种质资源保存.ppt

第四章植物种质资源的保存 第一节几个概念第二节低温种子库保存第三节植物体保存第四节其他保存方法第五节种质信息管理与核心种质的建立 第一节几个概念 植物种质资源保存 conservationofplantgermplasmresources 是指通过人为的技术措施保护植物种质资源 使其不至于流失或灭绝 原生环境保存 非原生环境保存 原生环境保存 insituconservation 自然保护区 naturereserves 自然公园 naturalpark 非原生环境保存 exsituconservation 活体植株保存 如植物园 botanicgarden 种质圃 fieldgenebank 种子库 seedstoragefacility 离体保存库 invitrostorage 种子寿命 一批种子的群体生活力在一定贮藏条件下 能保持或接近在母体植株上达到生理成熟时的发芽率 80 并且能萌发长成正常植株的期限是指种子生命力在一定的环境下能保持的最长期限 在一个种批中 种子个体间的生命期限差异很大 因此 应该以种子群体的平均寿命来表示种子寿命 种子活力 一批种子在广泛的田间环境条件下 能迅速整齐地萌发并长成健壮幼苗的内部潜在能力的总和 第二节低温种子库保存 一 种子贮藏寿命及其影响因素二 种子低温贮藏设施三 种子入库四 种子生活力监测与繁殖更新 一 种子贮藏寿命及其影响因素种子储藏寿命受以下两方面因素的影响1 种子自然寿命2 种子贮藏的环境 1 种子自然寿命成熟种子在自然条件下的寿命 根据种子自然寿命的相对长短 将种子归为三类 长命种子中命种子短命种子 长命种子 15 100年或更长 如番茄 茄子 西瓜等种子 1952年辽宁古莲子 有活力 寿命1040年 210年中命种子 寿命在3 15年之间 如萝卜 白菜 黄瓜 甘蓝 莴苣 辣椒 菜豆 菠菜等种子 短命种子 寿命在3年以下 如葱 胡萝卜 芹菜 小麦 玉米等种子 杨树 30 40h 柳树 一周 以及可可 35h 2 种子储藏的环境 影响种子寿命的贮藏条件主要水分和温度 水分 种子含水量 MC moisturecontent 种子贮藏环境的空气相对湿度 RH relativehumidity MC越高 种子呼吸作用越强 贮藏物质分解越快 生活力下降越快 MC与RH密切相关 当RH增加时 MC随之上升 达到一定程度时 便出现游离水 这时的种子含水量为 临界含水量 此时种子内呼吸酶和水解酶异常旺盛 种子及容易丧失活力 哈林顿 Harrington 1960 提出的原则 种子含水量在5 14 的范围内每降低l 其寿命便延长一倍 但种子含水量下降有个下线 各种植物之间有区别 温度 是影响种子新陈代谢的主要因素之一 在低温状态下 种子细胞内代谢活动水平很低 物质和能量消耗少 细胞的衰老进程也很缓慢 因而可以长时期保持种子生活力 哈林顿 Harrington 1960 认为在0 50 范围内 温度每下降5 种子寿命即可延长一倍 水分和温度相辅相成 低温保存种子必须结合较低的含水量和空气相对湿度 二者之一不合适 则种子活力很快丧失 种子对低温的适应性主要取决于细胞液浓度 种子含水量低 则细胞液浓度高 在冷冻条件下受伤害的可能性小 二 种子低温贮藏设施低温种子库 根据功能分为三类 长期库 20 10 RH 60 MC 4 6 保存期30 50年或更长 不对外分发 战略上 中期库 0 10 RH 60 MC6 9 寿命10 30年 保存流动种质搜集品 短期库 15 20 RH50 60 MC 12 种子预期寿命2 5年 保存种子的容器长期库 种子封入不透气的容器内 如密封的金属盒 铝箔袋 塑料复合薄膜袋 玻璃瓶等 中期库 种子容器同长期库 短期库 种子容器从有孔到几乎密封 如纸袋 塑料袋 布袋 玻璃瓶等 低温种子库的基本结构 1 低温库房 主要组成部分 种子架 种子架与地面 墙壁 屋顶之间的最小通风空隙分别为10 20cm 20cm和50cm 2 围护结构 保温层 隔汽层 护墙板和库门 3 制冷系统 制冷设备 除霜设备 恒温控制器和高温报警器 4 辅助设施 低温库房门外的缓冲间 种子接收分发间 种子清选间 熏蒸间 数据处理间 发芽间 种子干燥间 种子包装间 种子临时贮存库等 