氯吡格雷反应变异性.doc

一、立项依据（包括国内外研究现状、发展趋势、理论与实践依据、研究目的意义等）冠心病长期以来一直威胁人类健康的主要心血管疾病，据统计，全世界每年大约有2000万人死于心脏疾病其中急性冠脉综合征(acute coronary syndrome，ACS)是心脏性死亡的主要原因之一1。要改善这类病人的预后,减少病死率,防治血栓形成就显得极为重要。抗血小板新药氯吡格雷(clopidogrel,CPG)是二磷酸腺苷(ADP) P2Y12受体的不可逆性拮抗剂，属于第二代的噻吩吡啶类抗血小板药物2，广泛应用于急性冠脉综合征(ACS)及行经皮冠状动脉介入(PCI)治疗的病人。目前，氯吡格雷联合阿司匹林已经成为ACS患者预防支架内血栓形成的标准抗血小板方案3。然而，虽然双重抗血小板治疗比单用阿司匹林降低了20%的患者心血管事件的发生，仍约有10%的患者在远期发生动脉粥样硬化血栓形成事件4，这可能与个体对氯吡格雷疗反应的变异性有关。文献报道了4%31%的患者服用常规剂量的氯吡格雷不能有效的抑制血小板的反应2,5。因而，氯吡格雷反应变异性的发生率、与临床相关性及相关机制的研究已成为临床药学研究的热点问题。氯吡格雷是一种无活性的前体药物，需要被肝细胞色素P450(cytochrome P450,CYP)氧化生成一种活性产物发挥抗血小板作用。然而约85%的前体药物被酯酶水解为无活性的羧酸衍生物，仅约15%被肝CYP系统代谢,其噻吩环被氧化后形成一种中间代谢物(2-氧-氯吡格雷)，后者进一步被氧化，导致噻吩环打开，形成一个羧基和巯基。氯吡格雷的活性巯基在P2Y12受体的半胱氨酸之间形成一个二硫键, 进而不可逆地阻断P2Y12受体，有效地抑制血小板聚集2。临床氯吡格雷的常用剂量(75mg/日，4d)可选择性地、不可逆地抑制ADP诱导的血小板聚集，此作用在首次给药后2h内即可检测到，重复给药37d后达到血药浓度稳态，此时血小板聚集抑制率平均可达40%60%。停药后，一般于58d内血小板聚集性(和出血时间)逐渐恢复至基线水平。首剂给予氯吡格雷负荷剂量(300400mg)，继以75mg/日维持，其作用可提前于给药30分钟内出现，2h内达到稳态水平，且耐受良好，尤其适用于紧急状况(如急性心梗、支架植入术后)时6。目前个体对氯吡格雷反应变异性的标准定义仍然是缺乏的。不同的名称定义了氯吡格雷抗血小板反应失效，如“氯吡格雷抵抗( Clopidogrel resistance) ”，“低反应性（lowresponder、hypo-responder）” ，“半反应者（ semi-responder ）”，“欠佳的反应者（suboptimal responder）”等也更进一步的混淆了该概念。不同的研究者对氯吡格雷反应变异性进行了定义，如Gurbel、Muller等5,7定义使用5mol/L ADP作激动剂诱导的血小板聚集率基线值与用药后差值10%为氯吡格雷抵抗者差值在10%- 29%为半反应者，差值30%为反应者，计算公式为：。（IPA：为血小板聚集抑制；MAR：最大的血小板聚集率）8。而Lee 等9使用VerifyNow P2Y12系统直接检测氯吡格雷对于P2Y12受体的抑制，P2Y12受体介导的聚集率用P2Y12反应单位 (PRUs) 和抑制百分率表示。抑制百分率 (1-PRU/基线的PRU *100)20% 被定义为氯吡格雷抵抗。国内，有研究将氯吡格雷抵抗定义为用药后4h GPb/a值升高1.38%者。但这些定义都存在有不明确的地方，如服用氯吡格雷的不同负荷剂量和维持剂量、服药后的测定时间、氯吡格雷诱导的血小板聚集度的测定方法、激动剂ADP的浓度、抗凝剂（柠檬酸或水蛭素）都会对个体的氯吡格雷反应性有影响。在本研究中，我们用Angiolillo等提出的“氯吡格雷反应变异性”来表示个体间的抗血小板药物氯吡格雷的反应差异3。