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肺炎克雷伯菌分离鉴定 标本 尿培养基 血平板 MAC EMB SS XLD KIA MIU 葡萄糖蛋白胨水 枸橼酸盐培养基 鸟氨酸脱羧酶培养基及对照管试剂 革兰染液 荚膜染液 V P试剂 吲哚试剂 95 乙醇溶液器材 孵育箱 接种环 酒精灯 显微镜 基本特性直接涂片 镜下观察 接种 在镜下观察细菌的大致形态及其数量 直接将标本用接种环蘸取后接种在血平板 MAC EMB SS XLD 上 进行培养 温育 37 孵育18 24小时 观察菌落形态 血平板上形成圆形 凸起 灰白色 不溶血 光亮的大菌落 相邻菌落易于融合 粘液状 若用接种针蘸取呈长丝状拽起 MAC上形成乳糖发酵产酸的菌落 即红色或粉红色 较大 浑浊 凸起 有光泽的粘液型菌落 EMB上是大 粘稠 红色 易溶于一片的菌落 SS上是红色或粉红色 或具有粉红中心的无色菌落 XLD上呈不透明黄色的菌落 制片1 载玻片准备 玻片先在95 乙醇中去除油污 再在火焰上烧去粘附的乙醇 待冷 做好标记 2 涂片 在洁净无油腻的玻片中央放一小滴蒸馏水 或用接种环挑1 2滴水 用无菌的接种环挑取少量菌种与水滴充分混匀 涂成极薄的菌膜 涂布面积约1cm2 3 干燥 涂片在室温下使其自然干燥 也可以小心地在酒精灯上高处微微加热 使水分蒸发 但切勿紧靠火焰或加热时间过长 以防标本烤枯而变形 4 固定 手执玻片一端 有菌膜的一面朝上 通过微火三次 手指触摸反面不烫手为宜 待玻片冷却后再进行染色 革兰染色 挑取可疑菌落涂在干净的玻片上自然晾干 用结晶紫 1液 覆盖细菌初染1min 清水冲洗干净玻片再滴加革兰染液 2液 媒染1min 清水冲去表面的染液 用95 乙醇 3液 脱洗约30s 以乙醇不再有颜色为好 最后用稀释的复红 4液 复染30s 自然晾干后在显微镜下观察形态 荚膜染色 1 染色 玻片置于玻片搁架上 加适量 以盖满菌膜为度 草酸铵结晶紫 或石炭酸复红染液 于菌膜部位 染色1 2min 2 水洗 斜置载玻片 在自来水龙头 或洗瓶 下用小股水流冲洗 直至洗下的水呈无色为止 3 干燥 自然干燥或用吸水纸吸去涂片上的水 用吸水纸时切勿将菌体擦掉 4 镜检 用高倍镜和油镜观察并绘细菌形态并绘图于记录表中 镜下形态 G 杆菌 卵圆形或球杆状细菌 长成双排列 有荚膜 无鞭毛 如有需要 可进行荚膜染色 染色后菌体呈卵圆形或球杆状 成双排列 菌体外绕以明显的荚膜长较菌体宽2 3倍 生化鉴别定科 氧化酶试验 IMViC 定属 KIA AA MIU O F F 鸟氨酸脱羧酶试验 定种 吲哚 编码鉴定血清学鉴定 氧化酶试验 氧化酶 细胞色素氧化酶 是细胞色素呼吸酶系统的最终呼吸酶 具有氧化酶的细菌 首先使细胞色素C氧化 再由氧化型细胞色素C将盐酸二甲基对苯二胺或盐酸四甲基对苯二胺氧化成红色或蓝色的醌类化合物 主要用于肠杆菌科细菌与假单胞菌的鉴别 前者为阴性 后者为阳性 奈瑟菌属 莫拉菌属细菌也呈阳性反应 back I 吲哚 有些细菌具有色氨酸酶 能分解蛋白胨中的色氨酸产生吲哚 与对甲基氨基苯甲醛结合 