测项目 也可以帮助进行未知物结构判断 例如有中性丢失18Da的意味着 H2O 28 CO 30 HCOH 32 CH3OH 44 CO2等等 各种扫描方式的原理解释 Q1FullScan Start Stop Q1全扫描 Q1alwaysusedassingleMSanalyzerUsedprimarilyforident ofprecursorion SIM SelectedIonMonitoring 选择离子监测 UsedtooptimizeanalyzerforspecificionsSIMusedforquantitativeanalysesQ1SIMusedto optimize precursorionMaximizesignalinpreparationforMS MS ProductIonScan 子离子扫描 Afteridentification theprecursorionissentintothecollisioncellandfragmentedbyCIDQ1isfixed Q3sweepsagivenmassrangeUsedforstructuralelucidationFirststeptodevelopingquantitativemethod m3 scanned m1 fixed ExampleofProductIonSpectrum Ephedrine MW 165 PrecursorIonScan 母离子扫描 Q1sweepsagivenmassrange Q3isfixedUsedtodeterminethe origin ofparticularproduction s createdinthecollisioncellFrequentlyusedfordrugmetaboliteidentification commonproductionobservedinthemetabolites m3 fixed m1 scanned ExampleofPrecursorIonSpectrum Fragmentation WhenanIonfragmentsthefollowingformulasapply Positivemode Parent A BNeutralNegativemode Parent A BNeutral NeutralLossScan 中性丢失扫描 Q1 Q3bothscanagivenmassrangebutwithaconstantdifferencebetweenrangesscannedSpectrumindicateswhichionsloseaneutralspeciesequaltoQ1 Q3differenceComplementtoPrecursorIonScanNeutral gain indicatesamultiplychargedprecursorionwasfragmented m1 scanned m3 scanned MultipleReactionMonitoring MRM Manyprecursortoproductionpairscanbemonitored A B A B etc MRMisthebestwaytomaximizesignalintensityofproductionsMRMusedprimarilyforquantitation WhyLC MS MSforQuantitation RetentionTime RetentionTime Intensity Intensity IncreasedSensitivity Specificity 仪器介绍 4000QTRAPTM四极杆 四极杆 线性离子阱串联质谱仪是美国应用生物系统公司最新推出的 具有革新性设计的液相色谱 串联质谱仪 它把四极杆 线性离子阱质谱技术首次结合在一起 既保留了串联四极杆质谱仪的优点如母离子扫描 PS 中性丢失扫描 NL MRM定量功能 又克服了传统3D离子阱质谱仪的缺点如低质量截止点 1 3效应 空间电荷效应 碰撞效率低 定量性能差等 它是一台集优异定性功能与定量功能于一体的质谱仪 广泛应用于蛋白质 组 研究 药物开发 药物代谢 有机化学 环境分析 毒物分析 食品检验 商品检测 卫生防疫 烟草品质改良等众多领域 线性离子阱 超大的离子容量 消除了传统离子阱的 空间电荷效应 多电荷增强扫描功能 有效消除单电荷离子的干扰 只检测多电荷离子 更适合检测微量的肽或蛋白质 MS3功能 MS3功能和串联四极杆碰撞方式 只需进行最少的实验却提供最充分的结构信息 动态线性范围宽保留3Q质谱仪的优异MRM定量性能 能够检测复杂基质中的微量杂质 QTRAP实现MSn功能 以利血平为例 第一步做母离子609的MS2谱 由于碰撞能量较高 既有一次碰撞碎片又有多次碰撞碎片 且无1 3质量CUTOFF现象 故从低质量端到高质量端产生碎片很多 每个碎片均可做MS MS MS 从中确证下一级的碎片归属 进而推断分子结构 例如M Z236和M Z195是由M Z448产生 M Z365和M Z174是由M Z397产生 M Z365 M Z236和M Z195还可继续打碎 