李建兵 白酒中酸的测定.docx

白酒中酸的测定 对白酒而言，它的酸类物质主要由有机酸组成，主要来源于酒醅发酵过程中的乙酸、丙酸、丁酸、乳酸、己酸和高级脂肪酸等。酸类影响白酒的口感和后味，是影响口味的主要因素，酸不足是造成后味寡淡的主要原因。 其大部分以游离状态存在，小部分以盐类形式存在。计算白酒总酸时，以有机酸为主，折算为乙酸的含量。根据有机酸的物理化学性质可将有机酸分成三类：易挥发性酸、不挥发性酸、热不稳定性酸。易挥发性酸主要有C1一C6的小分子酸，它们饱和蒸汽压低，易挥发；不挥发性酸包括C7 C12 的饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸、苯环酸等；热不稳定性酸包括琥珀酸、草酸、柠檬酸、苹果酸等多元酸。有机酸分析过去多采用气相色谱法，由于有机酸的强极性及部分有机酸对热的不稳定性和吸附性，多种检测方法如液相色谱法、酶法、电泳法及复合各种前处理技术广泛应用到有机酸的测定中。酸度是指利用酸碱中和原理测定，其定义为100克酒醅滴定消耗氢氧化钠的毫克分子数，以度表示。酒中有机酸，以酚酞为指示剂，用氢氧化钠溶液中和滴定，以乙酸计总酸量，单位为每升克数。1 易挥发性酸的测定 易挥发性酸主要指短链脂肪酸，包括甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸、己酸、异己酸。易挥发性酸的测定以气相色谱居多。由于它们挥发性较强，为保证定量的准确性，一般不进行前处理。其测定方法如下 11 直接进样法直接进样法操作简单，在测定易挥发性酸快速准确，重复性好。由于直接进样法不涉及前处理，在测定有机酸特别是挥发性较强的酸时定量更为准确，但直接进样 法没有浓缩过程，低于检出限痕量的有机酸不能直接测定。气相色谱法直接进样能否检测出物质的某一组分主要取决于两个条件，一是被测物质的这一组分能否被洗出色谱柱，这取决于其组分和色谱柱固定液之间的特性，遵循相似相溶的原理；二是被测物质组分从色谱柱中洗出后，检测器是否对它有响应，这主要取决于检测器的类型、性能，像氢火焰离子化检测器只对大部分有机物有灵敏的信号，对在氢火焰中不能电离或电离很少的物质 1 .2 酯化处理间接进样法能酯化处理后测定乳酸等有机酸的色谱柱其固定液多为1，4-丁二醇丁二酸酯（BDS），乙二醇己二酸聚酯（PEGA）等。以内径3mm,长1.5mm的BDS玻璃柱为例。试样的制备：取10ml酒样于小烧杯中，加水稀释至约20ml,准确加入内标物2-乙基正丁酸0.35ml，在ph计上（电磁搅拌下），用0.03M的四丁基氢氧化铵小心中和至PH=9，定量移入75ml于蒸发皿中，于水浴上蒸干，冷至室温，加入5ml丙酮，充分溶解，吸取清液2ml于10ml带塞试管中，用计量用微量注射器加入苄基溴，室温下放置2h，使酸成为苄酯，即为色谱样品。苄基溴加入量式中： C四丁基氢氧化铵的摩尔浓度；V中和时四丁基氢氧化铵所用毫升数；1.3为保证苄酯化完全，苄基溴用量比理论量增加30%2/5试样分取比例1.438苄基溴的相对密度 主要色谱条件气相色谱仪：天美7890II,N2000工作站，配FID检测器；色谱柱；BDS玻璃填充柱，内径3mm,长1.5m。柱温150C ，汽化室与检测室温度170C，气体流速：氮气55ml/min,氢气50ml/min，空气1000ml/min操作：按常规色谱操作，进样量2ml计算：用面积内标法，工作站自动积分计算，即可求出乳酸的含量。13 顶空一固相微萃取(HSSPME)法顶空一固相微萃取将萃取、浓缩、进样集于一体，使实验过程大大简化；使用很少或不使用有机溶剂，避免了对环境和人体的危害；测定挥发酸时精确度高，准确性好。，顶空一固相微萃取法与萃取头材料的极性有较大关系，随着碳链的延长，有机酸的极性逐渐减弱，一种萃取头不能满足不同极性酸的测定；基质也会对萃取头的灵敏度造成影响，降低检出限或使结果不稳定；萃取头要定期更换保证定量结果的准确。