PCR反应及琼脂糖电泳实验报告.doc

多聚酶链式反应（PCR）扩增DNA片段及琼脂糖凝胶电泳产物检测一、实验目的：1、了解PCR技术的基本操作2、理解PCR的原理3、讨论PCR的应用二、实验原理：PCR是一种在体外模拟细胞内环境进行迅速扩增DNA片段的技术，这一技术需要模板、四种脱氧核苷酸等组分条件外，还需要不同温度环境以进行DNA的解旋和聚1、PCR反应组分细胞内DNA复制条件分析：条件参与的组分在DNA复制中的作用实验条件/材料模板DNA的两条单链提供复制的模板模板DNA原料四种脱氧核苷酸合成DNA子链的原料dNTP mixture酶DNA聚合酶催化合成DNA子链Taq DNA 聚合酶酶解旋酶打开DNA双链温度控制引物一小段单链DNA或RNA为DNA聚合酶提供合成的3端起点引物I 引物II此外，试验中用到的还有Mgcl2，Mg2+能激活酶的活性；10* Buffer 缓冲液，为Taq酶提供合适的PH条件。2、PCR反应条件PCR利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合，现在使用的PCR仪实质上也是一台能够自动调控温度的仪器。PCR一般经历三十多次循环，每次循环可以分为三个基本步骤变性、复性和延伸。(!)变性（模板DNA解旋）模板DNA经加热至90以上。一定时间后，使模板DNA双链解离，使成为单链，以便于它与引物结合，为下轮反应作准备。(2)复性（退火）模板DNA经加热变性成单链后，温度降到50左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。(3)延伸DNA模板引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下以脱氧核苷酸为原料，以母链为模板，按碱基互补配对的原则与半保留复制的原理，合成一条新的DNA链。循环数变性复性延伸第一次（预变性）94C，30s30次94，20s52，20s72，20s最后一次（保温）72，30s3、PCR产物的检测(1)紫外分光光度计DNA在260nm的紫外波段有一强烈的吸收峰，可以通过与蒸馏水的对比进而计算扩增出DNA的含量。(2)琼脂糖凝胶电泳DNA在电厂作用下，可以由电源的负极向正极泳动，泳动的速度与DNA片段的长度成负相关，与电压强度成正比，因此可以分离不同长度的DNA。在有DNA marker（不同已知碱基对大小的DNA片段的混合物）的条件下，由于不同碱基大小的DNA片段在琼脂糖凝胶上涌动的速度不同，因此电泳完毕后会出现在胶块的不同位置。通过将扩增出的DNA片段与已知的条带做比较，可以大概推测出该片段的碱基对的大小。如果要进一步检测其大小，可以换另外规格的DNA marker 继续电泳。核酸荧光染料可以与DNA嵌合，一起电泳，DNA图谱观察仪可以激发特定的蓝色光源，荧光染料在该光照射下可见到荧光，荧光的亮度与DNA大小成正比。三、实验仪器及试剂7种PCR组分 微量可调移液器 离心管 PCR仪 水平电泳槽 电泳仪电源 紫外分光光度计 250ml锥形瓶(封口膜) 记号笔 卫生纸四、实验步骤1、DNA体外扩增(1) 将所有试剂管瞬时离心一次（4000r/min,1min），使管壁没有残留药品，在引物I 和引物II的离心管内用移液器各加入40ul双蒸水（ddH2O），混匀后瞬时离心一次。所有的离心管都摆到双面板上。(2)向装有Taq DNA 聚合酶的离心管按下表加入以下成分：10x Buffer50 LMgCl250 LdNTP mixture20L上游引物(引物I)25L下游引物(引物II)25 L模板DNA25 LddH2O290L原有的Taq DNA 聚合酶有15ul，此时混合液体系共计500ul,此步骤由第一、二组同学合作完成。（在实验老师的监督指导下操作，确保此后其他同学的实验顺利进行）(3)共分25组，第一、二组的同学并入其他小组进行实验。每组取20ul的上述混合液于0.5ml的离心管中，加入15ul的液体石蜡封闭体系，以防止在加热过程中蒸发。(4) 对自己组的离心管上进行标记之后，放到PCR仪上进行DNA扩增。2、琼脂糖凝胶电泳检测DNA（1）用蒸馏水将电泳槽和梳子冲洗干净，放在水平桌面上，并架好梳子。（2）配制浓度为1%（1 g/100 mL）的琼脂糖凝胶2块。在锥形瓶中，称取1g的琼脂糖粉，加入100ml 1x电泳缓冲液，用封口膜封住瓶口后在微波炉内加热，使琼脂糖粉熔化，然后冷却至60 ，倒入电泳槽中（每块胶50ml），插好梳子，待其凝固。（电泳槽首先用透明胶带将两端封住再进行倒胶）（3）待胶凝固后，去掉胶带纸，小心移去梳子，注意不要破坏加样孔。将倒胶槽至于水平电泳槽内，梳井（点样孔）一端朝负极方向。向电泳槽中缓缓倒入1x电泳缓冲液，以没过胶面2 mm为宜。（5）将80ul的6xLoading Buffer 加入到80ul的核酸荧光染料中，按1:1比例混合。（6）移液器枪头插入到扩增出的样品离心管的底部，吸取20ul样品于另一0.5ml的离心管中，注意不要吸到液体石蜡，再加1ul的染料混合液，充分振荡混匀。用移液器吸取10ul缓慢加入梳井内，枪头抵到梳井口，以防止样液被缓冲液冲散，此外，为防止手抖将凝胶破坏，可以用左手扶住右手的手腕。（6）盖上电泳槽盖，接通电源，电压为80 V，电流最大。（7）当指示剂移动到凝胶中间时，断开电源，终止电泳。（8）取出凝胶块，在DNA图谱观察仪中观察电泳带及其位置，判断扩增产物的情况。3、紫外分光光度计检测DNA含量（1）最后1组取2ulPCR反应液，加入98ul蒸馏水，将样品稀释50倍。（2）以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零。（3）加入DNA稀释液100ul至比色杯中，测定260nm处的光吸收值。（4）根据下面的公式计算DNA含量：DNA含量（ul/ml）=50*（260nm的读数）x稀释倍数 五、注意事项 1 离心机上盖没有锁，在离心机运转时，转速最高可达16000r/min，如果这时打开离心机上盖，