企业培训_高效液相色谱法基本知识培训-化验员入门培训

高效液相色谱法 第一节高效液相色谱的定义及基本参数 定义 高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱 对供试品进行分离测定的色谱方法 注入的供试品 由流动相带入色谱柱内 各组分在色谱柱内被分离 并依次进入检测器 由积分仪或数据处理系统记录色谱信号 基本参数 一 保留值保留值是用来描述样品组分在色谱柱中保留程度的参数 并作为色谱定性的指标 其表示方法有保留时间 保留体积 调整保留时间和调整保留体积 保留时间和保留体积 一般认为 当进样量很小时 样品从柱中流出呈高斯曲线分布 从进样开始到峰极大值所需时间时间称为保留时间 以tR表示 由于流出时间与流动相流速成反比 因此又可用保留体积作为保留值参数 以VR表示 VR tR FC式中 tR为保留时间 min FC为流动相流速 ml min 某一组分的保留体积就是该组分从柱中流出所需流动相体积 一般情况下常以ml为单位 细内径柱和毛细管柱 由于所需流动相流量很小 FC的单位用 1 min表示 此时VR可采用为 1单位 不保留物质流出时间以tM表示 又称死时间 而tM FC即为保留物质死体积 简称死体积 VM 死体积不仅与柱结构有关 而且与进样系统 检测系统的体积有关 只有当柱外体积忽略不计时 tM FC才表示柱内流动相所占的体积 以VM表示 任何色谱过程的基本保留方程式为VR VM KVS式中 K为平衡分配系数 VS为固定相体积 Vm为柱内流动相所占体积 当柱外体积不容忽略时 Vm表示柱内空隙及柱外体积之总和 溶质的色谱保留行为主要是由该溶质在固定相和流动相中的平衡分配系数K所决定的 而K是溶质在两相间达到平衡分配时性质上的度量 其定义为 溶质在两相间达到平衡时在固定相和流动相中的浓度比 K 溶质在固定相中的浓度 ms Vs ms Vm溶质在流动相中的浓度 mm Vm mmVs式中 ms mm分别为溶质在固定相和流动相中的质量 调整保留时间和调整保留体积 扣除死时间或死体积的保留值 定义为调整保留时间 t R 和调整保留体积 V R 如下式所示 t R tR tMV R VR VM保留值是色谱过程热力学的重要参数 当色谱操作条件一定时 不同物质的有其特定的保留值 这是色谱定性分析的基本依据 在液相色谱中 由于流动相参与了溶质分配过程 因此 样品组分的保留值不仅与固定相的性质有关 而且受流动相性质变化的影响很大 因此研究液相色谱中流动相组成对保留值的影响 是分离条件最佳化的基础 容量因子 k 容量因子是色谱法中广泛采用的保留值参数 它是样品组分的质量在两相中分配的比值 定义为k 固定相中溶质的质量 ms k Vs流动相中溶质的质量 mm VmVR Vm k Vm Vs Vs Vm k Vms Vms 1 k 式两边除以冲洗剂流速Fc则得tR tM 1 k k tR tM 1 tR tM可见 容量因子就是调整保留时间与死时间的比值 在液相色谱中 k 只与固定相 流动相性质及柱温有关 而与流速和柱尺寸无关 理论塔板数n和塔板高度H 理论塔板数n是反映物质在固定相和流动相中动力学特性的重要色谱参数 它是代表色谱柱分离效能的指标 计算公式为 n 16 tR W 2 5 54 tR Wh 2 2tR为保留时间 W为峰宽 Wh 2为半高峰宽塔板高度H计算公式为 H L nL为色谱柱长度 分离因子 及分离度 R 1 分离因子 k2 k1 tR2 tR1 代表了二个物质在相同的色谱条件下的分离选择性 物质的化学性质或结构上的差异 反映在与固定相和流动相之间作用力也有所差异上 