水孔蛋白.doc

植物水孔蛋白的生理功能及其基因表达调控的研究进展龚川 四川师范大学生命科学学院 成都 610101摘要：在植物细胞的原生质膜和液泡膜上存在水孔蛋白，它们在啦分长连运输、渗透调节等方面具有重要的生理作用 在植物组织中水孔蛋白的分布与其生理功能具有密切的关系t鳊码水孔蛋白的基因的表逮受环境因子的影响，存在多种调控机理。继续对植物水孔蛋白的生理进行研究具有重大的实际意义。关键词：植物；水孔蛋白；生理功能；调控机理Advances in the Physiological Functions of Aquaporins in Plants and Their Expression Regulationchuan gong college of life science，Sichuan Normal University Chengdu610101Abstract：There are some aquaporins in plasma membranes and tonopasts of plant cells，and theyplay some important physiological roles in long-distance water transportation，osmoregulation，and soonThere are close relationship between their distributions and physiologica1 functionsThe expressions of the genes that encode aquaporins are regulated by some environmental factors，and there aresome regulatory mechanismsThe continuous studies on the physiological functions of aquaporins are significant practicallyKey wards：plants；aquaporins；physiological functionsregulatory mechanisms水分穿越膜系统的方式，长期以来一直认为是由静水压和渗透势共同驱动的自由扩散。理论上讲，水分子以扩散作用通过排列紧密的膜脂双分子层时速度应该很慢，且需要很高的表面活化能，但事实是生物膜对水有很高的透过性，所以，仅凭扩散作用水分的迅速跨膜运输是难以实现的 。直到20世纪80年代后期水孔蛋白的发现，人们才认识到水分除了通过膜脂双分子层的间隙进入细胞外，还可通过水孔蛋白中的水通道进入细胞。1 水孔蛋白的发现人们首次在脊椎动物中发现了水孔蛋白。1 987年，Agre等分离了红细胞Rh血型抗原中跨双分子层的多肽成分，在用考马斯亮蓝染色时，有一种28 kD的多脯着色很少。起初他们认为这种多肽是Rh细胞的蛋白水解片段 随后，Denker等 ”对这种多肽进行了生物化学鉴定，最初的研究表明这种蛋白质由疏水性氨基酸组成，并以两种形式存在：28 kD的未糖基化的多肽和40 60 kD的N一糖基化的多肽。后来人们把这种独特的多脯命名为水孔蛋白口。 早在2O世纪60年代初，Ray：” 和Dainty 就发现在植物膜中可能存在水通道。后来在植物中分离了许多水孔蛋白。2 水孔蛋白的结构 晶体学和拓扑学的研究表明，水孔蛋白具有MIP家族典型的结构特征， 由5个短环连接的6个亲水的跨膜螺旋及N端和C端组成。其N端和C端及B、D环面向细胞质一侧。水孔蛋白在跨膜区及B、E环的氨基酸序列相对保守，而N端和C端的变化相对较大。B、E环各自含有一段高度保守的氨基酸序列AsnProAla，称为NPA盒，它们直接参与了水通道的形成；同时B环和E环各自形成半个跨膜螺旋(HB、HE)，参与水孔蛋白活性的调控(Chaumont等2005)。E环NPA盒前的半胱氨酸是水孔蛋白的汞抑制部位； 汞离子和有机汞可以通过与半胱氨酸结合而封闭水通道。