分子流行病学南京医科大学公共卫生学院流行病学

分子流行病学,Molecular Epidemiology 南京医科大学流行病与卫生统计学系,第一节 概述 第二节 分子流行病学的研究内容 第三节 分子流行病学的研究方法,分子流行病学产生的背景,疾病防治使流行病学遇到了一些新的挑战 传染病防治发现病原体耐药性病原生物的多样性和多变性 慢性非传染病暴露对疾病的微观生物学效应的研究 其他方面（如疾病易感性）,分子生物学理论和技术的飞速发展1953 - Discovery of DNA double helix (Crick & Watson)1960s - DNA transcription mechanism1972 - Recombinant DNA technology1985 - PCR （Kary Mullis)1990s - Human genome project,分子流行病学的发展历程,国外：1972年-提出“流感分子流行病学”1993年：美国Schulte出版了世界上第一本分子流行病学专著分子流行病学-原理和实践 （Molecular Epidemiology: Principles and Practice）。1996年国际流行病学学术会议：狭义分子流行病学是测量作为暴露或效应的生物标志信息大分子：DNA、RNA和蛋白质。从广义上包括任何实验的、生化的测量。,国内：1985年开始, 将分子生物学研究中一些技术应用于流行病中疾病诊断以及追踪传染源的调查研究。1990 年后在流行病学教材中正式列入分子流行病学一章。从1992 年第4 期起,中华流行病学杂志连续7 期发表文章，介绍分子流行病学的产生、定义、研究内容、研究手段及其应用。,Numbers of Papers with Subject Words “Molecular Epidemiology” on Medline,2006,more than 1000 on PubMed!,分子流行病学定义,分子流行病学是应用先进的实验技术测量生物学标志，结合流行病学现场研究方法，从分子水平阐明疾病的病因及其相关的致病过程，并提出与评价相应防制措施的科学。 （徐德忠，1998年）,分子流行病学是阐明疾病和健康状态相关生物标志（或分子事件）在人群和生物群体中的分布及其影响因素，并研究防制疾病、促进健康的策略与措施的科学。 （段广才，1999年）,几个要点： 分子流行病学是流行病学的一个分支分子流行病学的主要研究内容是各种生物标志物分子流行病学还研究暴露因子引起疾病的相关过程， 测定各种生物标志，并提出针对性预防措施,特点,与传统流行病学不同研究的水平不同所解决的问题不同 与分子生物学的区别研究对象不同（人群）研究内容、方法不同 宏观与微观相结合！,传统流行病学和分子流行病学,Exposure,Cancer,传统流行病学,“冰山” 现象,传统流行病学,分子流行病学,传统流行病学与分子流行病学的关系（EDC模型）（Schulte,1993）,暴露,疾病,分子流行病学现况,研究内容更加丰富研究手段越来越多应用范围不断扩大,研究内容,生物标志探讨暴露测量效应测量易感性测量,生物标志的概念 广义的生物标志物(biological markers , biomarkers) 是指生物材料中与有害因素接触有关的机体的各种变化, 包括生理、生化、免疫、细胞和遗传等方面的改变。 分子生物标志物(molecular biomarkers) 直接反映外来理化因素与细胞靶分子, 特别是生物大分子如核酸和蛋白质的相互作用及其后果, 因而具有较高的敏感性。,生物标志,生物标志物的种类,暴露标志（exposure marker, ME）与疾病或健康状态有关的暴露因素的生物标志，称为暴露标志。外暴露标志:暴露因素进入机体之前的标志和剂量，如病毒、细菌、吸烟烟雾等。内暴露标志：暴露因素进入机体之后的标志。,1.