这就是色谱分离的基础 改变 是改变后一组分相对于前一组分的保留时间 的改变可以选择不同的固定相或流动相来实现 但改变固定相在液相色谱中比较麻烦 如在一个色谱系统中 用二根不同固定的柱子 则又必须考虑到流动相的适应性 比较行之有效的办法是改变流动相的极性 如采用连续改变流动相极性的梯度洗脱或温度程序等方法来提高分离选择性 2 分离度 R 用于评价待测组分与相邻共存物或难分离物质之间的分离程度 是衡量色谱系统效能的关键指标 可以通过测定待测物质与已知杂质的分离度 也可以通过测定待测组分与某一添加的指标性成分 内标物质或其他难分离物质 的分离度 或将供试品或对照品用适当的方法降解 通过测定待测组分与某一降解产物的分离度 对色谱系统进行评价与控制 无论是定性鉴别还是定量分析 均要求待测峰与其他峰 内标峰或特定的杂质对照峰之间有较好的分离度 除另有规定外 待测组分与相邻共存物之间的分离度应大于1 5 计算公式为 首先 可以通过增加分离因子 值的方法提高分离度 可通过以下方法实现 1 改变流动相的组成 2 改变流动相的pH值 3 改变固定相的种类 4 改变分离温度 其次 提高理论板数 N 可以提高分离度 1 柱长增加1倍 柱效也增加1倍 但相应的分离时间也增加1倍 2 减少固定相粒径 可以提高柱效 相应的柱压增高 可进行快速分离 第三 提高容量因子 k 方法提高分离度 可通过以下方法实现 1 调节流动相极性 pH值 离子强度等 2 梯度洗脱 另外 如果k 值过大 会造成分离时间过长 并且谱带扩散严重 因此 比较适宜的k 值范围为1 k 10 拖尾因子T 用于评价色谱峰的对称性 为保证分离效果和测量精度 应检查待测峰的拖尾因子是否符合各品种项下的规定 重复性 用于评价连续进样中 色谱系统响应值的重复性能 采用外标法时 通常取各品种项下的对照品溶液 连续进样5次 除另有规定外 其峰面积测量值的相对标准偏差应不大于2 0 采用内标法时 通常配制相当于80 100 和120 的对照品溶液 加入规定量的内标溶液 配成3种不同浓度的溶液 分别至少进样2次 计算平均校正因子 其相对标准偏差应不大于2 0 第二节化学健合相色谱 在液相色谱中 液一液分配色谱 liquid liquidchromatography LLc 具有较高的分离效能和温和的色谱条件 但最大的缺点是担体表面涂渍的有机液相容易流失 并污染分离后的组分 化学键合固定相是克服这一主要缺点而产生的 它的出现 使得以液 固吸附色谱和液 液分配色谱为主要操作模式的液相柱色谱大量地被键合相色谱所取代 某些离子型化合物也改用了离子交换键合相或反相离子对色谱进行分离 因而 化学键合相色谱是现代液相色谱中的一个重要方法 特点 一 柱子不 娇 化学键合相是借助于化学反应的方法 将有机分子以共价键连接在色谱担体上 因此 在很大程度上减弱了表面活性作用点 清除了某些可能的催化活性 从而减少了复杂样品的表面上的不可逆化学吸附 使得操作简化 峰形对称 对溶剂中微量水分含量的变化要求不苛刻 此外 溶剂的残留效应小 梯度冲洗平衡快 和液 固色谱相比较 流动相可用价廉的甲醇 水混合液 二 耐溶剂冲洗这是传统的液 液分配色谱逐渐被键合相色谱 bondedphasechromatography BPC 取代的根本原因 在现代液相色谱发展的初期 常和气相色谱一样 把有限的几种固定液 例如 氧二丙腈 聚乙二醇 角鲨烷等涂渍的担体表面上 用一种性质相差很大的溶剂冲洗 进行LLC分离 由于两种完全互不相溶的溶剂体系实际上几乎不存在 因而在LLC中固定液相的流失就十分严重 为了克服这个缺点 曾采用流动相预先被固定液饱和 