三 种子入库程序 种子发芽率试验 入库要对种子生活力进行检测 作为种质资源保存的种子 入库前发芽率要求在90 以上 发芽率试验一般需200 400粒种子 4次重复 种质编号国家种质库对各种作物采用三级分类编号方法 如 2A02531 大白菜的某个品种 栽培植物划分为4大类 代表农作物 代表蔬菜 代表绿肥 牧草 代表园林花卉 每一大类分为若干小的类型 用单个阿拉伯数字表示 具体作物编号用大写英文字母表示 品种用5位阿拉伯数字表示 在编库号的过程中还需逐份核对种子性状 核对的项目包括粒色 粒形 大小 饱满度 整齐度 有无表面附属物 有无特殊气味等 种子含水量入库种子含水量应降到5 7 中华人民共和国国家标准 农作物种子检验规程 多油的种子干燥时采用稳定低温烘焙法101 103 加热15 17h其他种子采用稳定高温烘箱法 烘箱温度为130 133 加热时间为1hMC测定要求2次重复 误差在0 2 以内 种子包装 尽可能在3h内完成入库种子数量 计数法和称重法我国国家库种子入库数量要求是 小粒种子 千粒重 5g 50g 油菜 辣椒等中粒种子 千粒重20 100g 6000粒 小麦 绿豆大粒种子 干粒重100 400g 2500粒 如玉米 大豆特大粒种子 千粒重 1000g 1000粒 如可可种子贮藏期间的检测损耗 每份材料可增加15 的入库数 入库种子定位 A010201A是冷库编号 01为架子排号 02为架子层号 01为种子筐或种子屉编号 把存放位置编号记人档案 四 种子生活力检测种质库种子生活力下降的速度物种间和品种间差异很大 低温库贮藏种子生活力监测已成为种质安全保存的核心 1 种子生活力检测 1 发芽试验 固定样本量法 200 400粒 序列测定法 20粒 2 生活力测定 破坏性和无破坏性监测 四唑 TTC 染色法是国际通用的种子生活力快速测定法 属于破坏性监测 2 种子繁殖更新种子生活力降到85 以下时 或样本中种子数低于完成繁殖该物种3次所需的种子量时 就要进行重新繁殖 繁殖过程 从低温种子库取出待繁殖种子容器 打开 温度 湿度 余下种子放回库中 繁殖地选择 繁殖的种子成熟后 在同一材料不同植株上采集相同重量的种子进行混合 使母本效应降至最低程度 同时在样本内部尽可能多保持变异 注意种子的休眠 斯瓦尔巴特种子库入口 北极种子库 第三节植物体保存技术 一 植物园和种质圃二 自然保护区和自然公园三 试管苗保存 1 植物园 综合性植物园和专业性植物园 通常综合性植物园具有物种保护和基础研究 经济植物开发利用 提供休闲游览服务 科普教育 技术推广性生产活动5大功能 如北京植物园 南京中山植物园 华南植物园 武汉植物园 昆明植物园 西双版纳热带植物园等 以及由园林部门领导的杭州植物园 上海植物园 厦门植物园 青岛植物园等 专业性植物园又称为附属植物园 指根据一定的学科 专业内容布置的植物标本园 树木园 药圃等 如浙江大学植物园 北京药用植物园 南京药用植物园 华南热带经济植物园 浙江林学院植物园 武汉大学树木园中国科学院于2002年底启动一项规模庞大的植物园建设计划 目标是将中国本土75 的植物种类引种到植物园并有效保护起来 以保护本土植物资源为主 2 种质圃种质圃严格地说不是植物园 它们附属于某类栽培植物的科研单位 主要用于栽培植物种质资源保存 分类和引种的研究 其功能高度专一 一般不提供休闲游览服务 无性繁殖材料和多年生栽培植物的种质材料以及一些作物的野生种和野生近缘植物主要在种质圃中保存 我国的种质圃建设从20世纪80年代开始 目前有30多个种质圃 二 自然保护区和自然公园1 自然保护区 国家或地方政府为保护野生生物物种和自然生态系统而划定的一片区域 在保护区内严格限制人类的经济活动 美国黄石国家公园 建于1872年 被认为是世界上最早的自然保护区 到2001年 全世界已建成属于IUCN 世界自然保护联盟 级自然保护区28442处 其中生物圈保护区368处 世界自然遗产149处 国际重要湿地1019处 我国于1956年在广东鼎湖山建立了我国第一个自然保护区 到1998年底 我国自然保护区总数已达到920个 占国土面积8 12 已有7个湿地自然保护区被列入 国际湿地公约 的重要名录我国是亚洲湿地类型最齐全 数量最多 