2 不挥发性酸的测定 不挥发性酸主要包括庚酸、辛酸、壬酸、癸酸、十二酸等长链有机酸。它们比较柔和，能与多种成分亲和，对酒的后味起着缓冲、平衡作用，使酒质调和。由于它们沸点较高不易挥发，可以通过前处理浓缩富集测定。21 旋蒸浓缩一直接进样法取50 mL酒样，加人10 mL的2一乙基丁酸、十一酸、十七酸内标溶液，用氢氧化钠溶液在电磁搅拌下中和至pH80，然后将溶液转移至旋转蒸发器中，以低于40的水浴将酒液减压浓缩至干，残渣以18 mL 10 甲酸溶解后转移至刻度试管中，再用4 mL 95 乙醇分数次洗涤烧瓶，将洗液与甲酸液合并，进样2 L GC测定。 22 固相萃取(SPE)法固相萃取就是利用固体吸附剂将液体样品中的目标化合物吸附，与样品的基体和干扰化合物分离，然后再用洗脱液洗脱或加热解吸附，达到分离和富集目标化合物的目的先用2 mL甲醇，再用2 mL pH在4555之间的40(vv)乙醇活化萃取柱，将50 mL酒样(加入1 mL 100 mgL的壬酸做内标)以5 mIZmin的速率过柱，过柱后用1 mL二氯甲烷洗脱，取1mL进GC分析。23 衍生法由于不挥发酸的沸点高，难气化，因此高效液相色谱法在测定时较简便。但羧酸化合物在紫外光区无明显吸收，引人在紫外光区有强吸收的基团，就可进行紫外检测。羰基化合物可适用于成肟或成腙的衍生试剂处理后作色谱分析，常用的衍生试剂有O一正丁基羟胺、2，4一二硝基苯肼、2一bromo一2一acetonaphthone等3 热不稳定酸的测定31 酶法酶法最初主要用于葡萄汁和葡萄酒中苹果酸、乳酸、柠檬酸的定量测定。然而像酒石酸、乙酸、L一维生素C、脱氢抗坏血酸、蚁酸、D一葡萄糖酸、D一异柠檬酸、草酸、琥珀酸等有机酸也可以用酶法测定。AOAC将酶法作为测定柠檬酸的仲裁法方法的原理是通过测定辅酶NADH或者NADPH量的增减，NADH和NADPH的吸收波长在340 am处。32 高效液相色谱法(HPLC)高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析根据样品前处理可分为两类：一是将样品稀释过滤后直接进样分析；另一类涉及复杂的前处理。前处理的主要是为了避免糖类、色素等能与有机酸一同洗脱的物质的干扰。主要的方法有离子交换树脂吸附萃取、SPE、衍生等33 毛细管电泳法毛细管电泳： 是以弹性石英毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的电泳分离分析方法。毛细管电泳的飞速发展得益于其优势：高分辨力，简便，自动化，分析时间短，试剂与样品的消耗少，简便的样品前处理。通过研究缓冲液的选择、浓度、pH等对分离效果的影响，在确定最优条件：5 molL偏苯三甲酸酯和1 molL溴化十四烷基三甲铵为缓冲液，pH90，10 min内完成全部色谱分析。保留时间与色谱峰的保留面积RSD小于1和4 ，大多数物质的检出限在106M之间。毛细管电泳法相对于HPLC、GC法、酶法，虽然重现性较差，但其分析时间短、试剂样品消耗少、灵敏度高的优点测定乳酸：乳酸是白酒中一种重要的有机酸，在浓香型白酒中，它的含量仅次于己酸，其含量的多少不但对白酒的口味和后味有较大影响，而且也直接反映了酒醅在发展过程中是否正常1、色谱直接进样法测定白酒中的乳酸在理论上是一种最快、最准确的方法，但到目前为止，还没有真正找到一根既经济、分离效果又好、经久耐用，且较易制备的色谱柱。因此，它只能作为白酒色谱的一个发展方向酯化处理间接进样法测定白酒中乳酸，也是一种较准确的定量办法，它同直接进样法相比，有一定的可操作性。目前，凡是采用1，4-丁二醇丁二酸酯或聚二甘醇己二酸酯作固定液的色谱柱大多可以测定酯化后的有机酸，但是此法操作繁琐，时间长，不易掌握，且此类色谱柱也没有被广泛使用2、比色法 ：比色法是常规化学分析中一种经常使用的分析方法，它可以对白酒中的乳酸进行有效的定性定量分析，酒样中乳酸的含量可在显色后与乳酸标准系列管的比色中得分为目视比色法和光电比色法，两种方法都是以朗伯-比尔定(A=bc)为基础。