生物工程专业英语第三章翻译36-37.doc

3.6分析和操纵遗传物质已革命性的发展在体外基因的克隆技术，允许隔离，净化和选择性扩增在适当的生物系统几乎任何离散段从几乎任何生物体。由于删除基因不含相关基因，基因的克隆可以采用的方法分析和处理是主要针对基因区域的利益，从而大大提高效率的方法，简化了识别和表征（特征分析）的新型改性衍生物。相反，原生质体融合，大部分或全部基因组混合的特点和兴趣控制一般由大量的基因（例如，抗生素），基因重组技术主要关注的是少数个别基因的已知基因的产品（例如，保护蛋白质，多肽等。）。该l978遗传操作规定（基因操作条例）定义的遗传操纵的形成新的组合的遗传物质的分离的核酸分子，通过任何手段以外的细胞，任何病毒，细菌质粒，或其他载体系统，使其纳入（掺入）宿主生物体中，他们不自然地出现在他们能够继续繁殖的遗传操纵。因此定义不包括，例如，单克隆抗体，改良微生物常规遗传技术，体外受精或克隆技术用于动物使用。遗传操作技术，到目前为止，只有一小的贡献，虽然重要的，生物技术的研究和应用。在过去十年中几个重要的发现是在介于分子生物学的迅速发展引发了基因重组技术。特别意义的孤立的突变株大肠杆菌不能分解或限制外源基因导入细胞，并确定和表征限制性内切酶能够切割双链（德尚）基因在特定的网站。一般来说，这样的片段无法改造或复制有效地在宿主细胞。这一问题已在很大程度上克服了插入片段为载体，可以插入到宿主细胞，使有关信息表达的载体。通常是细菌质粒，噬菌体或酵母2DNA，共价粘接的片段的载体，是实现与酶核酸连接酶。新合成的载体或嵌合分子进行改造宿主生物，如大肠杆菌，枯草芽孢杆菌、酿酒酵母和宿主细胞生长和繁殖（克隆）也将载体复制和扩增基因。它可以克隆整个基因组，从而创造一个大规模的收集或图书馆（库）独立分子（基因组文库基因组文库。）将包含所有的生物基因组序列，原则上应是可能的孤立任何基因提供一个具体的探针检测可以得到。如果平均大小的克隆序列20个碱基，约700000个人克隆将需要一个完整的图书的人类基因组。遗传操作技术提供了革命性的能力，因为它们是快速，普遍适用的，允许一个高度控制在操作过程中，首先产生形成新的基因组合，之前从未被选定的实验室方法。基因重组技术已成为发展最快的方面的生物科学。中央对这一新技术的概念是克隆已确定由蒂米斯（1981）的分离和个体传播的一个单一的元素能够繁殖的混合物相似的元素。在实践中，克隆一直被用来传播纯培养的病毒，微生物和植物的营养方式从而保证精确的生物体的基因组（表3.2。）。如今，该词还包括分离和维护个人自治遗传因素如质粒和潜隐病毒的基因组。克隆细胞有机体只需要营养介质；克隆的病毒和质粒将涉及一个特定的宿主细胞结合营养培养基，而克隆的基因将需要载体的复制，一个特定的宿主细胞和营养培养基。所有类型的克隆具有重要的作用，生物技术；因此所有的微生物，植物和动物细胞可用于生物技术的进程需要保持和传播在纯和恒定状态，而病毒和质粒传播或放大，特别是，已确定为功能强大的工具，在新的生物技术。 原则的基因克隆或基因重组技术将简要讨论使用的主要例子的大肠杆菌K - 12质粒载体系统。虽然基因克隆技术的使用病毒载体在不同的细节，参与的原则是相似的。基本要求体外转染和表达外源基因在宿主细胞中概述图3.6和图3.7和可归纳如下：（1） 孤立的质粒脱氧核糖核酸分子，必须包含一个网站，整合外源基因不会破坏基本功能。（2）新一代的基因片段，克隆的方式适用于限制性内切酶。可插入一个染色体片段从另一个微生物（原核生物或真核生物），从动物或植物，或从化学合成的脱氧核糖核酸序列。（3）拼接的方法，外源基因的载体。（4）纳入混合基因重组进入宿主细胞。