面积最大的国家 为世界上居加 美 俄之后的第四个湿地大国 湿地具有强大的沉积和净化作用 湿地与森林 海洋并称为全球三大生态系统 人们将湿地称为 地球之肾 并确定每年2月2日为世界湿地日 西藏超三分之一土地被纳入自然保护区受严格保护 2 自然公园 自然公园与自然保护区的主要差别是 前者把保护生物物种资源及自然生态系统与为公众提供休闲娱乐场所放在同等重要的地位 国家公园 有部分应属于自然保护区 森林公园 属于自然公园 1982年 在湖南张家界建立我国第一个国家森林公园 到1996年 自然公园达到870处 如太白国家森林公园 2020 3 17 39 可编辑 3 自然保护区和自然公园对植物种质资源的保护功能 近缘野生种和野生食用植物得到保护 林芝杜鹃 西藏特有植物 藏玄参 大花红景天 三 试管苗保存1 试管苗保存概况许多进行无性繁殖的材料 果树 薯芋类蔬菜 球根花卉等 可用其分生组织保存 目前全世界以试管苗方式保存的植物种质资源材料约27600份 其中国际马铃薯中心保存试管苗材料3000份 我国八五期间建成两个国家种质试管苗保存库 黑龙江克山国家种质马铃薯试管苗库 950余份 江苏省徐州国家种质甘薯试管苗库 1400份 2 试管苗保存的优点 1 节省土地如保存800个葡萄品种 每品种保存6管苗 只需恒温室2m2即可 若在田间保存 需占地1hm2 2 节省劳力与费用 3 避免感染病虫害 4 避免环境伤害 5 快速繁殖 6 去除病原物 3 试管苗种质保存方法保存试管苗种质关键是要维持最低的生长速度 生长速度取决于培养温度 培养基组成和品种特性 1 增加培养基渗透压 2 降低保存温度 温度是试管苗保存的关键因素 在低温 3 5 条件下 试管苗中各种酶活性降低 因而减缓了代谢过程和生长速度 如果增加培养基渗透压与降低温度相结合 试管苗继代培养间隔时间为2 3年 3 利用植物生长抑制 4 补充光照 目前 作为保存种质资源的细胞或组织培养物有 愈伤组织 悬浮细胞 幼芽生长点 花药 花粉 体细胞 原生质体 幼胚等 第四节植物种质资源其他保存方法 一 顽拗型种子保存顽拗型种子 Recalcitrantseed 不耐干燥和零下低温 也即对干燥和低温敏感的种子 这是相对于能在干燥 低温条件下长期贮藏的正常型种子 Orthodoxseeds 而言的 1 顽拗型种子的基本特点 1 不耐干燥 脱水易损伤 2 不耐低温 易遭冻害和冷害 3 寿命短暂 通常只能活几个月或几年顽拗型种子的植物有两大类 1 水生植物 如水浮莲 菱的种子 2 大粒种子木本多年生植物 主要是一些热代作物 如橡胶 可可 椰子 芒果 榴莲 红毛丹等 一些温带植物 如板栗 七叶树等 2 顽拗型种子保存技术 1 胚贮藏法 顽拗型种子不同部位对失水的反应差别很大 一些种子的胚可干燥到较低含水量 所以可采用胚离体贮藏法 液氮 196 中保存 2 保持含水量贮藏法 采用一定的措施使种子含水量保持在临界值以上 延长种子的贮藏寿命 二 超干燥贮藏过去 人们一直认为种子存活含水量的最低界限为5 国际通用的种子贮藏含水量标准便是5 一7 后来 英国雷丁大学进行的一项研究表明 有些植物的种子当含水量降到2 3 时 可以大大延长其贮藏寿命 于是提出超干燥贮藏 超干燥贮藏是一项前景十分看好的技术 植物种质资源保存方面具有很大的潜力和利用价值 可建立常温种质库 在室温下长期保存 要解决三个比较突出的问题 1 种子含水量限值的确定 2 一些对超干燥敏感的类型 要防止其在干燥过程中遭受损伤 3 超干燥种子在发芽时很易遭受吸胀损伤 三 超低温保存20世纪70年代 开始应用于保存植物材料 对花粉和顽拗型种子保存具有十分重要的作用 美国是开展超低温保存及时研究较早的国家 日本 印度和中国国家基因库均开展了超低温保存 目前超低温保存主要采用液态氮保存设施 超低温保存技术一般先将种质材料进行预冷 然后再放人液态氮中 预冷的温度为 10 30 或 70 有些植物的种子可直接放入液态氮中 超低温保存的种子只需常规干燥 可以大大节约成本 我国从 七五 开始将超低温保存技术列入国家科技攻关项目 超低温保存对于那些寿命短的植物 组织培养体细胞无性系 遗传工程的基因无性系 抗病毒的植物材料及濒临灭绝的野生植物 都是很好的保存方法 四 