浅谈PCR技术2.ppt

浅谈PCR技术 特异性DNA片段的PCR扩增 生物05专升本田江平 引言 早期特异性DNA片段的扩增体外DNA片段的扩增 1983年PCR ploymerasechainrection 聚合酶链式反应 技术的应用 现代PCR技术在基因扩增与分离 医疗诊断 基因突变与检测 分子进化研究及法医鉴定等诸多领域都有重要用途 主要内容 PCR的基本原理PCR扩增的主要条件靶DNA和模板PCR引物PCR原材料PCR缓冲液PCR循环的温度和时间PCR扩增平台PCR扩增DNA的方法常用的DNA片段PCR扩增系统 PCR基本原理 PCR反应是模仿细胞内发生的DNA复制过程进行的 在体外由酶催化合成特异性DNA进行特异性DNA复制的一般过程为 1 反应系统加热至90 95 使底物双链DNA变性成为两条单链 2 降温至37 60 使两种引物分别与模板DNA链的3 一侧的互补序列杂交 复性 3 升温至70 75 耐热性DNA聚合酶 催化引物按3 5 方向沿伸 合成模板DNA的互补链 重复以上过程 经过三次循环 就出现待扩增的特异性DNA片段 见下图 5 G G T C 3 3 C C A T 5 90 95 5 G G T C 3 3 C C A T 5 37 45 HO A G 引物 5 G G T C 3 3 C C A T 5 G G OH 引物 70 75 3 C C A G 5 5 G G T C 3 5 G G T C 3 3 C C A G 5 扩增的特异性片段 90 95 37 45 70 75 90 95 37 45 70 75 是扩增的特异性片段 全部是扩增的特异性片段 图一 PCR扩增特异性DNA片段过程 注 每次PCR的效率并非100 扩增产物中有部分PCR中间产物 PCR扩增的主要条件 一 耐热性DNA聚合酶 1 TaqDNA聚合酶 早期常用 原是喜温性细菌 Ther musaqaticusBM 内的一种耐热性DNA聚合酶 后将这种酶的基因转入E coli细胞中 现在市场上所销售的 TaqDNA聚合酶相对分子质量为 95 10 3 具有强的5 3 DNA聚合酶活性 缺3 5 和5 3 外切酶活性 2 PwoDNA聚合酶 是从喜温性细菌 archaebacteri um Pyrococcuswoesei中发现的 后将这种酶的基因转入到E coli细胞中 可进行大量生产 相对分子质量为 90 10 3 具有3 5 外切酶活性 没有检测到5 3 的活性 3 TthDNA聚合酶 此酶是从喜温性真细菌 ThermusThermophilusHB8 中提取的 具有强的5 3 DNA聚合酶活性 缺3 5 聚合酶活性 TthDNA聚合酶用于RT PCR系统 可以扩增至少1000bp长的cDNA片段 4 C thermDNA聚合酶 这种酶是从Carboxydotherm ushudregenoformans中分离出的 是一种以Mg离子为补助因子的逆转录酶 最适温度60 70 之间 在RT PCR系统中催化反转录反应 并具有3 5 外切酶校对活性 合成cDNA的准确度比用cDNA聚合酶二倍 靶DNA和模板 作为PCR的靶DNA一般是一个待扩增的特定双链DNA片段 应知道其两端20 30bp的核苷酸序列 供设计对引物之用 靶DNA可以是环形DNA分子的一部分 也可以是线形DAN分子 或片段 的一部分 作为PCR的模板是一条单链DNA片段 其3 端具有与引物杂交的序列 PCR引物 引物是PCR过程中引导互补链DNA的一种脱氧核苷酸寡聚体 其引物必须具有游离的 OH基因 为了有效地扩增特异性双链DNA片段 设计和合成合适的引物是非常重要的 设计引物应遵循以下几点 1 根据DNA互补链聚合反应的原理 设计的引物的核苷酸必须与模板链3 端的一段核苷酸序列互补 并且3 端必须具有游离的 OH基因 S 2 引物的长度与PCR过程的特异性高低密切相关 引物长的 特异性高 为扩增特异性高的DNA引物片段 一般设计的引物由20 