（5）表达的转化（转化子），重组质粒。因此，一个主要特点，这种新的遗传技术，它允许相当大的控制权的片段被克隆和可以使用基本的任何片段从任何生物体。质粒。基本的这一新技术的质粒。质粒可以稳定遗传的基本分子没有被链接到染色体。它们是重要的医药和农业因为他们赋予抗生素耐药性的病原体的人和动物，可以规范毒素和其他蛋白可能增加毒力的这种病原体。他们也很重要，因为有些可能参与固氮根瘤菌属。而其他人可以代码为范围广泛的代谢活动，使某些细菌降解化合物可能成为环境污染物，质粒分子双链脱氧核糖核酸存在的共价闭合环状分子（中心）的宿主细胞。分子量质粒的范围从1106至200106。接合质粒可以自我复制到另一个从一个细菌可以通过件染色体细菌插入序列和转座子。也可以携带质粒。质粒可以用来作为载体，克隆基因。质粒携带耐药基因被称为电阻（R）质粒和一定的大肠杆菌耐药质粒已被用来作为载体。一个最最常用的质粒克隆大肠杆菌基因是pBR322赋予抗氨苄青霉素和四环素。质粒脱氧核糖核酸可以被孤立的溶藻细菌细胞分离质粒染色体脱氧核糖核酸在氯化铯梯度含有溴化。一些较小的质粒等关口电致发光是维持在高拷贝数在宿主细胞，因此可以合成大量质粒编码的产品，因为每个细菌载有多个拷贝的基因的兴趣。当细胞治疗氯霉素（氯霉素改编），其中有选择性地抑制染色体的复制，有进一步的实质性的选择性扩增质粒脱氧核糖核酸。对pBR 322质粒包含复制因素的关口E1-related质粒pMB1，氨苄青霉素抗性基因质粒受体1（TN3）和四环素耐药基因的质粒pSC 101作为选择标记。它包含单一卵裂网站至少十种内切酶。限制性内切酶。微生物能够区分自己的脱氧核糖核酸，这是从其他来源。该系统已发展到实现区分自我和非自治领土依赖于类型的酶在细胞：改性甲基化酶和限制性内切酶。该甲基化酶添加甲基组在一个特定的方式各种核苷酸残基的新生的双链脱氧核糖核酸链。这样的识别序列通常是从四到七碱基对的长度，回文，即，在一个链序列的双链DNA是相同的互补链。大多数生物体拥有一些不同的改性甲基化酶。限制性内切酶识别相同的序列作为修饰酶，而甲基化，减少脱氧核糖核酸序列的核酸内切酶。然而，不会削减自我序列，但会降低外国的脱氧核糖核酸。此属性的识别和切割的特定序列的双链核酸已成为基础切除片段从大多数类型的生物体。不同类型的限制性内切酶发生，即类型，和。只有型是重要的新技术。型限制性内切酶有特殊重要性因为他们是序列特异性，可以创建双链断裂位置准确的双链脱氧核糖核酸。这样他们打破长期外源基因分子成较小的部分以及一个打破质粒载体在网站上的片段可以插入一些这些酶。断裂，产生单链末端和碱基序列这些总站将是相同的所有碎片产生的一个特定的限制核酸。这种方式在任何片段所产生的具体内切酶可以与任何其他片段的碱基对的切割相同内切酶和退火，从而创造一个混合分子。由于许多限制性内切酶现已从细菌范围标准术语已被采纳。属和种的名字的宿主生物体被确定的第一个字母的属和第一个字母的物种形成的一三字母缩写斜体，e.g.e.coli，生态。应变或类型识别是在非斜体的符号（限制性）和数量的内切酶酶切罗马数字。不同的酶可用于产生不同大小的基因具有不同的3 -或5-四单链延伸。基因就可以纯化电泳。水解单靶位点的限制性pBR 322，或任何限制性内切酶有一个单一的目标网站，转换为线性质粒脱氧核糖核酸分子。网站所承认的最型限制性内切酶有2倍对称轴：他们可以是四，五或六核苷酸序列。酶裂解基因可以创建钝端或粘性，粘性末端的其中几个未配对的碱基终止在3 -羟基或5-磷酸组织工程的目的。许多最有用的限制性内切酶识别四或六核苷酸重复的网站。因此，后酶克里弗斯在中间的一六个碱基对的序列fig.3.8g（a）会导致形成的钝结束的脱氧核糖核酸分子，才能加入低效率脱氧核糖核酸连接酶。