体内剂量标志（ID）：外源性物质于暴露后在体内可测量到的剂量标志，表示被人体吸收的外源性物质（性质未改变的或其代谢产物）的数量。吸烟 - 血或尿中的烟草代谢产物可丁宁浓度多环芳烃 - 尿中的1- 羟基芘水平饮食暴露- 黄曲霉毒素B1(AFB1)和尿中N-亚硝基化合物（ N - nitroso compounds）的浓度、血液中营养素水平工作暴露和环境污染 - 血清或脂肪组织中的杀虫剂DDT（dichloro-diphenyl-trichloroethane）、多氯联苯PCBs（polychlorinated biphenyl）、二氧杂芑（Dioxins）环氧化物含量,2.生物有效剂量标志（BED）：能表示已与靶组织细胞内DNA或蛋白质相互作用的外源性物质或其反应产物的含量。它是反映靶细胞分子内接触剂量的生物标志物, 主要包括蛋白质加合物(Protein adduct) 、DNA 加合物(DNA adduct) 、DNA 蛋白交联物(DNA-protein crosslink , DPC) 。,效应标志（effect marker, MEF）机体暴露后产生功能性或结构性的生物标志，称为效应标志。疾病标志（MD） 健康状态标志（MH） 生物学反应标志（BR）: 反映了由于结合到靶细胞的外源性物质的持续作用，进一步引起细胞与组织的生物学或生化学的变化。这些变化主要发生在细胞特定部位，尤其在基因的某些特定序列；这些变化可引起机体某些不可逆转的生物学效应。,亚临床（早期）疾病的生物学标志,血清甲胎蛋白,肝癌、肠道疾病、胎儿神经管缺失,癌胚抗原,胃肠道癌、其它胃肠道疾病,肿瘤特异性抗原,各种癌症,生物学反应标志,MUTAGEN SENSITIVITY ASSAY,易感性标志（susceptibility markers, MS）个体对疾病发生、发展易感程度的生物标志。 易感性主要与宿主的遗传特征,以及生长发育、营养、免疫、机体活动状态等有关。不同疾病的不同阶段，都有可能具有不同的易感性标志。 易感性影响着其它生物学标志在机体内的水平；不同个体的易感性不同，与之相关的其它生物学标志的水平也可以不同。,宿主易感性标志,易感基因标志物： 人类基因组多态性 遗传易感性标志,Genetic VariationsSNPsDeletionsInsertionsMicrosatelliteMinisatellite,Genetic Diversity,10 million SNPs,(遗传多样性),What is a SNP? 基因多态性,A mutation in the DNA sequence with a frequency of 1%,Why are SNPs Important?,生物标志的选定,生物标志的筛选具有较好的特异性和稳定性检测方法具有较高的灵敏度和特异度检测方法快速、简便 生物标志特性分子特性 个体间变异时相特性 群体间变异个体内变异 储存变异 检测方法实用性和可信性 检测方法的有效性,暴露测量,外暴露研究 1. 生物性病原因子检测鉴定2. 研究病原生物进化变异规律3. 确定传播途径4. 非生物性因素的暴露测量内暴露研究1. 传染性疾病 感染状况 传染源追踪2. 慢性非传染性疾病 内暴露水平 生物作用水平,暴露标志的局限性,标志的测量必须先寻找合适的生物材料； 大多数标志物如血红蛋白加合物和血浆可的宁水平只能反映目前的暴露水平；暴露标志物测量的费用通常要高于调查表,效应测量,传染病 免疫效应 病理性效应慢性非传染性疾病 基因表达异常和代谢异常 基因突变或染色体畸变健康状态,易感性测量,遗传性疾病慢性非传染性疾病传染病：血清学生物标志、基因标志,分子流行病学的应用,1、疾病病因的探讨 遗传因素起重要作用的疾病往往与基因有关，这不言而喻；而很多与环境因素有关的疾病，也常常需从基因方面去研究，因为环境因素可以通过宿主的基因突变或异常表达引起疾病。 