30个核苷酸组成 4种核苷酸尽可能随机分布 G与C含量应达40 60 尽量避免存在多聚嘌呤核苷酸 多聚嘧啶核苷酸或异常核苷酸的序列 3 设计的引物中应尽量避免回文结构序列 尤其是在引物的3 端不应有回文结构序列 为了降低在PCR过程中形成引物二聚体 设计引物时必须避免用于同一PCR过程中的一对引物之间存在互补序列 4 设计的引物中 最好含有进一步操作中可利用的限制性核酸内切酶识别序列 若靶细胞DNA一端或两端不含这样的序列 则可以根据下一步操作 设计在引物5 端添加一些与模板DNA链核苷酸序列 使扩增的DNA片段一端或两端引入核苷酸内切酶识别序列 在这种情况下 设计的引物要长一些 5 如果扩增一个编码区域的DNA片段 设计的引物应尽量避免5 端的核苷酸与密码子的第三位置 间并 的核苷酸的互补 以次来防止3 端的核苷酸可能同模板错配 以及由此引起的聚合反应受阻 6 引物中的核苷酸序列与非靶DNA序列以及靶DNA中引物互补序列以及以外的核苷酸序列之间的同缘性不得超过70 并且不能有连续8个以上相同的核苷酸序列 PCR原材料 dATP dGTP dCTP和dTTP是PCR的原材料 通过PCR过程聚合成互补链DNA 如果这些原材料中分别渗入Dig UTP Bi otin UTP Flu UTP等修饰过的核苷酸 扩增出标记的DNA片段 因此 采用PCR技术可以制备这些标记的DNA探针 PCR缓冲液 PCR缓冲液平时配置2倍的浓度 含140mmol LTris HCL pH 8 8 4 8mmoL LMgCl2 40mmol L NH4 2SO4 30ug mlBAS 无核酸酶 16mmol LDDT PCR循环的温度和时间 一般的PCR循环中 变性温度采用90 95 能否使双链DNA完全变性分开 这是PCR扩增片段成败的重要原因 大多数情况下采用94 持续20s 快速高温处理对保持DNA聚合酶活性是必要的 复性温度取决于引物的长度和G C含量 对于长度为20个核苷酸 G C含量为50 的典型引物来说 55 是比较合适的复性温度 如果引物长度只有12 15个核苷酸 则复性温度以40 45 为益 由于反应系统中引物是过量的 引物与模板杂交可以在瞬间时完成 所以复性时间不需要很长 常用20s 引物延伸在70 75 下进行 所需时间随扩增DNA片段的长度而定 扩增1000pb的DNA片段需1min 如果扩增片段在150bp以下 甚至不需考虑延伸时间 PCR扩增平台 PCR过程经过一定数次的循环后 待扩增的DNA片段不在以指数关系继续累及 而是进入以线性关系累积 而是进入以线性关系累积或停止累积的平台期 对于含有2 5单位TaqDNA聚合酶的100uL标准反应系统而言 当扩增的DNA片段达到1ug左右时 PCR扩增进入平台期 为保证扩增的效率应尽量防止提前进入平台期 导致提前进入平台期的原因 一方面是因为反应开始时反应系统中作为模板的DNA拷贝数过量 当PCR经过一定次数循环后 使DNA聚合酶不足以催化以扩增的DNA片段做为模板继续扩增 另一方面原因是因为反应系统中加入的引物或dNTP的量不足 或者是DNA聚合酶中途失活 PCR过程中出现的平台期是不可避免的 实际上为了获得足够量的扩增产物 不是采用推迟进入平台期的办法 而是采取多批扩增的方法 PCR技术在实际应用中 根据各自的需要摸索出了最适反应条件和操作方法 这里仅介绍一种常规的方法 1 供PCR的微型试管中加入2ug靶DNA 约10uL 2 加入50uL2 PCR缓冲液 再加入每种引物至6 6ug mL 使引物终浓度为1umol L 100ml反应系统中含100pmol PCR扩增DNA的方法 3 在98 下变性7min 冷至室温 加入5 7UTaqDNA聚合酶 终反应体积为100ul 混匀 其上覆盖50 100ul石蜡油 防止蒸发 反应液离心10s 置于PCR仪中 70 延伸1min 92 变性1min 37 复性1min 再在70 延伸1min 92 变性1min 37