虽然研究表明水孔蛋白单体即有水通道的活性， 但在活体生物膜上通常以四聚体的形式存在， 组成水漏状结构(侯彩霞等1997；于秋菊等2002)。也有少数以二聚体或单体形式存在(朱美君等2000)。水孔蛋白的活性受PH值、Ca2+、重金属离子(HgC12、AgNO3和HAuC14)、磷酸化、多聚化和异源蛋白间相互作用等影响(Niemietz和Tyerman2002；Fetter等2004；Kaldenhof和Fischer 2006；Hedfalk等2006)。生长激素(脱落酸、赤霉素、油菜内酯)、蓝光、盐分、干旱及病原微生物的侵染也均能诱导水孔蛋白基因的表达。3 植物水孔蛋白的功能 31 介导水分的快速跨膜转运植物许多生理过程的发生需要大量的水分子快速进出细胞， 如种子萌发、根及下胚轴的伸长以及韧皮部的物质转运(Eisenbarth和Weig 2005；Fraysse等2005)。水孔蛋白基因的表达通常与上述生理过程具有同步性，并具有组织特异性。在种子成熟的晚期， 拟南芥 TIP在蛋白贮藏囊泡上特异性表达：在种子萌发及幼苗初期，伴随蛋白贮藏囊泡内物质的分解和吸收， TIP逐渐消失，而*-TIP积累增多(于秋菊等2002)。P JP 在豌豆(Pisumsativum)种子的种皮中特异性表达；P P J 在干种子中高效表达， 可能与P 2 共同参与种子吸水萌发过程(Schuurmans等2003)。蓖麻(Ricinus communis)RcPIP2；1参与幼苗下胚轴的伸长生长(Eisenbarth和Weig 2005)。拟南芥A删 2在根中优势表达， 其突变体根部皮层的导水力(hydraulic conductivity)下降25-30 (Javot等2003)。抑制烟草质膜NtAQPI的表达，导致根细胞的导水力下降55 (Siefritz等2002)。珊瑚轮藻(Chara corallina)节间水通道的关闭可导致细胞导水力降低75 (Henzler和Steudle 20001吴安慧等2006)。在番茄(Lycopersicon esculentum)果实发育和种子形成的过程中，7个LePIPI和LePIP2；2在早期表达量上升， 后期则逐步下降(Shiota等2006)。棉花(Gossypium hirsutum)GhAQP1在胚珠中特异性表达，开花后9 d表达量达到最高，随后逐渐下降；胚珠发育到2030 d时，GhAQP1表达活性丧失(李登第等2006)。棉花开花后815 d是胚珠发育最为迅速的阶段，这表明GhAQPI的表达模式与胚珠的发育相协调， 对促进胚珠细胞的迅速分裂和膨大有意义。32 参与气孔运动 拟南芥AthH2基因在气孔保卫细胞中高效表达； 向日葵(Helianthus annuus)SunTIP7和SunTIPO在保卫细胞中表达，前者在气孔关闭时表达上调， 后者表达量保持不变(Sarda等1997)。蚕豆(Vicia faba)BBAQ1在蚕豆保卫细胞中专一表达，而在其他表皮细胞中几乎没有表达(Sun等2001)。菠菜(Spinacia oleracea)SoPIP1：1定位于保卫细胞上(Fraysse等2005)。上述研究表明水孔蛋白参与气孔的运动。保卫细胞膜上的水孔蛋白可能作为渗透压感受器， 而与某些离子通道(如K 、C1一)相耦联(MacRobbie 2006)。在低渗条件下， 内向水流通过液泡膜上的水通道，促使水孔蛋白构象发生改变并激活与之耦联的离子通道，导致保卫细胞液泡内大量离子外流， 细胞收缩引发气孔关闭。33 参与叶肉内CO2的运输1998年，诸多研究表明哺乳动物AQP1能够介导CO，的运输，于是人们推测植物水孔蛋白可能也有运输CO，的能力(Tyerman等2002)。Terashima和Ono(2002)报道，在HgC12存在下叶肉细胞对CO2的导度(internal CO2conductance，gi)急剧下降，降幅达30一40。但他们实验中使用的HgC1，是大部分水孔蛋白的活性抑制剂，无专一性，且HgC1，具有毒性，存在许多副作用， 因而用上述结果作为证据并不充分。随后，Uehlein等(2003)用爪蟾卵母细胞证实NtAQP1能够提高细胞膜对CO，的通透性，初步揭示植物水孔蛋白有介导CO，运输的功能。