慢性非传染性疾病 肝癌 黄曲霉毒素 （体内外检测） 传染病 AIDS、SARS （分子生物学技术）,2、疾病分布规律以及危险因素致病机理的研究 分子流行病学不仅研究环境与宿主体内的致病因子，而且着重研究这些致病的危险因素，特别是化学物质与生物活性物质从暴露开始至疾病发生全过程的各个环节。 慢性非传染性疾病鉴定各种恶性肿瘤的危险因素, 并根据个体暴露与遗传等易感因素的相互作用, 确定危险度, 筛选对特定致癌因子敏感的个体和亚群。 传染病如确定风疹病毒（RV）和巨细胞病毒（CMV）等在人群中母婴传播的危害程度有多大，诱发畸形或死产、流产的危险度如何等。,3 、疾病易感性的测定 在相同的致病因素作用下，只有一部分人发生某种疾病。这是因为人群对致病因子的反应存在个体差异，只有一部分人对其易感。 慢性非传染性疾病肿瘤的遗传易感性在暴露到疾病发生的每一步都起作用，包括人群中较常见、低危险度的遗传多态性和高外显率、人群中罕见的抑癌基因突变。 传染病测定机体内是否存在某种特异性保护（中和）抗体的方法了解其对某种传染病是否具有易感性或免疫力 。,4、传染病流行规律的研究 （1）传播范围的确定 （2）传播途径的判定 分子进化诊断（molecular evolutionary diagnosis），判断HCV在配偶之间的传播。（HCV-RNA的基因型别，毒株的分株时间（divergence time） （3）传染源的追索 美国19901991年报道佛罗里达一个口腔诊所有1名患有艾滋病的牙医，被他看过病的患者中有7名后来感染了HIV，然而经过分子流行病学研究发现，其中5名患者的HIV与牙医的HIV有共同的氨基酸特异模式（signature pattern），而且序列的差异率5.0%，为同一病毒株；而另2名患者的HIV则与牙医的不同。因此，通过序列分析，从分子水平确定了前5名病人的HIV感染是由牙医引起，而后2名病人的传染来源则不是牙医。,5、防治效果评价传染病预防 提出的控制措施更有针对性，更有成效 基因工程疫苗研制 非传染病的预防 分子机理的探讨、易感标志物的确定，为筛选和确定高危险人群提供了科学依据，使慢性病的预防更具有针对性。,研究方法,测量指标的一般原则生物标志应特异、稳定；标本采集、储存方便；检测方法比较简单、实用，而且操作规范，便于与同类研究结果比较。检测方法灵敏度和特异度高。,测量指标 暴露指标 效应指标 易感性指标,标本采集的一般要求在采集和储存过程中不能受到“污染”储存的生物标本在任何时候进行检测都可以获得一致的结果所有的生物标本都应有详细的背景材料和鉴别标识。 常用的生物标本有: 微生物标本、血液标本、组织标本以及其他一些体液、头发、媒介生物等.,分子流行病学在某种意义上讲，是一种流行病学宏观与实验室微观结合的方法学，需要现场流行病学调查研究与实验室先进的检测技术相结合。 分子流行病学的研究方法大致可以分为二大类：实验室技术与流行病学现场研究方法。,常用的实验室检测技术,核酸技术（DNA & RNA）核酸体外扩增 （PCR）核酸电泳图谱 核酸酶切电泳图谱 （RFLP）核酸分子杂交 有原位杂交、斑点杂交、转印杂交（包括Southern blot检测DNA和Northern blot检测RNA）等。核酸序列分析蛋白质技术 蛋白质分离鉴定技术主要有：电泳、凝胶电泳、蛋白质转印杂交（Western blot）、色谱分析、蛋白质测序等。,酶学技术 包括定性和定量检测，要求一定的条件。多位点酶电泳（multilocus enzyme electrophoresis, MEE）法。其它技术 免疫学技术：酶联免疫吸附试验（ELISA）、荧光免疫试验（FIA）、放射免疫试验（RIA）、免疫细胞化学检测（ICC）等； 色谱技术：高效液相色谱技术HPLC）、液相蛋白色谱技术（FPLC）等。