以及柱前增加预饱和柱的方法 但这样做既不方便 柱系统的稳定性也差 化学键合相是通过化学反应将有机分子键合到担体上 因而具有不可抽提性 也就是不存在固定液流失问题 使得柱寿命大大延长 并且扩大了可用溶剂的范围 三 热稳定性好这一点在气相色谱中很重要 每种固定液有最高使用温度 例如十八烷作为固定液时 只能在常温下使用 但十八烷基键合相的流失温度在200 以上 在HPLC中 热稳定必也有一定意义 因为某些分离是升温条件下进行的 四 表面改性灵活 容易获得重复性的产品改变键合用有机硅烷 可以得到不同键合相的填料 以适用于各种类型的试样分离 有助于提高分离选择性 分类 化学键合相的分类可以有不同的依据 按键合相的表面结构为单分子键合和聚合键合 按性质分为Si O C Si O Si N Si O S C 按键合有机硅烷的功能团分为极性键合相 非极性键合相和离子性键合相三种 极性键合相色谱 极性键合相指键合有机分子中含有某种极性基团 和空白硅胶相比 这种极性键合相表面上能量分布相对均匀 因而吸附活性也比硅胶低 可以看成是一种改性过的硅胶 最常见的极性键合相有氰基 CN cyano 二醇基 diol 氨基 NH2 amion 等 商品键合相以上述基团命名 如LiChrosorbNH2 LiChrosorbDiOl等 也有的商品键合相并不注明是什么基团 而是称为Vydacpolar 即氨基 或BondapaKCarbohydrate 也即氨基 等 对极性键合相来讲 一般键合表面的基团是由三部组成 键型如Si O Si C或Si O Si N 这是整个极性键合基团与硅胶母体直接相连的桥梁 主体基团一般由直链烃基或醚基所组成 其作用为使在硅胶表面与特定的极性基团之间保持一定距离 极性的端基由带极性基团 如NH2 OH 的烃基或芳基所组成 大多数情况下 极性键合相的制备分二步进行 第一步是在硅胶表面先接上一个正烃基或正芳基硅烷 然后再以相应的取代反应引入极性基团 由于空间位阻的影响 上述取代反应往往不能象均相溶液中反应那样完全 一般靠碳和氮含量来计算表面覆盖程度 上述三种极性键合相都是主要以氢键力作用 其中氰基是一种氢键接受体 而后二种兼具氢键接受体和给予体两种性能 对于有较强氢键作用力的样品 在后两种键合相上所得的k 就大 如联苯胺和苯胺 在正相洗脱的条件下 在氨基固定相上所得的k 比氰基固定相显著增大 极性键合相一般都用作正相色谱 即用非极性或极性小的溶剂 如烃类溶剂 加入适量的极性溶剂 如三氯甲烷 醇 乙腈等 以调节控制洗脱液的洗脱强度 分离组分的出峰顺序与组分的极性大小顺序相同 即极性弱的先出峰 极性强的后出峰 但对强极性的化合物 上述极性键合相也可用反相色谱 如在分离糖类或多肽化合物时 用乙腈 水作洗脱液也可以得到良好的分离效果 在极性键合相上的分离机理 有吸附和分配之争 但一般都认为吸附过程是主要的相互作用过程 通过填料表面极性基团的偶极诱导 或氢键 或静电作用和溶质分子发生相互作用 达到混合物的分离目的 离子交换键合相色谱 离子交换色谱早期都采用高分子聚合物 如苯乙烯 二乙烯苯 为基质的离子交换树脂作固定相 在高效液相色谱中 这种固定相由于溶胀性 不耐高压 以及表面的微孔型结构影响传质速率 现已逐渐被离子交换键合相所代替 在化学键合的有机硅烷分子中带上固定的离子交换基团 便成了离子交换键合相 若带上磺酸基 SO3H 羧酸基 COOH 就是阳离子交换剂 若带上季铵基 R4H 或氨基 NH2 就是阴离子交换剂 上述离子交换键合相 多以薄壳型或全多孔微粒硅胶为基质 具有较高的耐压性 化学与热稳定性 由于硅胶有好的机械强度 