目视比色法 常用的目视比色法是标准系列法，该法采用一组由质料完全相同的玻璃制成的直径相等、体积相同的比色管，按顺序加入不同量的待测组分标准溶液，再分别加入等量的显色剂及其他辅助试剂，然后稀释至一定体积，使之成为颜色逐渐递变的标准色阶。再取一定量的待测组分溶液于一支比色管中，用同样方法显色，再稀释至相同体积，将此样品显色溶液与标准色阶的各比色管进行比较，找出颜色深度最接近于样品显色溶液的那支标准比色管，如果样品溶液的颜色介于两支相邻标准比色管颜色之间，则样品溶液浓度应为两标准比色管溶液浓度的平均值。标准系列法的主要优点是设备简单和操作简便，但眼睛观察存在主观误差，准确度较低。光电比色法是在光电比色计上测量一系列标准溶液的吸光度，将吸光度对浓度作图，绘制工作曲线，然后根据待测组分溶液的吸光度在工作曲线上查得其浓度或含量。与目视比色法相比，光电比色法消除了主观误差，提高了测量准确度，而且可以通过选择滤光片来消除干扰，从而提高了选择性。但光电比色计采用钨灯光源和滤光片，只适用于可见光谱区和只能 得到一定波长范围的复合光， 而不是单色光束 3、综合法是指利用理化分析和色谱分析数据，求取乳酸的含量。己酸、乙酸、乳酸、丁酸B种酸占有机酸总量的90%以上，以总酸含量减去色谱柱流出各单一酸种的含量即得乳酸的含量。 离子色谱法测酸 优点：离子色谱法同时测定蒸馏白酒中七种有机酸，具有简便快捷、灵敏度高、干扰少等优点。目前气相色谱法通过运用白酒专用大口径毛细管柱能定量测定的白酒中的主要酸有乙酸，已酸和丁酸，而含量较多的乳酸却测不出来。在阴离子交换为主要分离机理的色谱柱AS11-HC上醇类可以与有机酸较好实现分离 机理：白酒样品经超纯水稀释后可直接进样检测，待测的甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸和乳酸在阴离子交换机理为主的分析柱上分离，再经抑制型电导检测器直接检测。 主要仪器: ICS3000型高效离子色谱仪（美国Dionex公司），配有：AS11-HC+AG11-HC（4mm）阴离子分析柱和保护柱、CD3000-ASRS（4mm）阴离子抑制器、电导检测器；MILLIPORE超纯水系统，Chromeleon6.8色谱工作站试剂和样品: 标准试剂：色谱纯的己酸、乙酸、丁酸、乳酸试剂 溶剂：优级纯的无水乙醇测定条件: 分析柱：AS11-HC+AG11-HC（4mm）阴离子分析柱和保护柱 进样体积：10ul 淋洗液流速：1.5ml/min 检测器温度：30 压力：2200psi（15.15Mpa）洗淋液E1 去离子水 E2 5mM NaOH E3 10mM NaOH E4 100% 甲醇 淋洗液配制: 称50g优级醇NaOH加50ml去离子水定溶100ml；吸取0.26ml饱和NaOH定溶至1000ml，配制成5mMNaOH。吸取5.23ml饱和NaOH定溶至1000ml，配制成100mMNaOH。 操作步骤:1、样品预处理 白酒溶液清洁后用0.22um水相过滤头过滤，直接进样 2、标准样的制备 将无水乙醇用去离子水稀释至50%vol待用 按一定浓度配置酸的混合酸标样 用50%vol的乙醇溶液定溶到100ml容量瓶中 3、标准曲线 样品编号 单位 12 3 4 5乳酸 mg/100ml 15 20 25 30 35 乙酸 mg/100ml 25 30 35 40 45 丁酸 mg/100ml 5 10 15 20 25 己酸 mg/100ml 30 35 40 45 50 各有机酸标准溶液浓度: 项目名称 浓度范围 Mg/100ml 回归方程 RSD/% r 乳酸 1535 Y=0.019x+0.027 1.37 9