,Automated Liquid HandlerSpectroPREPTM,Nanoliter DispenserSpectroJETTM,MALDI-TOF Mass SpectrometerSpectroREADERTM,Automated AnalysisSpectroTYPERTM,Miniaturized BiochipSpectroCHIPTM,MassARRAYIntegrated Components,Blood Sample Processing and Biomarker Assay Flow Chart,现场分子流行病学研究方法,传统的现场流行病学研究方法，即描述性研究，分析性研究与实验性研究均可应用于分子流行病学。也可以说，在传统的流行病学研究中，结合检测一些生物学标志，以从分子水平更深层次揭示病因联系或致病因子的致病机制。,（一） 病例-对照研究可用于研究基因多态性与肿瘤易感性的关系，也可用于测定可能的基因- 环境交互作用。 在人群中抽取病例和相应的对照，通过比较病例组与对照组中基因多态频率的差异来判断对肿瘤危险的作用。 计算调整的相对比值比（odds ratio, OR）,XRCC1多态性位点的各基因型在病例组和对照组中的分布,1校正因素为性别、年龄和吸烟情况,（二）病例-病例研究（case - case study） 基本原理：把不同临床类型或具有某些生物学标志的病例与无标志的病例按照病例对照研究的方式处理资料，以探讨不同临床类型的危险因素的差异或者这个生物学标志与该病的其它危险因素之间的关系和相互作用。 如食管癌的病例-病例研究中发现，130例食管癌患者中，用免疫组化检测到p53基因表达异常的有68例，按病例-病例研究处理，无论是单因素或Logistic回归分析，均显示吸烟、食管癌家庭史与p53基因表达异常有关，OR值分别为2.33.2和2.83.8；吸烟还有剂量效应，表明吸烟与食管癌家族史很可能是食管癌p53基因异常表达的危险因素。,研究设计与资料分析,（一）研究目的和路线 在广泛查阅文献的基础上，明确本次研究的目的：广泛性的探索疾病的危险因素验证某个病因假说,（二）测量指标: 根据目的和研究路线确定测量指标。要考虑到生物标志的特性。（三） 测量方法：结合各方面条件合理选择。（四）调查方法与样本 决定所需样本含量的因素如下：病例组的暴露率（P1）与对照组暴露率(P0)，可以通过查阅文献或预调查确定；相对危险度的近似值OR，查阅文献或预调查获得；第一类错误()的概率；把握度(power，1-)。,（五）资料的整理与分析 1.资料的整理 2.数据的分析描述性研究描述研究对象的一般特征均衡性检验统计性推断分析 暴露与疾病的统计学关联强度，并确定关联强度的大小,传统流行病学指标（OR, 95%CI）血清流行病学分析 遗传关系分析基因型（genotype）等位基因（allele）表型（phenotype）单倍型（haplotype）克隆（clone）多态性分析 基因环境交互作用分析,实验室中的质量控制,1一般实验质量控制 (1)标本采集和储存 (2)试剂和材料 (3)仪器 (4)实验方法 (5)操作规范2设立多重对照 为保证检测质量，可以设立多种对照，而且可以采取“盲法”。 (1)标准对照 (2)空白对照 (3)重复对照3重复试验 (1)实验室内重复试验 (2)实验室间重复试验,常见偏倚及其控制,（一）选择偏倚：样本选择偏倚和标本采集偏倚（二）信息偏倚：检测偏倚、样本储存偏倚（三）混杂偏倚：研究设计,研究实例,研究目的：研究DNA修复基因XRCC1 编码区Arg194Trp，Arg399Gln及启动子区域-77位点（TC）三个位点的多态性在中国人群肺癌患者及健康对照中的分布，初步探讨各基因型与肺癌易感性的关系。方法：以医院为基础的病例对照研究方法；选择经组织学确诊的710例新发肺癌病例及性别、年龄和地区频数匹配的710例人群对照；通过PCR-RFLP的方法检测三个位点的基因型。用多元logistic 回