耐压 这类微粒型键合固定相可以高压匀浆装柱 但它对pH的适用范围只能在pH0 8 pH 9硅胶便容易溶解 特别是未键合的残留硅羟基容易生成硅酸盐 离子性键合固定相的交换容量与固定相的表面积直接有关 全多孔微粒型固定相的交换容量 一般在毫克当量的水平 薄壳型由于表面积较小 一般只有微克当量级 交换容易可用酸碱滴定法测定 在键合离子交换色谱中 流动相中往往还加入有机成分作为改性剂 溶质的保留值受流动相溶液的pH值 离子强度以及有机改性的影响 溶质的保留值兼有离子交换和吸附双重机理 非极性键合相色谱 又称反相键合相色谱 键合相表面都是极性很小的烃基 如十八烷基 辛烷基 甲基 苯基等 最常用的是十八烷基硅烷键合硅胶 又称ODS 而洗脱液大都采用强极性溶剂 水 醇 乙腈 或无机盐的缓冲液 在这种键合相色谱中 洗脱次序恰与正相色谱相反 即极性大的化合物先洗脱 k 小 极性小的化合物不易洗脱 k 大 反相色谱是高效液相色谱中应用最广泛的 个分支 其主要原因是这个操作系统的简单性和灵活性 用作流动相的水和能与水互溶的有机溶剂在价格和获取方便的程度上都比相色谱中的烃类溶剂有利 特别是化学键合固定相上样品的不可逆吸附和溶剂的记忆效应小 所以更换溶剂或梯度淋洗非常方便 更为突出的是分析对象多样化 灵活牲大大提高 第三节仪器装置 所使用的仪器为高效液相色谱仪 基本是由高压输液系统 进样系统 柱温箱 检测器 数据采集及处理等几部分构成 仪器应定期检定并符合有关规定 高压输液系统 高效液相色谱输液系统包括贮液罐 高压输液泵 梯度洗脱装置等 贮液罐及流动相 贮液罐贮液罐是一个存放流动相 洗脱液 的容器 所以其结构材料必须对流动相是化学惰性的 常用的材料为玻璃 不锈钢或表面喷涂聚四氟乙烯的不锈钢等 容积一般为0 5 2升 流动相流动相的配制应首选色谱纯试剂 水应用纯化水 流动相使用前应先用0 45 m或更小孔径微孔滤膜过滤 目的是除去溶剂中的微小颗粒 避免堵塞色谱柱 尤其是使用无机盐配制的缓冲液 其次 流动相进入高压泵前应脱气 目的是除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡 如果不去除气泡 会有以下情况发生 1 泵中气泡使液流波动 改变保留时间和峰面积 2 柱中气泡使流动相绕流 峰变形 3 检测器中的气泡产生基线波动 脱气的方法有加热法 加压法 超声去除法 惰性气体置换法及在线脱气法 反相色谱系统的流动相首选甲醇 水系统 采用紫外末端波长检测时首选乙腈 水系统 乙腈与甲醇相比较 具有以下优点 1 乙腈洗脱能力较强 40 乙腈约相当于50 甲醇 相当于30 四氢呋喃 2 乙腈具有良好的溶解能力 能使色谱峰的峰形更加对称 3 乙腈与水能够较好的互溶 并且黏度较甲醇 水小 4 乙腈的截止波长是有机溶剂中最低的 高纯度乙腈截止波长为190nm 但同时具有以下缺点 1 乙腈价格较甲醇昂贵 2 在低pH条件下 磷酸盐在乙腈溶液中溶解度较小 有研究表明 当乙腈接近50 体积分数 且磷酸盐缓冲盐达0 050mmol L时会生成沉淀 而且这种沉淀是逐步形成的 3 乙腈不很稳定 易与强酸反应 如硫酸 4 与醇类溶剂相比 乙腈毒性较大 但在正常操作下 基本是安全的 如经试用不适合时 再选用其它溶剂系统 如在上述二元流动相中加入少量的四氢呋喃 能够改善某些难分离的物质的分离度 还可加入少量有机碱类 如三乙胺等 可改善色谱峰峰拖尾现象 应尽可能少用含有缓冲液的流动相 必须使用时 应尽可能选用含较低浓度缓冲液的流动相 另外 由于C18链在水相环境中不易保持伸展状态 