限制性克里弗斯承认网站远离中心fig.3.8（b），因为回文性质的酶识别位点的原因形成双链脱氧核糖核酸片段的单链末端或粘。混合物时，这些碎片是混合氢键之间发生碱基互补的单链序列和目的成为。一个特定的序列序列应该发生在平均每4096（46）个碱基对。所产生的碎片一个内切酶识别四核苷酸序列会的平均长度为256碱基对的：注意，样品的数量要求代码为一个典型的蛋白分子质量约为1000个核苷酸长35000。基因片段的克隆也可能获得比其他使用限制性内切酶：这些包括机械剪切，超声波，化学合成，或通过使用酶逆转录合成的复制基因（三脱氧核糖核酸）从真核细胞信使核糖核酸模板。这最后一种方法克服的问题，内含子或干预序列的特点是大多数基因在高等真核生物。这些内含子无法删除在转录的基因在细菌而在真核表达他们被删除的剪接初级转录（转录本）的基因。加入载体。 插入并连接到载体的基因片段可以通过多种方法。治疗混合物脱氧核糖核酸片段的大肠杆菌或噬菌体脱氧核糖核酸连接酶将产生共价键之间的联系的克隆载体和核酸分子，共价磷酸二酯键之间将形成碎片有退火对方的粘性末端。一个更有效结扎的方法的钝端”或“平端结扎fig.3.8（a）。在这种情况下的脱氧核糖核酸分子没有预测（突出）单链脱氧核糖核酸和脱氧核糖核酸末端需要高浓度的酶和有效结扎。然而，此方法允许的范围更广内切酶用于增加了一系列的基因进行研究，当这种混合形成了它不能被切割的任何的内切酶，被用来生成原始片段。这种潜在的缺点是可以克服使用连接，即短期合成多核苷酸包含一个或多个内切酶识别序列。许多连接现已允许容易修改基因片段的总站。使用连接序列允许钝端结扎的连接到脱氧核糖核酸片段之后卵裂的连接合适的内切酶的形成具体的总站必要fig.3.8（丙）。这样的克隆片段容易被再液化从重组质粒消化正确的内切酶。一个更少的使用方法包括增加一个尾几个脱氧鸟苷残留的3 -端的矢量和脱氧胞嘧啶核苷酸残留的3 -端插入形成互补的单链扩展插入和载体。连锁发生的碱基互补配对。新产品p1us质粒插入片段称为质粒嵌合体。转型。技术引进基因注入细菌长期以来一直赞赏和可能涉及的染色体或质粒转染时发生。噬菌体是参与。在一个典型的质粒转化实验将有一个极其异构混合物分子中只有一小部分组成一个单一的载体分子连接到一个单一的基因片段在大肠杆菌。用于转化的分子混合细菌细胞已取得主管（感受态）或渗透通过暴露于冷氯化钙溶液（0.1M）。细胞然后加热到37保持5分钟让基因被占用。细胞转移到肉汤和后短潜伏期（孵育）期间能够表达的功能，新获得的嵌合基因的细菌进行杂交分子。通过一个具体的筛选程序和纯化：杂交质粒孤立和特点，或新产品的分离和研究。转换效率约106克得到一微克转化克隆混合物脱氧核糖核酸。质粒载体正在开发的其他细菌，噬菌体载体和粘粒（其中包括一个正常的质粒含有粘性末端噬菌体）也可以被用来。革兰阴性菌，特别是大肠杆菌，已广泛用于基因重组工作。特殊载体已经发展为革兰氏阳性菌，尤其对枯草芽孢杆菌和霉菌菌株。广泛研究的进展将这个新的基因工程技术对真核系统，酵母是强有力的候选人，作为东道主的真核细胞克隆和双质粒用2核酸酵母和pBR 322质粒的大肠杆菌已成功地开发和使用。克隆动物细胞可以实现使用基因组的特种动物病毒，例如，猴病毒sv40.1n植物细胞克隆是不完善；钛质粒的根癌农杆菌证明是有用的。高等植物基因重组技术已被视为越来越重要的育种潜力，允许直接遗传修饰植物来提高生产力。功能表达的新基因在转基因植物尚未得到报告。一个主要原因是有限的了解的分子基础的基因在植物中表达的基因。此外，最重要的植物特点尚未确定。