在水稻(Oryza sativa)中过量表达大麦HvPIP2；1后，叶肉细胞对CO：的导度提高， 叶片内CO 的扩散速率增强，进而植株对CO：的同化效率提高(Hanba等2004)。最近，Flexas等(2006)在烟草中证实内源性水孔蛋白NtAQP1介导CO，在叶肉内运输。NtAQP1在烟草中过量表达后，叶肉对CO，的导度提高20，在饱和光照下，转基因植株的光合作用速率提高20；而在同样的条件下反义植株的叶肉对CO2的导度和光合作用速率分别下降13和30。这些实验在一定程度上说明，植物水孑L蛋白可通过介导CO，在叶肉细胞间的转运，有效调控CO：的导度， 从而影响光合作用效率。在烟草中过量表达AtPIPlb(AthH2)后，其生长速率和蒸腾速率均显著加快，值得注意的是，转基因植株上、下表皮的气孔密度和光合作用效率也分别增加约22 、17 和35 (Aharon等2003)。Aharon等(2003)将其归因于高水平的AtPIP 1 b含量导致水分消耗加剧和代谢加强。但Hanba等(2004)在HvPIP2；1运输CO，的实验中也曾观察到蒸腾速率的增加，甚至植物蒸腾速率的加快还导致植株的叶片结构产生适应性变化，表皮增厚，叶肉细胞密度增加， 成熟的后角组织增多。由于Aharon等(2003)没有测定叶肉细胞对CO2的导度，因而还不能排除AtPIP1b也有运输CO2的能力。34 调节植物对中性分子(甘油、NH 、尿素)和营养元素(硼、硅)的吸收甘油对于植物细胞的渗透调节有作用，其代谢中间产物也有一定生理意义，如磷脂酰甘油即与植物的抗冷性有关。Rivers等(1997)报道Nod26能够运输水分和甘油， 同时还发现它也能运输甲酰胺。Biela等(1999)发现烟草NtAQP1(属于PII)1类)能同时运输水分和甘油。Gerbeau等(1999)报道，烟草NtTIPa除了可运输水分外，还能介导甘油和尿素的跨膜转运。拟南芥AtNLM1(AtNIP1；1 和AtNLM2(AtNIP1；2)在酵母中表达时具有运输甘油的能力，细胞外甘油浓度达100 mmo1L。时，运输即达到饱和程度(Weig和Jakob 2000)。豌豆PsNIP一1是水一甘油通道，而PsPIP1；1可能运输甘油和甘氨酸(Schuurmans等2003)。由这些可见，除SIP和PIP2外，植物中的TIP、NIP和PIP1均具有运输甘油的能力。植物中存在专一性的NH 转运载体， 即AMTMEPRh蛋白家族(Loqud等2005)。但氨在植物细胞内的运输则可能依赖于水孔蛋白。大豆根瘤中类菌体外周膜对NH 的通透性能为HgC12部分抑制，于是推测Nod26能够运输NH (Niemietz和Tyerman 2000)。在爪蟾卵母细胞中表达小麦(Triticum aestivum)TaPl2 ，可显著提高膜对NH1的通透性(Holm等2005)。拟南芥AtTIP2；1和AtTIP2；3运输NH 的能力随PH的升高而增强(Loqud等2005)。将拟南芥从仅含硝酸盐的培养基上转移到同时含硝酸盐和氨的培养基上后，AtTIP2；，与AtTIP2；3的表达迅速上调，且Af刀P2 ，的表达量与液泡内氨的浓度变化相一致， 说明AtTIP2；，与AtTIP2；3能够对外界氨的积累迅速作出响应， 并介导氨从细胞质向液泡的转运。但AtTIP2；，在拟南芥中的过量表达并未使植株耐受甲基胺毒害的能力增强， 根中氨与甲基胺的浓度与野生型的也无差异，表明植物对土壤中NH 的吸收并不直接依赖于水孔蛋白， 而是首先由AMTMEPRh蛋白将其转运进入根细胞后，再由水孔蛋白以NH 的形式从细胞质内向液泡中运输贮存。目前对于水孔蛋白运输NH 的分子机制主要有2种观点，一种认为NH 分子进入水通道后被质子化，然后以NH 的形式释放到膜内并贮存起来(Holm等2005；Kaldenhoff和Fischer 2006)；另一种认为膜外的氨只能以NH 的形式穿过水通道，进入膜内后再被质子化并贮存(Loqu等2005)。由于pH对水孔蛋白活性的调控是通过使D环内组氨酸质子化而引起蛋白质构象变化来实现(Hedfalk等2006)， 因此推测前一种观点可能较正确。