实验1DNA提取纯化检测-jgh.ppt

实验一真核细胞染色体DNA的分离 纯化和检测 实验目的 通过实验学习从血液中制备染色体DNA的方法 学习琼脂糖凝胶电泳 检测DNA的纯度 DNA的构型 含量以及分子量的大小 掌握DNA样品的纯化和定量检测方法 红细胞裂解液裂解红细胞细胞裂解液裂解白细胞用蛋白酶K水解蛋白质有机溶剂酚 氯仿抽提在高盐条件下 用乙醇沉淀DNA再用70 乙醇洗除沉淀中的盐分即可获得染色体DNA 基因组提取实验原理 DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时 有电荷效应与分子筛效应 前者由分子所带净电荷量的多少而定 后者则主要与分子大小及其构型有关 DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电荷 在电场中向正极移动 在用电泳法测定DNA分子大小时 应当尽量减少电荷效应 增加凝胶的浓度可以在一定程度上降低电荷效应 使分子的迁移速度主要由分子受凝胶阻滞程度的差异所决定 提高分辨率 同时适当减低电泳时的电压 也可使分子筛效应相对增加而提高分辨率 琼脂糖凝胶电泳实验原理 纯净的DNAA260 A280 1 8 制备的DNA样品应该为1 7 1 8纯净的RNAA260 A280 2 0 制备的RNA样品应该大于2 0如果制备的DNA样品A260 A2802 说明样品中RNA过高 可用RNase消化后 用酚 氯仿 异戊醇抽提 再用乙醇沉淀DNA 如果样品A260 A280为1 8 2 0 说明样品中盐的含量过高 样品沉淀后应用70 乙醇多洗一遍 提取的RNA样品A260 A280应大于1 80 RNA样品含有蛋白质会使A260 A280比值下降 DNA浓度测定实验原理 实验材料 红细胞裂解液KHCO31g 10mM NH4Cl8 3g 155mM EDTA Na237mg 0 1mM 裂解缓冲液 lysisbuffer 10mMTris Cl pH8 0 0 1MEDTA pH8 0 0 5 m v SDSACD抗凝液柠檬酸0 48g柠檬酸钠1 32g右旋葡萄糖1 47g加水至100ml 使用时每6ml新鲜血液加1mlACD液组织细胞动物血液样品 将20ml新鲜血液与3 5mlACD抗凝液混匀 0 下保存数天或 70 下长期冻存 备用 酚 氯仿 异戊醇 25 24 1 70 乙醇TEbufferRNAse琼脂糖TAE电泳缓冲液电泳设备紫外分光光度计凝胶成像系统 实验材料 染色体DNA的制备方法 1 取800 l抗凝血液置于5ml离心管中 2 往管中加3ml红细胞裂解液 轻摇数次 置冰上5分钟 期间间歇摇动几次 3 4000rpm 室温离心5分钟 弃上清 4 往管中加入3ml红细胞裂解液 重悬沉淀 冰上5分钟 期间摇几次 5 4000rpm 离心5分钟 弃上清 6 重复步骤4 5四至五遍 至出现明显白色沉淀 将残余红细胞弃去 留下白色沉淀 7 用1 PBS3ml洗涤所得沉淀 8 4000rpm 离心5分钟 弃上清 9 每管中加入500 l白细胞裂解缓冲液 每小组配制1ml 重悬细胞 加入20 lproteinaseK 20mg ml 混匀后转移至1 5ml离心管 置55 水浴1小时 10 加入酚 氯仿500 l 混匀后10000rpm 离心5分钟 取上清 至1 5ml离心管 加入氯仿500 l 混匀后10000rpm 离心5分钟 取上清至5ml离心管 两次取上清前用剪刀将枪头尖剪去3mm 11 加入1ml无水乙醇 轻轻混匀可见DNA凝集 12 12000rpm 离心2分钟 弃上清 13 用1ml70 乙醇洗涤沉淀 12000rpm 离心2分钟 弃上清 14 开盖室温干燥沉淀5分钟 15 加入30 lDDW 无菌水 溶解DNA 取10 l电泳 16 加入3mlDDW至剩余样品中 测OD260和0D280 计算DNA浓度及OD260 0D280 染色体DNA的制备方法 琼脂糖凝胶电泳方法 1 选择合适的电泳仪和水平式电泳槽 调节电泳槽平面至水平 检查稳压电源与正负极的线路 2 将电泳板置于制胶器中或用玻璃胶带封好制胶板两端 防止浇板时出现渗漏 选择孔径大小适宜的点样梳 垂直架在电泳板负极的一端 使点样梳底部电泳板水平面的距离为0 5 1 0mm 3 制备琼脂糖凝胶 按照被分离DNA分子的大小 决定凝胶中琼脂糖的百分含量 称取琼脂糖 溶解在电泳缓冲液中 大电泳槽约160毫升 小电泳槽约35毫升凝胶液 