植物DNA库1 建立植物DNA库的必要性 1 生物多样性保护的需要目前低温种子库保存的绝大多数是栽培植物的种子 数量上占绝对优势的野生植物的种质资源尚未实现种子保存 如我国国家种质资源库保存的植物仅占高等植物总数的1 83 况且还有顽拗型种子和低等植物如藻类 苔藓类蕨类的种质资源保存问题 建立DNA库是拯救和保护植物资源的一条快速有效途径 2 生物技术发展的产物生物技术为建立植物DNA库提供了技术支撑 尤其是PCR技术的开发和应用 使得从植物中提取DNA成为可能建立某一物种的基因 DNA 文库 不仅可长期保存该物种的种质资源 还可以通过反复的培养 繁殖 筛选来获得各种基因 这对于抢救和长期安全保存种质资源提供了有效的方法 从植物中抽取大分子量DNA 用限制性核酸内切酶把所抽取的DNA切成许多片段 再通过一系列的复杂步骤 把这些DNA连接在载体上 通过载体将DNA片段转移到大肠杆菌中去 通过大肠杆菌的无性繁殖 产生大量单拷贝的基因 当需要某个基因时 就可通过某种方法去 钩取 获得 2 植物DNA库的保存对象与运作 1 保存对象 种子植物和非种子植物的种质资源均可采用DNA库保存 种子植物主要保存以下几类基因材料 a 难于搜集到的材料 b虽然搜集到种子 但难以繁殖更新的材料 c 不能检测种子活力的材料 d 顽拗型种子植物 e 珍稀濒危植物 f 核心样品材料 g 基因工程的中间材料 非种子植物主要包括藻类 苔藓类和蕨类等 这些植物绝大部分处于野生状态 而且包含着十分丰富的遗传多样性 急需得到保护 2 植物DNA库的运作 第一步 制定计划 进行植物样本的采集 并制作蜡叶标本 记录原始标记 第二步 妥善保存所搜集的材料 根据需要和条件提取并保存基因组DNA 克隆重要的基因 建立DNA或cDNA库 第三步 根据用户的需要 在用户提供引物的基础上 钩取基因 并用PCR扩增DNA 发放给用户 第五节种质信息管理与核心种质的建立 一 种质信息管理二 核心样品的建立 一 种质信息管理种质资源的保存 除资源材料本身外 还应包括种质资源的各种资料 对每份资源材料均应有其档案 档案资料在条件许可时 应输入计算机储存 建立数据库 以便于资料检索 分类和开展有关的研究工作 目前 世界上不少国家和国际农业研究机构都相继建立了种质信息计算机管理系统 尽管其规模 组织和功能方面存在差异 但它们的作用大体相同 我国已建成国家作物种质资源信息系统 CGRIS 1 种质数据类型基础数据 包括登记材料数据和搜集数据 登记材料号 采集编号鉴定和评价数据 植物学性状 经济性状 品质性状 对病虫害的反应 对环境的适应性管理数据 包括接纳日期 种质编号 入库定位种子起始发芽率等等 交换数据 交换目录内有关种引进和分发的数据 2 种质信息系统类型种质信息系统按其主要特征分为三类 1 文件系统 2 数据库系统 3 网络系统 美国的GRIN 作物品种资源数据库计算机管理系统中 比较著名的有 芬兰 瑞典 挪威 冰岛和丹麦共同建立的北欧五国作物品种资源数据库 前民主德国建立的欧洲大麦数据库 RBDB 菲律宾国际水稻所的国际水稻种质资源数据库 我国于1986年开始国家作物种质资源数据库系统研究工作 到1990年建成了我国国家作物种质资源数据库系统 拥有的种质资源已逾30万份 使我国作物种质资源信息管理跨入世界先进行列 成为世界上仅次于美国的第二大的作物遗传资源数据库系统 网络系统是提供和交换信息的场所 美国的GRIN是运行最久 最具代表性的网络系统 它在资源管理上有三个重要功能 首先 它是全美所有类型植物遗传资源的信息中心 第二 它提供了包括作物特性描述和评价信息在内的美国作物种质资源标准化信息方法 第三 它提供了每个资源收集站进行信息管理和交换的方法 并使各站能及时掌握国家种质资源信息系统的最新信息 3 植物遗传资源协作网 在国际上建立起来的种质信息管理与交换系统 建立植物遗传资源协作网目的是利用长期种质库妥善保存种质资源 通过数据库系统提供信息和资料 并借助中期库分发种质资源 1 地区协作网 2 作物协作网 3 长期库协作网 4 以课题为基础的协作网 种质资源协作网不仅开展有关合作伙伴组织间信息资料的交换 还进行一些互利的植物遗传资源活动 对每个国家的种质信息进行分析 了解植物遗传资