在水孔蛋白介导的NH 运输过程中，其质子化状态可能处于动态变化中。首先水孔蛋白被质子化，使得NH 分子易于进入水通道， 随后质子被传递给NH 形成NH ，水孔蛋白去质子化引起构象改变，使NH4释放到膜内。 Klebl等(2003)和Liu等(2003)采用酵母突变株相继证实AtTIP2；l、AtTIPl；l、AtTIPl：2、AtTIP4；l和西葫芦(Cucurbita pepo)CpNIP1能有效地运输尿素分子。有人认为植物对尿素分子的吸收需要质子一尿素共转运载体DUR3和水孔蛋白协同转运，其中水孔蛋白介导的尿素分子的运输主要发生在液泡膜上， 即尿素分子通过水通道进入液泡内贮存(Kojima等2006)。由于水孔蛋白对NH和尿素的运输主要集中在TIP类，因此Kaldenhof和Fischer(2006)推测TIP可能与植物体内的尿素循环和氨基酸合成代谢有关。 硼能够稳定植物细胞壁和细胞膜，在细胞壁中，硼与鼠李糖半乳糖醛酸聚糖II (rhamnogalacturonan II，RGII)形成复合体，并连接果胶多肽形成网络。缺硼能抑制细胞壁的合成， 以致细胞分裂和伸长受阻；抑制花的发育，导致结实率下降，果实发育畸形；引起雄性不育，种子发育异常(Dordas等2000)。由于硼的再利用程度很低，因此植物必须通过根不断从土壤中以硼酸的形式吸收硼元素。Dordas等(2000)报道，南瓜根细胞质膜微囊对硼酸的通透性较微粒体膜高6倍，且受HgC1，部分抑制； PJ在爪蟾卵母细胞中表达后， 细胞膜对硼酸的透性增加30 。Takano等(2006)的研究表明，AtNIP5；1在爪蟾卵母细胞中表达后，膜对硼酸的通透性增加59倍；当培养基中硼酸浓度从l00 lamo1L 降低到01 lamo1L 时，AtNIP5；1的转录上调近l3倍。T-DNA插入突变的研究还表明，AtNIP5；J突变株在硼缺乏情况下不能正常生长， 只有当外界硼酸浓度不低于30 lamo1L 时，突变株表型才相对正常。说明AtNIP5；l对拟南芥硼代谢有意义，也表明植物对硼的吸收同时依赖于被动扩散和水孔蛋白介导的主动运输。3.5 对细胞的渗透调节作用 水孔蛋白存在于不同类型细胞的液泡膜上，这表明许多植物细胞具有高度的液泡膜水分渗透性 液泡膜上的水孔蛋白能减少对跨细胞水分运输的液泡阻力 ，在烟草悬浮培养细胞和洋葱表皮细胞中，液泡膜的渗透性为原生质膜渗透性的100倍，这表明水孔蛋白在液泡膜上水分运输方面具有另外一种作用。在许多成熟的植物细胞中，液泡占据细胞内大部分体积，而原生质仅仅占据液泡与原生质膜之间的狭小空间。液泡膜上无限制的水分运输可以使植物细胞有效地利用巨大的液泡空间来缓冲细胞质内的渗透漩动 这样就可以避免细胞质的坍塌或膨胀，尤其是在细胞问隙的某些变化引起细胞内渗透发生突然变化的时候，这种作用更为突出。在拟南芥细胞中，质膜体(plasmalemmasome)深深地突人到液泡之中，原生质膜水孔蛋白聚集于质膜体上272，这可能有利于液泡和质外体之间进行水分交换，而细胞质的渗透波动很小因此，在植物细胞中水 L蛋白具有很强的渗透调节功能，而这种功能与这些细胞的典型区室化(compartmentation)有直接的关系。4 水孔蛋白的调控4.1 基因表达尽管水 L蛋白存在于植物的绝大部分组织中，但是每一种水 L蛋白的同工型的分布受到生长发育和生理的严格控制，也显示了其独特的作用 例如，拟南芥8一TIP和烟草pRB7两种水孔蛋白在维管组织中的薄壁细胞中优先表达，它们可能涉及到水分的长途运输 ” ，而拟南芥PIPlbAthH2和7 TIP则与伸长和细胞分化有关 “ -。表1显示，水孔蛋白在植物体内的表达受环境条件(如干旱、盐分)和植物激素(如ABA、GA )的调节。水 L蛋白基因的正调节或负调节尤其令人感兴趣，这表明在胁迫条件下这些蛋白质在调节整株植株的水分平衡中起到重要作用 所有这些因子能相互作用从而使每一种水孔蛋自具有生理上相关的表达格局。例如，-gTIP在伸长组织中优先表达，在经过GA 刺激后也优先表达 TobRB7的启动子含有两个独特的顺式作用调节元件，在正常生长条件下以及在根节线虫侵染之后，它们指示根特异性表达 。