RESERPINE MS MS RESERPINE MS MS MS 448 RESERPINE MS MS MS 397 RESERPINE MS MS MS 365 RESERPINE MS MS MS 195 LC MS技术的应用 以大气压电离为接口的LC MS技术已经在药物 化工 临床医学 分子生物学等许多领域中获得广泛的应用 具体应用领域 医药学 药物代谢 药物动力学 杂质分析 天然产物分析生物化学 肽 蛋白质 寡核苷酸 糖环境化学 农药和农残分析 有机污染物 土壤 食品 水分析临床医学 新生儿检查 糖化血红蛋白 糖尿病 血红蛋白变异 胆酸食品科学 香料 添加物 包装物 蛋白质 致癌物法医学 滥用药物 爆炸物 兴奋剂检测兽医学 兴奋剂 磺胺类药物 抗体合成化学 有机金属化合物 有机合成物有机化学 表面活性剂 染料 药物代谢研究 药物代谢与药物动力学研究技术上的最新重大进展是LC MS MS的使用 电喷雾 ESI 和大气压化学电离 APCI 以及大气压光电离 APPI 是其主要的离子源 由于具有高灵敏度 ng ml pg ml 高选择性 检测特定的碎片离子 高效率 每天可检测几百个生物样品和对药物结构的广泛适用性 对液态样品和混合样品的分离能力高 可通过二级离子碎片寻找原型药物并推导其结构 LC ESI MS MS已广泛地应用于药物代谢研究中一期生物转化反应和二期结合反应产物的鉴定 复杂生物样品的自动化分析以及代谢物结构阐述等 已在世界上大型制药企业中取代HPLC而占据了主导地位 其测试的样品量占总量的70 以上 天然产物天然药物的研究 目前中药开发研究有两条途径 一条途径是从单一植物中提取一种有效成分 单体化合物 或提取物开发成新药 另一途径则是中药复方制剂的开发研究 采用现代多种仪器联用新技术 特别是高效液相色谱 质谱 质谱联用 HPLC MS MS 可对其十几种乃至几十种化学成分进行指纹图谱分离鉴定 再从指纹图谱中选择四 五种指标成分 有效成分或特征成分 进行定量 可以确定出简化的指纹图谱和指标成分 又是最合理的中药复方质量控制的方法 是研究中药复杂体系 尤其是复方的有力工具 国内外很多学者已进行了复方丹参 清开灵 泻心汤 人参或党参制剂等中药中的主要成分的分析 临床诊断和疾病生物标志物的分析 欧美等目前已广泛采用HPLC MS MS法用于临床诊断以及疾病生物标志物的研究 检测 具有专一性好 灵敏度高 成本低 分析快速 经济效益可观等特点 目前可进行新生儿遗传疾病筛选 PKU MCAD等四十种左右 新生儿性激素变异的检测 男女激素的监测 老年痴呆症的早期诊断 抗排异药物的检测 磷酸脂的检测 血红蛋白变异检测 糖化血红蛋白 糖尿病早期检测 某些心脏病 癌症疾病筛查如乳腺癌等等 Biomarker法 通过鉴定DNA损伤程度测定 药物剂量监测 药物相互作用监测 地区性突发性中毒病人的毒物检测等 残留 法医学和环境样品测定 专家指出 中国入世后 食品工业最大的问题就是 安全壁垒 这将给中国的进出口和国内企业带来极大的威胁 美国食品与药品管理局 FDA 欧盟 日本 韩国等主要贸易国和地区公布了在进口动物源性食品中禁止使用的药物名单 提高了最高限量标准 这就要求中国加强农 畜 水产品中的农药 兽药等残留的控制和检测 同样随着人类对生存环境的倍加关注 要求对环境中各种污染物 有害或有毒物以及法庭科学中毒物 滥用药物等进行更加严格的监控 而配以ESI APCI和APPI离子化技术的LC MS MS以分析速度快 灵敏度高 特异性好等特点广泛应用与残留和毒物分析 目前已成功地进行数百种农药 兽药 抗生素 兴奋剂类残留和毒物 毒素如氯霉素 磺胺类 硝基呋喃类 毒品 多环芳烃等等化合物的检测 下面讲解应用示例 高效液相色谱 电喷雾串联质谱法测定清开灵复方中胆酸 采用HPLC MS MS技术 从清开灵注射液中 通过分子量 二级质谱碎片信息定性测定了清开灵复方中的胆酸 直接进样实验 清开灵注射液经过初步化学处理后采用电喷雾 ESI 离子源 在负离子扫描方式下 得到一极质谱图 即分子离子峰 M H 再用二级质谱 MS MS 扫描目标分子离子的碎片峰 再以相同的实验条件对标准品进行测定 做出其一级 二级质谱图 通过对样品进行分子离子峰的扫描发现 M H 的峰中有一个很强的407 根据样品处理过程以及对复方各单味药材的研究 其应该为一有机酸的负离子峰 并初步推断其为胆酸 胆酸的分子量为408 如图所示 通过对照样品 右 和标准品 左 的二级质谱图 发现其主要碎片峰均吻合较好 如何用APILC MS MS检测硝基呋喃类代谢物 第一步 配制衍生化后的硝基呋喃代谢物标准溶液 乙腈 水体系 浓度10PPM确认仪器已经校准 气体 电压工作正常 测试条件 离子化方式 ESI 进样5ul min Q1SCAN观察M Z335 236 249 209及同位素内标峰 通过调节DP 使这几个峰最强 注意 1如买来的是已经衍生化的标准品 则可四种混配 2如是用户由硝基呋喃代谢物衍生化的 最好四种分别配制 要求Q1SCAN能明显观察到上述离子 下图是一个用户的混标 只看到335和209 第二步 以第一步测得值为母离子 做PRODUCTIONSCAN MS2 调节CE等参