2003年Gurbel等5对96名经皮冠状动脉介入治疗术(PCI)后患者研究发现，用5mol/L ADP作激动剂，在给予氯吡格雷负荷剂量300mg后2h、24h、5d和30d的氯吡格雷抵抗发生率分别是63%、31%、31%和15%。同年Muller等7对105例稳定型心绞痛PCI术后患者进行分析发现5%11%的患者是无反应者，9%26%是半反应者。PCI术后出现急性血栓的两例患者均是无反应者。该研究证实了PCI术后的患者中存在一个对氯吡格雷没有充足反应的亚组，这可能与血栓并发症的发生相符合。在日本，有研究显示8给予氯吡格雷负荷剂量48h后，反应者、高反应者和低反应者分别是36%、50%和14%，证明日本患者也存在氯吡格雷抵抗现象。在氯吡格雷抵抗发生率研究的基础上，2008年Trenk等评价了CYP4502C19*2多态性与高氯吡格雷血小板聚集(14%)(RPA)与冠脉支架置入术后临床结果的关系10。该研究纳入797例PCI术后患者，随访1年，结果显示在1年后，RPA14%的217名患者发生心血管事件为13例(6.0%)，出院前RPA14%的548名患者中发生心血管事件的为11例(P= 0.004)。因而该研究再次证实氯吡格雷抵抗患者有更高的心血管风险。国内研究现状：而目前针对中国患者对于氯吡格雷反应变异性的研究商少，以上的研究的对象主要都是针对高加索患者。而高加索患者和中国患者存在种族差异，对于高加索患者的临床试验的结论不能直接用于中国患者。因而有必要对我国患者氯吡格雷反应变异性的发生率及其临床意义做更细致、深入的研究。氯吡格雷反应变异性机制与临床、细胞、基因等因素相关。但是一些临床因素仅能对氯吡格雷反应变异性10%进行解释，如年龄(3.8%)，BMI(2.3%),甘油三酯水平(1.3%), 高密度脂蛋白(high densitv lipoprotein, HDL)降低水平(1%)。这也说明基因因素可能是导致氯吡格雷反应变异性的主要原因11。与氯吡格雷反应变异性相关的基因包括CYP 多态性、GPIa多态性、P2Y12多态性、GPIIIa多态性等。本课题主要关注CYP2C19基因多态与氯吡格雷反应变异性之间的关系。 氯吡格雷本身无治疗作用，它由细胞色素P450氧化生成活性代谢产物而起作用。CYP450是超家族基因编码的同功酶，参与了许多外源性和内源性物质的代谢。CYP2C19存在着多个有功能意义的基因突变，人群中CYP2C19表型分为强代谢者和弱代谢者，基因型和表型有着高度的一致性。CYP2C19存在至少5种突变基因，其中CYP2C19*2、CYP2C19*3是东方人群中2个主要的有意义的基因突变。2006年Hulot等12检测了28 名健康的白人志愿者编码CYP450酶的基因变异(CYP2C19*2, CYP2B6*5, CYP1A2*1F, CYP3A5*3) 的变异与氯吡格雷抑制的ADP诱导的血小板聚集之间的关系，该研究提示了CYP2C19*2可能是导致临床上氯吡格雷抵抗的重要原因之一。2009年Mega等13在162名健康受试者身上测试了CYP450功能基因的变异、氯吡格雷活性代谢产物的血浆浓度、氯吡格雷的血小板抑制反应之间的关系。结果发现携带降低CYP2C19降低功能基因的受试者(约30%)与未携带者相比，氯吡格雷的血浆活性代谢产物和最大氯吡格雷抑制的血小板聚集率分别降低了32.4%(P0.001)和9% (P0.001)。另外Fontana等14和Kim等15对健康受试者的研究也得出了相同结论。在对健康受试者研究的基础上，2008年Frere等评价了CYP450基因多态性对于急性冠脉综合征患者氯吡格雷治疗的抗血小板反应的影响16。该研究发现ADP诱导的血小板聚集与CYP2C19*2多态性显著相关，与CYP3A4*1B和CYP3A5*3多态性不相关。