故对于十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的反相色谱系统 流动相中有机溶剂的比例通常应不低于5 否则C18链的随机卷曲将导致组分保留值变化 造成色谱系统不稳定 高压输液泵 高压输液泵是高效液相色谱仪中的关键部件之一 它将洗脱液在高压下连续不断地送入柱系统 使样品在色谱柱中完成分离过程 在高效液相色谱仪中 对高压输液泵的性能有如下要求 1 流量稳定 为使色谱过程具有良好的重现性 泵的输出流量要恒定 其流量精度为1 左右 2 输出压力高 由于色谱柱填料颗粒细 为使洗脱液以一定的流速流过色谱柱 泵必具有一定输出压力 不同的仪器 所使用的输出压力单位不同 最高的输出压力为500kg cm2 另外 输出压力应平衡 脉动小 有利于降低检检测器的噪音 提高信噪比和柱效 3 流量范围宽 流量可调范围大 一般在0 01 10ml min范围内任选 4 耐酸 碱缓冲液腐蚀 5 泵体易于清洗 具有梯度洗脱功能 操作方便 容易维修 目前在高效液相色谱仪中所采用的高压输液泵 按排液性质可分为恒压泵和恒流泵 按工作方式又可分为液压隔膜泵 气动放大泵 螺旋注射泵和往复柱塞泵四种 前两种为恒压泵 后两种为恒流泵 目前在高效液相色谱仪上采用最广泛的为往复柱塞泵 由驱动机构 马达 减速器 驱动凸轮 带动的小柱塞 3 4mm 在以密封环密封的液缸内 以每分钟数十次至一百多次的频率作往复运动 当小柱塞自液缸内抽出时 出口单向阀由于管路中液体的外压力迫使它关死 液体自入口单向阀吸入液缸 当小柱塞被推入时 入口单向阀关死 液体经压缩自出口单向阀排出 如此周而复始 压力逐渐上升 泵的输出流量 可借柱塞往复运动的冲程或马达的转速来调节 由于泵的柱塞往复运动的频率较高 所以对密封环的耐磨性及单向阀的刚度和精度要求很高 密封环一般采用聚四氟乙烯加添加剂材料制造 而单向阀的球 阀座及柱塞杆则用人造红宝石材料 往复柱塞泵因为它的液缸容积小 易于清洗和更换溶剂系统 因此特别适合于梯度淋洗 现已广泛应用于高效液相色谱中 但由于泵体本身的结构 决定了它的输出压力是随柱塞运动位置的变化而变化的 因此输出压力有明显的起伏脉动 为了克服此缺点 目前仪器中使用的泵 大致用以下几种方法减少它的压力脉动 采用多头泵 二头或二头以上 交替联动 压力脉动阻滞器 改进驱动凸轮的几何形状 梯度洗脱装置 梯度洗脱 又称溶剂程序 在色谱分离过程中 洗脱液的组成按一定的速率连续改变 其作用相当于气相色谱中的程序升温 由于液相色谱中洗脱液的极性变化直接影响样品组分的保留值 或k 值 因此梯度洗脱可改善复杂样品的分离度 缩短分析周期 改善峰形和提高样品的最小检测量 一般在液相色谱中 梯度洗脱比程序升温 流速程序 重复分离和联用柱等几种方法有效得多 梯度洗脱装置可分为以下两类 1 低压梯度洗脱装置低压梯度又称外梯度 它是一种在常压下洗脱液按预先规定的比例混合后 再由高压泵输入色谱柱 所以也称为泵前混合 最简单的低压梯度装置 是利用两个直角三角形容器 其几何位置不同 两种洗脱液的混合比例曲线也不同 由于其重复性差 现已很少采用 电磁比例阀的开关频率 由控制器控制 改变控制器程序 即可得到任意混合浓度的曲线 2 高压梯度洗脱装置高压梯度又称内梯度 它是将溶剂经高压泵加压后再混合的梯度洗脱装置 常见的一种是由两台高压泵 梯度程序控制器 混合器等部件组成 两台泵分别将两种极性不同的溶剂输入混合器 经充分混合后进入色谱柱 这是一种泵后高压混合形式 高压梯度所采用的泵 多为往复柱塞泵或螺旋泵 由此所获得的流量精度高 梯度洗脱曲线重复性好 梯度洗脱的溶剂混合器应具备容积小 无死区 