4.2 翻译后修饰 菜豆种子中的 TIP能被液泡膜结台的依赖于钙的蛋自激酶磷酸化，菠菜叶片中的原生质膜上的水孔蛋白也能被磷酸化而对外质体水势作出反应 以植物水 L蛋白为对象的蛋白酶和蛋白磷酸酶提供了水分运输和涉及植物细胞的渗透调节的信号级联放大(signaling cascades)之间的有效联系。人们研究了Xenopus卵细胞aTIP的磷酸化的功能意义 “。在此研究过程中，Maurel等-“ 使用了一系列特殊位点的 TIP突变蛋白质，这些突变蛋白质中的3个假想的磷酸化位点单个或联台地被分裂 他们对这些突变蛋白质进行了平行功能检验，其结果表明，这3个位点的直接磷酸化能使 TIP的水通道活动增加l00%150% 。根据这些结果，可以认为水孔蛋白的磷酸化可原位控制水通道的开闭 此外，这可能为亚细胞蛋白质运输提供了信号。水孔蛋白中还发生另一些翻译后修饰，如南瓜种子中的蛋白水解成熟(从较大的前体23 kDTIP而来)。这可能是另一些调节水孔蛋白表达和活动的新奇机理。4.3 其它调节机理 在Chara细胞中，内渗透水传导率和外渗透水传导率能分别被pCMBS和K 通道阻断剂nonyhriethylammonium 所抑制。这表明存在于细胞两极的水孔蛋白的独特的类型和调控，也这可以解释细胞运输水分的极性。一些巨细胞藻类如柔曲丽藻(Nitella fzexilis)和囊状法囊藻(galonia utricuZarls)对水压梯度或渗透压梯度作出反应而调节其L 。在柔曲丽藻中，细胞内和细胞外渗透压分别使其膜的水压阻力增加100和30 在伊乐藻(Elodea densa)的叶细胞中，膜的行为依赖于压力，而在另一些藻类中则不存在 依赖于膨压和浓度的水分渗透性对于植物细胞的水分关系而言是非常重要的，但其分子机理仍不清楚。这种现象似乎与水分极性运输有关，因为在较高的渗涨度(tonicity)下极性更强。一些涉及脂膜伸展或折叠、压迫、或脱水的相似机理可以解释这两种现象。5 结束语植物水孔蛋白的发现是植物水分生理学研究的重大进展 这种发现为生物膜(原生质膜和液泡膜)对水分的被动渗透作用提供了分子生物学基础，使人们更加重视生物膜、细胞以及组织水传导率的观念，为人们了解水分传导率的作用和复杂性开辟了新的前景。尽管目前尚没有成功的克隆植物或动物水孔蛋白基因的报道，但随着研究的深人，人们将更加了解水孔蛋白在水分传输方面的作用，这对于解决实际问题(干旱胁迫和盐胁迫)具有重大现实意义 人们已经知道，蛋白质磷酸化作用是干旱胁迫的重要调节因子，而干旱胁迫的信号传导可能涉及MAP 激酶级联放大，因此，水孔蛋白是否是这个级联放太的下游目标将是人们下一步的研究方向。参考文献侯彩霞，黄吴，汤章城(1997)植物细胞的水孔蛋白植物生理学通讯，33(2)：151156李登弟，黄耿青，谭新，王杰，王秀兰，许文亮，吴雅洁，汪虹，李学宝(2006)棉花GhAQP1基因克隆及其在胚珠发育中的特异表达植物生理与分子生物学学报，32(5)：543550吴安慧，张岁歧，邓西平，山仑，刘小芳(2006)水分亏缺下玉米根系ZmPIP1亚族基因的表达植物生理与分子生物学学报，32(5)：557562于秋菊，吴锖，林忠平，李景富(2002)植物水孔蛋白研究进展北京大学学报(自然科学版)，38(6)：855866朱美君，陈珈王学臣(2000)玉米根细胞质膜水孔蛋白的鉴别、分布及其功能科学通报，45(4)：407 ll1 Maurd cReizer JSchroeder J1eta1The vacuolarmembrane protein 7 TIP Creates water specific channdsinxP 0p“s0。cy sJEMB()J1 99312：224l22472： Agre PSasaki SChrispeels M JAquaporins：a family of water channel proteinsJl Am J 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