Collet等17对259例既往有过1次心肌梗死，服用氯吡格雷大于一个月年轻患者（年龄a polymorphism and high on-clopidogrel platelet reactivity associated with adverse 1-year clinical outcome of elective percutaneous coronary intervention with drug-eluting or bare-metal stents. J Am Coll Cardiol 2008;51:1925-193411. Xie H-G, Zou J-J, Hu Z-Y, Zhang J-J, Ye F, Chen S-L. Individual variability in the disposition of and response to clopidogrel: Pharmacogenomics and beyond. Pharmacology & Therapeutics.129(3):267-89.12. Hulot JS, Bura A, Villard E, et al. Cytochrome p450 2c19 loss-of-function polymorphism is a major determinant of clopidogrel responsiveness in healthy subjects. Blood 2006;108:2244-2247.13. Mega JL, Close SL, Wiviott SD, et al. Cytochrome p-450 polymorphisms and response to clopidogrel. N Engl J Med 2009;360:354-36214. Fontana P, Hulot JS, De Moerloose P, et al. Influence of cyp2c19 and cyp3a4 gene polymorphisms on clopidogrel responsiveness in healthy subjects. J Thromb Haemost 2007;5:2153-2155.15. Kim KA, Park PW, Hong SJ, et al. Coexisting polymorphisms of p2y12 and cyp2c19 genes as a risk factor for persistent platelet activation with clopidogrel. Clin Pharmacol Ther 2008;84:236-242.16. Frere C, Cuisset T, Morange PE, et al. 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Int J Cardiol 2009;133:341-345.二、研究内容（包括研究目标、关键技术和创新之处、应用前景、预期达到的主要技术指标、学术水平等）本课题的研究内容 观察在ACS患者中的氯吡格雷反应变异性发生率，同时结合随访资料探讨其对临床随访发生的心血管事件的影响。 研究CYP2C19基因多态性与氯吡格雷的反应变异性的相关性，探讨不同基因型与表型的差异，阐述氯吡格雷的反应变异性的分子生物学机制。 分别比较上述各突变基因型和野生基因型在随访过程发生急性冠脉事件有无差异，以冠心病相关危险因素如：肥胖、高脂血症、2型糖尿病、超敏C反应蛋白等作为因变量，建立回归模型，探讨单个位点和多个位点构建的单倍型与相应表型之间的关联，为寻找ACS患者氯吡格雷反应变异性相关临床预测指标提供依据。本研究的研究目标 初步明确氯吡格雷反应变异性在中国汉族ACS患者中的发生率； 初步观察氯吡格雷反应变异性对临床事件的影响； 揭示CYP2C19的不同基因型对氯吡格雷药效学的影响，及远期临床事件的影响。