清洗方便 混合效率高等性能 才能获得重复的 滞后时间短的梯度洗脱曲线 3 注意事项 1 溶剂的纯度要高 否则梯度洗脱的重现性差 2 梯度混合的溶剂互溶性要好 3 梯度洗脱应使用对流动相组成变化不敏感的选择性检测器 如紫外吸收检测器或荧光检测器 而不能使用对流动相组成变化敏感的通用型检测器 如示差折光检测器 进样系统 进样系统是将被分析试样导入色谱柱的装置 对于液相色谱的进样装置 要求重复性好 死体积小 保证中心进样 进样时对色谱柱系统流量波动要小 便于实现自动化等 进样系统包括取样 进样两个功能 而实现这两个功能又分手动和自动两种方式 手动进样 1 注射器进样这种进样方式同气相色谱一样 样品用微量注射器刺过色谱柱上端进样器的隔膜 直接注入到与色谱柱相联的进样头内 这种进样方式 可以获得比其它任何一种进样方式都要高的柱效 而且价廉 结构简单 操作方便 但是操作压力不能过高 进样量有限 小于100 1 特别是进样重复性差 只能达至1 2 若采用停流进样方式 则无法获得精确的保留时间 重复性也差 只是在没有进样阀的情况下 才采用这种进样方式 2 阀进样采用进样阀进样 可以在常压下将样品溶液导入进样阀 经阀切换操作直接在高压状态下把样品液送入色谱柱 不需要停流 进样量由固定体积的定量管或微量注射器控制 所以重复性好 但是柱效比注射器进样下降10 左右 六通进样阀是目前最常用的进样阀 其结构如下图所示 它由阀体 阀芯 贮样管 手柄 旋转密封环组成 阀体和阀芯为不锈钢制成 阀芯以及用聚四氟乙烯等材料制成的旋转密封环 由同一手柄带动旋转 密封环上刻有在三个互不相通的沟槽供样品和洗脱液流动 当阀处于A位置时 样品用注射器注入到一定容积的贮样管中 可按进样量大小 采用不同容积的贮样管 然后手柄转至图中B位置 贮样管内的样品即被洗脱液带入色谱柱中 六通迸样阀的优点是进样量可变范围大 进样量也较大 可适用于制备分离 重复性好 0 5 耐压高 可达200Kg cm2 和易于自动化 缺点是阀的死体积大 进样后清洗麻烦 且容易引起色谱峰的展宽 另外 这种阀的结构 为使它的高压密封性能好 在制造时往往使旋转密封环和阀体的配合较紧 所以操作时费力大 进样阀定量环有10 20 50 l等规格 若要用定量环进样 应超体积注入样品溶液 以保证进样量的正确 如果样品溶液与流动相差距较大 例如样品溶液为甲醇 而流动相为较复杂的乙腈 缓冲液系统 进样后可能导致M峰的出现 可以采用将样品溶液用流动相稀释后以定量环进样 或者用微量注射器定量进样 进样体积小于定量环体积 自动进样器进样 目前 自动进样器也越来越多地应用于高效液相色谱仪上 自动进样器是在在程序控制器或工作站软件控制下 可自动进行取样 进样 清洗取样系统等一系列动作 并且较为先进的自动进样器可以控制样品架温度 保证低温进样 甚至于进行程序进样 操作者只须将样品按顺序装入贮样装置 设定进样程序即可 柱温箱 柱温箱为放置色谱柱的地方 一般可以存放1 3根色谱柱 应用柱温箱可以保持色谱柱温度 不受外界环境影响 主要表现为分析结果重现性好 提高柱效 降低柱压 保证检测稳定性 较为先进的柱温箱不但可以保持较高温度 80 100 也可以保持较低温度 低于室温10 同时可设置温度程序控制 色谱柱 色谱柱是高效液相色谱仪的核心部件 要求分离度高 柱容量大 分析速度快 要达到如此好的性能 不仅与固定相本身的性能有关 而且与色谱柱结构 装填和使用技术等有关 色谱柱填充剂 反相色谱系统使用非极性添充剂 常用的色谱柱填充剂为化学键合硅胶 以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用 