而人口的工程细胞是有用的产品微生物基因工程，细胞工程项目中是很少价值，如果他们不能再生到整个工厂。不幸的是，相对较少的重要农艺作物还可以再生从细胞培养。潜在的改善作物遗传是通过无疑巨大而更基本的研究需要在几乎所有地区的植物分子生物学戈瑞才能实现。鉴定转化。 在大多数克隆实验的主要部分的方案将涉及鉴定转化重组克隆。正常数量的基因改造纳入受援国主机将非常远小于宿主染色体，所以产品标识表示从转化片段将极其困难，然而，有多种方法为了确定克隆携带所需的脱氧核糖核酸序列。（1） 互补一些外来基因能够补充缺陷的副本相同的基因在染色体上的：即，他们代码正常，活跃产品，收件人是不足。例如，拉茨+基因（编码-半乳糖苷酶）将补充拉茨，-半乳糖苷酶缺乏宿主产生乳酸+收件人可以选择为红色菌落麦康凯琼脂。（2） 抗生素抗性基因，这些基因赋予抵抗抗生素通常在易感细胞，这可以体现与质粒进行基因四环素、氨苄西林耐药和转化，可以选择对媒体包含这些抗生素之一：外源基因通常是克隆到基因编码的抗其他抗生素，未经选择的抗生素。（3） 杂交一种广泛使用的方法，分析收集的重组核酸分子或细胞克隆是由殖民地或斑块杂交（噬菌斑杂交）。细胞含有重组基因转移到硝酸纤维素过滤器（尼龙膜）和溶解。纯化，补充放射性核酸杂交的互补脱氧核糖核酸在硝化纤维方向的细胞。杂交，可以用放射自显影检测。杂交的程度将反映的互补性。复制脱氧核糖核酸合成的基因模板也可用于屏幕的基因重组必将硝化棉过滤器以类似的方式。（4） 限制性内切酶分析，这种方法可以用来确定是否克隆基因产生相同大小的碎片，作为一个标准的核酸分子。限制性内切酶分析提供映射片段往往是一个先决条件，序列分析。（五）免疫学方法免疫学方法的使用也越来越多，在很大程度上取决于发展的抗体，主要是对蛋白质产品。鉴定重组脱氧核糖核酸是一种高度保密方面的工业克隆方案和大部分研究的结果将仍然享有特权的信息。这是一个不可避免的，但遗憾方面的商业重要性，这些新技术。遗传工程必须被正确地视为顶点的大框架的应用遗传学已开发成功在过去三年。然而，这当然是最令人兴奋的和潜在的最有创意的技术提供给工业遗传学家。科学和经济应用基因重组技术是无限的，包括：（一）增加产量的特定基因的产品。（二）提高利率的合成一种特定的最终产品的克隆更多的酶在生物体或通过专门改变克隆酶的定点突变（例如克隆节能氮途径从大肠杆菌为卜内门单细胞蛋白生物来）。（三）“剪裁”有机体转移特定活动的一个更理想的宿主生物体。 基因重组技术将有重大影响的医药产品在不久的将来。它现在可以将基因从哺乳动物来源为细菌和获得生产以商业规模的产品编码的这些基因的哺乳动物。化合物特别重要，包括胰岛素，人体生长激素，酶，抗体，干扰素和疫苗。时间尺度的发展和商业应用，希望将允许这些产品可后来这十年。在兽医领域新的动物疫苗的遗传工程不久将面世。虽然克隆的外源基因现在是例行的大肠杆菌，一个主要问题是，这种生物体分泌很少蛋白质分泌。蛋白质的特点是信号序列，主要由疏水性氨基酸残基决定了蛋白质的出口跨越细胞膜。在出口过程他信号肽裂解产生的蛋白或激素。这部分的问题是可以克服由大肠杆菌融合基因所需的产品与另一个外源基因的基因产品出口；另一种方法是使细胞更漏。然而，其他细菌、如枯草芽孢杆菌，其中正成为越来越多地用于基因工程和排泄超过50蛋白质，无疑会找到更多的使用在工业应用中的外源基因的克隆。 在长期的最有潜力的基因重组技术应在农业部门的可能性。固氮基因的细菌进入重要的作物比其他豆类正在积极研究。同样的可能性转移结构基因控制固氮根瘤菌豆科植物协会也正在研究。 在未来的许多其他生物技术领域，包括能源和化工原料和废物处理将受益于应用能力的遗传学家，产生理想的生物所需的目的。虽然现在有许多遗传操作，可以进行生物体，值