本研究拟解决的关键问题在东南大学附属中大医院心内科收集足够样本量的ACS患者是本研究需解决的关键问题之一。东南大学附属中大医院近5年来每年收治的ACS患者约为300-400例，在一年的时间内获得200例ACS患者是切实可行的。荧光定量PCR仪检测CYP2C9*2/*3基因频率是本研究拟解决的关键问题之二，目前本研究室已完全掌握了荧光定量PCR仪检测不同受体基因频率的方法。3、本课题的特色和创新之处（与国内外类似研究比较） 首次同时使用(5和20mol/L)ADP诱导透光聚合度测定、VASP磷酸化测定、GP IIb/IIIa测定、P-选择蛋白测定方法来研究中国汉族ACS患者氯吡格雷反应变异性的发生率。 首次研究中国汉族ACS患者CYP2C19基因多态性与氯吡格雷反应变异性之间的关系，及其近期和远期临床意义。4、研究工作的预期结果、成果 获得中国汉族ACS患者氯吡格雷反应变异性的发生率，阐明其在临床随访过程中发生心血管事件中的地位。 CYP2C19的基因多态性在不同的氯吡格雷的反应变异性中的存在差异，阐明氯吡格雷的反应变异性的分子生物学机制。 上述各突变基因型和野生基因型在随访过程发生心血管事件存在差异，以冠心病相关危险因素如：肥胖、高脂血症、2型糖尿病、超敏C反应蛋白等作为因变量，建立回归模型，探讨单个位点和多个位点构建的单倍型与相应表型之间的关联，为寻找ACS患者氯吡格雷反应变异性相关临床预测指标提供依据。 研究成果预期可发表中、英文各类论文12篇，其中在SCI收录的国际刊物发表1篇。三、研究方法和技术路线（包括研究工作总体思路、预试验结果、技术方案、实验方法、数据处理及现有工作基础等）1、拟采取的研究实验方法、步骤、技术路线及可行性、可靠性论证本研究拟采用临床病例队列研究，初步观察氯吡格雷反应变异性在中国汉族ACS患者身上的发生率，及探讨CYP2C19基因多态性对氯吡格雷的药效学、及近、远期临床事件的影响；1.1 研究对象病例入选标准：中国汉族ACS患者，年龄18岁； (1)血小板计数在100350109 /L；（2）血红蛋白 10 g/dl 。ACS诊断标准：急性ST段抬高型心肌梗死为持续不能缓解的胸痛、心电图相邻的两个或两个以上的导联ST段抬高和/或心肌生化标志物高于正常；如果心电图提示ST段明显压低超过0.1mv，同时心肌生化标志物高于正常则诊断非ST段抬高型心肌梗死，如果心肌生化标志物在正常范围之内则诊断为不稳定型心绞痛。病例排除标准：（1）1个月内有严重出血性疾病，包括上消化道出血、脑出血和严重创伤；（2）合并其它脏器严重疾病，包括恶性肿瘤、严重肝肾功能衰竭、呼吸功能衰竭；（3）PCI术前14天使用过抗凝和抗血小板药物，包括噻吩并吡啶、糖蛋白(GP) IIb/IIIa 抑制剂和华法林。所有研究对象住院期间采用Judkins法行冠状动脉造影，并须经两位心血管介入专业医师共同诊断。2、实验内容2.1 选取适合本研究方案的200例汉族ACS患者进行相关检查明确氯吡格雷反应变异性的发生频率，服用负荷剂量后12h和36h ,5d各采集静脉血样3ml进行血小板聚集度测定。 收集血样：5 和 20mol/ L ADP诱导血小板聚集率：MAR：最大的血小板聚集率，IPA：抑制血小板聚集率. IPA 10% (氯吡格雷无反应者); 10% IPA 1.38 %者。 P-选择蛋白n：流动细胞计数（流式细胞法）P-选择蛋白被测定 (Pharmingen)用200Umol/L ADP 刺激后并以百分比作为表达(ie, 如血小板对抗体的活性百分比) 。 激动剂的剂量被选择基于在没有ADP阻断剂的情况下由100 mol/LADP诱导的。2.2 观察氯吡格雷抵抗对于ACS患者随访过程中心血管事件的影响在对氯吡格雷抵抗在中国汉族ACS患者发生频率研究的基础上，将ACS患者分为对氯吡格雷反应组、低反应组和抵抗组，对三组患者进行随访12个月，研究氯吡格雷抵抗对于患者心血管事件发生的影响。对三组患者在出院时、及出院后1