辛基硅烷键合硅胶和其他类型的硅烷键合硅胶 如氰基硅烷键合相和氨基硅烷键合相等 也有使用 正相色谱系统使用极性填充剂 常用的填充剂有硅胶等 离子交换色谱使用离子交换填充剂 分子排阻色谱系统使用凝胶或高分子多孔微球等填充剂 对映异构体的分离通常使用手性填充剂 填充剂的性能 如载体的形状 粒径 孔径 表面积 键合基团的表面覆盖度 含炭量和键合类型等 以及色谱柱的填充 直接影响待测物的保留行为和分离效果 分析分子量小于2000的化合物应选择孔径在15nm 1nm 10埃 以下的填料 分析分子量大于2000的化合物则应选择孔径在30nm以上的填料 除另有规定外 普通分析柱的填充剂粒度一般在3 10 m之间 粒径更小 约2 m 的填充剂常用于填装微径柱 内径约2mm 色谱柱的使用及保养 1 使用微径柱时 输液泵的性能 进样体积 检测池体积和系统的死体积等必须与之匹配 如有必要 色谱条件也需作适当的调整 当对其测定结果产生争议时 应以品种项下规定的色谱条件的测定结果为准 2 以硅胶为载体的键合固定相的使用温度通常不超过40 为改善分离效果可适当提高色谱柱使用温度 但不宜超过60 3 流动相的pH值应控制在2 8之间 当pH值大于8时 可使载体硅胶溶解 当pH值小于2时 与硅胶相连的化学键合相易水解脱落 当色谱系统中需使用pH值大于8的流动相时 应选用耐碱的填充剂 如采用高纯硅胶为载体并具有高表面覆盖度的键合硅胶填充剂 包裹聚合物填充剂 有机 无机杂化填充剂或非硅胶基键合填充剂等 当需使用pH值小于2的流动相时 应选用耐酸的填充剂 如具有大体积侧链能产生空间位阻保护作用的二异丙基或二异丁基取代十八烷基硅烷键合硅胶 有机 无机杂化填充剂等 4 在取得一根新的色谱柱时 应先阅读使用说明 5 供试品溶液应用0 45 m甚至更小孔径的微孔滤膜过滤 同时应尽可能在色谱柱前使用预柱 微径柱必须使用 可保证供试品溶液中微粒不进入色谱柱 延长色谱柱寿命 6 试验过程中 应避免流动相组成及极性的剧烈变化 7 试验后 应用适当溶剂冲洗色谱柱 尤其是含有缓冲盐的流动相 应先用含少量有机试剂的水溶液冲洗 再逐步置换到保存色谱柱用有机溶剂 色谱柱冲好后 应用柱塞密封保存 同时注意保存温度 8 色谱柱常见毛病为柱压增高 柱效降低 此时应进行色谱柱维修 一般说明书中会提供色谱柱再生方法 按其操作即可 或者将色谱柱反冲一定时间 若柱压仍不下降 可将色谱柱进口处筛板拆下 用5 稀硝酸超声处理10分钟后再换用纯水超声处理10分钟 同时用相应的固定相修补柱头 最后将筛板装回即可 如果是因为流动相pH值及组成不合适造成固定相流失引起的毛病 则色谱柱基本无法修复 检测器 高效液相色谱法具有高效 高速 高灵敏度的特点 微量组分经色谱柱分离后的检测既不能用人的肉眼也不能分段取样后用仪器检测 只能采用检测器在色谱柱后直接检测 样品组分洗脱液中的浓度或物理量变化 由检测器连续地转换成电信号 在记录仪上迅速地给出直观的信息 操作者可按照所描绘的色谱峰位置来定量地判断分离情况的优劣 并根据峰面积定量地测定各组分的含量 最常用的检测器为紫外检测器 包括二极管阵列检测器 其他常见的检测器有荧光检测器 示差折光检测器 蒸发光散射检测器 电化学检测器和质谱检测器等 紫外 荧光 电化学检测器为选择性检测器 其响应值不仅与待测溶液的浓度有关 还与化合物的结构有关 示差折光检测器和蒸发光散射检测器为通用型检测器 对所有的化合物均有响应 蒸发光散检测器对结构类似的化合物 其响应值几乎仅与待测物的质量有关 二极管阵列检测器可以同时记录供试品的吸收光谱 故可用于供试品的光谱鉴定和色谱峰的纯度检查 