置微波炉或水浴锅中加热 至琼脂糖全部溶化 4 待凝胶溶液冷至50 左右时 在凝胶溶液中加入EB 终浓度0 5 g ml 摇匀 轻轻倒入电泳板上 除去气泡 5 待凝胶冷却凝固后 约30分钟 在电泳槽内加入电泳缓冲液 大电泳槽约需1200ml 小电泳槽约180ml 从制胶器取出电泳板 放入电泳槽 然后小心取出点样梳 保持点样孔的完好 去除空内气泡 6 待测的DNA样品中 加五分之一体积的溴酚蓝指示剂点样缓冲液 6 loadingBuffer 如果待测样品太小要用电泳缓冲液稀释 再加五分之一体积的溴酚蓝指示剂点样缓冲液 如点样体积10 l样品与2 l溴酚蓝指示剂点样缓冲液 混匀后小心地进行点样 记录点样顺序和点样量 7 打开电源 DNA的迁移速度与电压成正比 与琼脂糖含量有关 最高电压不超过5V cm 大电泳槽不超过200V 小电泳槽不超过150V 8 电泳时间看实验的具体要求而定 在电泳途中可用紫外灯直接观察 DNA各条条带分开后 可以结束电泳 一般20分钟 2小时 取电泳凝胶块直接用凝胶成像系统成像和分析 琼脂糖凝胶电泳方法 DNA样品的纯化和定量检测方法 1 取DNA粗制样品 加入RNase至终浓度10 g l 37 反应0 5小时 2 加入酚 氯仿 异戊醇 25 4 1 等体积抽提1 3次 12000rpm 离心5分钟 取上清 3 加入1 10倍体积3MNaAc pH5 2 2倍体积无水乙醇混匀 室温下30 60min 4 15000rpm 离心10分钟 5 DNA沉淀用冰预冷70 乙醇洗1次 开盖37 干燥10min 使乙醇挥发 6 加入30 lTEbuffer 37 水浴至沉淀溶解 7 取10 lDNA1 琼脂糖凝胶电泳 凝胶成像系统记录和分析结果 估计样品DNA分子量 8 取10 lDNA母液稀释至1000ul 在紫外分光光度计上测A260和A280 计算样品DNA浓度 判断样品浓度和DNA纯度 DNA制备注意事项 1 如要11步中完整的DNA 在12步时 挑出DNA沉淀 用70 乙醇洗涤1 2次 2 步骤2 4 7中要颠倒摇动试管悬浮沉淀 不可用枪头 尤其是没剪去枪头尖端 吹打沉淀 3 步骤10中吸上清枪头使用前必须粗吸头 微量移液枪的枪头剪去尖端 并用火烧一下 使之圆钝 避免机械剪切力对DNA链的损伤 4 为了获得高分子量的DNA 操作中必须防止混匀 抽提及沉淀时剧烈机械震荡造成的DNA的断裂 5 如含有RNA 可用100ng ml的RNase在37 水解半小时 对于新血液 取ACD或EDTA抗凝 10ml全血中加3 3mlACD或1mlEDTA 电泳注意事项 1 琼脂糖的质量 琼脂糖 agarose 是以质量较好的琼脂作原料制成的 琼脂是由琼脂糖和琼脂胶组成的复合物 琼脂胶是一种含有硫酸根和羟基的多糖 它具有离子交换性质 这种性质将给电泳带来电渗作用的不良影响 因而必须去除干净 所谓琼脂糖的质量不过关就是琼脂糖内含有较高比例的琼脂胶 琼脂糖是一种直链多糖 它由D 半乳糖和3 6 脱水 L 半乳糖的残基交替排列组成的线性多聚糖 由于链状琼脂糖分子相互以氢键交联 因此与琼脂一样能形成凝胶 琼脂糖带有亲水性 不含有带电荷的基因 不引起DNA变性 又不吸附被分离的物质 因此它是一种很好的凝胶剂 2 DNA分子的迁移率 影响DNA分子在电泳中的迁移率的因素是多方面的 除了决定于DNA分子大小与构型外 还有琼脂糖的浓度 电压大小 缓冲液pH值和电泳时的温度等 为了精确测定其分子量的大小 采用一下措施 1 每次测定时 要有已知分子量的DNA片段作为标准 进行对照 电泳 2 选择最合适的电泳条件 3 提高分子筛效应 降低电荷效应 电泳注意事项 3 EB染色 EB是核酸的显色剂 使用EB对DNA染色的3种方法 1 在制胶中与电泳缓冲液中同时加入EB 2 只在胶中加入EB 在电泳缓冲液中不加 这样可减少操作时双手受EB污染的可能 3 在电泳结束后 取出凝胶 放在含有EB的电泳缓冲液或DDW中浸染10 30分钟 4 溴酚蓝指示剂缓冲溶液的作用 含有50 蔗糖 可增加上样DNA溶液的密度 以确保DNA样品沉入点样孔内 起DNA电泳时的前沿指示剂作用 一般溴酚蓝的电泳迁移位置相当于300 400bp双链线状DNA 5 点样量太高易产生拖尾与弥散现象 样品迁移速度减慢 点样量太少 分辨不清 影响结果 6 EB为强诱变剂 剧毒 操作时要带一次性手套 并在专区间操作 用过的手套要及时将手套顺手翻过来 让有EB的面朝里 有EB的废液和器皿不能随便丢弃 要用