紫外 荧光 电化学和示差折光检测器的响应值与供试品的浓度在一定范围内呈线性关系 但蒸发光散射检测器的响应值与供试品溶液的浓度通常呈指数关系 故进行计算时 一般需经对数转换 不同的检测器 对流动相的要求不同 如采用紫外检测器 所用流动相应符合紫外 可见分光光度法项下对溶剂的要求 采用低波长检测时 还应考虑有机相中有机溶剂的截止使用波长 并选用色谱级有机溶剂 蒸发光散射检测器和质谱检测器通常不允许使用含不挥发盐组分的流动相 馏分收集器 如果所进行的色谱分离不是为了纯粹的色谱分析 而是为了做了其他波谱鉴定 或获得少量试验样品的小型制备 馏分收集是必要的 用小试管收集 手工操作 只适合于少数几个馏分 手续麻烦 易出差错 馏分收集器比较理想 因为便于用微处理机控制 按预先规定好的程序 或按时间 或按色谱峰的起落信号逐一收集和重复多次收集 数据采集及处理 把检测器的信号转换为色谱图 一般采用色谱积分仪及色谱工作站进行 积分仪较为简单 可以设定积分参数 记录保留时间 峰号以及峰面积 但是分离度和理论板数需手工计算 偏差较大 积分仪可储存少量色谱图 但关机后储存的色谱图即不再保存 积分仪记录介质多为热敏纸 保存时间较长后颜色消退 需另行复印后保存 目前大部分高效液相色谱仪数据采集多用色谱工作站 较为简单的色谱工作站一般为国内开发 价格较为便宜 但只能进行数据采集 色谱条件只能由仪器设定 相对于积分仪来说 由于使用计算机控制 色谱图比较一目了然 改变积分参数后 可清晰看出色谱图的变化 可以进行分离度 理论板数等简单计算 较为先进的色谱工作站一般为购买仪器时同时购买 价格较为昂贵 但是功能强大 可用来控制整个仪器的运转 从设定色谱条件 控制进样 处理色谱图直至计算含量结果均可由工作站完成 色谱工作站作为软件安装在计算机上 通过计算机硬盘或者刻成CD DVD光盘保存 理论上可永久保存 色谱图亦可通过打印机打印出来后保存 需要注明的是 采用高效液相色谱法测定样品时 各品种项下规定的条件除固定相种类 流动相组成 检测器类型不得改变外 其余如色谱柱内径 长度 载体粒度 流动相流速 混合流动相各组成的比例 柱温 进样量 检测器的灵敏度等 均可适当改变 以适应具体的色谱系统并达到系统适用性试验的要求 对于必须使用特定牌号的填充剂方能满足分离要求的品种 可在该品种项下注明 第四节检测方法 紫外检测法 紫外检测法是高效液相色谱中最常用的检测方法 由于有机化合物中近百分之八十都具有紫外吸收 因此紫外检测器的应用最早也最广 这种检测器具有很高的灵敏度 对环境温度及流速波动不甚敏感 适用于梯度洗脱操作 但是紫外检测器一次只能得到一个波长的色谱图 而二极管阵列检测器可以采集三维图谱 针对每一个色谱峰可以进行光谱扫描 进行峰纯度测定 荧光检测法 在液相色谱中 荧光检测法的应用仅次于紫外吸收检测法 荧光检测法最吸引人的特点是它固有的灵敏度和选择性 它的最小检测限往往要比紫外检测法低一个数量级以上 选择性也优于紫外检测法或至少一样 但是荧光检测法不如紫外检测法应用那么广泛 因为能产生荧光的化合物比较有限 许多生物物质包括某些代谢产物 药物 氨基酸 胺类 维生素等 都可用荧光检测法检测 有些化合物本身不产生荧光 但却含有适当的官能团 可与荧光试剂发生反应生成荧光衍生物 这时就可用荧光检测法检测 许多化合物存在光致发光现象 即它们可被入射光 称激发光 所激发 并再发出波长相同的共振辐射或波长较长的特征辐射 即荧光 被这些化合物所吸收的紫外光称为激发光 产生的荧光称为发射光 荧光检测器 是在样品的激发波长处测量发射光的强弱 当被分析的样品浓度足够低