生成红色化合物玫瑰吲哚 主要用于肠杆菌科细菌的鉴定 M 甲基红 某些细菌分解葡萄糖产生丙酮酸 丙酮酸可进一步分解为甲酸 乙酸等酸性物质 不再继续分解 故培养基pH在4 5以下 加入甲基红指示剂后呈紫红色 阳性 有些细菌将分解葡萄糖产生的酸进一步转化为醇酮等非酸性物质 使培养基pH在6 2以上 加入甲基红试剂成橘黄色 阴性 一般用于肠杆菌科各菌属的鉴别 Vi 某些细菌分解葡萄糖生成丙酮酸 丙酮酸可进一步脱羧生成乙酰甲基甲醇 乙酰甲基甲醇在碱性环境下被氧化成二乙酰 后者与蛋白胨中的精氨酸所含的胍基起作用 生成红色胍缩二乙酰 为VP试验阳性 若培养基中胍基含量少 加入少量含胍基的化合物如肌酸肌酐 可加速其反应 一般用于肠杆菌科各菌属的鉴别 C 枸橼酸盐 枸橼酸盐培养基中不含任何糖类 枸橼酸盐为唯一碳源 磷酸二氢铵为唯一氮源 如果细菌能利用铵盐作为唯一氮源 并能利用枸橼酸盐作为唯一碳源 在枸橼酸盐培养基上生长 并分解枸橼酸盐为碳酸盐 使培养基变碱 指示剂溴麝香草酚蓝由绿色变为深蓝色 为枸橼酸盐利用实验阳性 若细菌不能利用枸橼酸盐为碳源 则细菌不能生长 培养基不变色 back KIA 克氏双糖铁 克氏双糖铁斜面培养基 用酚红作指示剂 在酸性时呈黄色 碱性时呈红色 培养基中的葡萄糖含量仅为乳糖或蔗糖的1 10 若细菌只分解葡萄糖而不分解乳糖 分解葡萄糖产酸使ph降低 因此斜面和底层均先呈黄色 但因葡萄糖含量较少 所以生成的少量酸可因接触空气而氧化 并因细菌生长繁殖利用含氮物质而生成碱性化合物中和 使斜面部分又变成红色 底层由于处于缺氧状态 细菌分解葡萄糖所生成的酸类一时不被氧化而仍保持黄色 若细菌分解葡萄糖 乳糖产酸产气 斜面与底层均呈黄色 且有气泡 细菌产生硫化氢时与培养基中的硫酸亚铁作用 形成黑色的硫化铁 主要用于鉴别肠杆菌科细菌 back MIU 动力 吲哚 尿酶 培养基为尿素 蛋白胨成分的半固体培养基 指示剂为酚红 具有色氨酸酶的细菌能分解蛋白胨中的色氨酸产生吲哚 加入吲哚试剂后 培养基上层的吲哚试剂会变红 具有尿酶的细菌能分解尿素产氨 使整个培养基变碱呈红色 有动力的细菌沿穿刺线扩散生长 back O F 氧化 发酵 不同细菌对不同的糖分解能力及代谢产物不同 这种能力因是否有氧气的存在而异 细菌在分解葡萄糖的过程中 必须有分子氧参与的 称为氧化型 氧化型细菌在无氧环境中不能分解葡萄糖 细菌在分解葡萄糖的过程中 可以进行无氧降解的 称为发酵型 发酵型细菌在有氧或无氧的环境中都能分解葡萄糖 不分解葡萄糖的细菌称为产碱型 利用此实验可以区分细菌的代谢类型 主要用于肠杆菌科细菌与非发酵菌的鉴别 前者均为发酵型 而后者通常为氧化型或产碱型 back 氨基酸脱羧酶试验 具有氨基酸脱羧酶的细菌 可分解氨基酸 使其脱掉羧基 生成胺和二氧化碳 称为脱羧反应 并使培养基变碱 可用指示剂显示出来 最常用的氨基酸有三种 L 赖氨酸脱羧形成尸胺 L 鸟氨酸脱羧形成腐胺 L 精氨酸脱羧形成精胺 本实验主要用于肠杆菌科细菌的鉴定 back 吲哚 有些细菌具有色氨酸酶 能分解蛋白胨中的色氨酸产生吲哚 与对甲基氨基苯甲醛结合 生成红色化合物玫瑰吲哚 主要用于肠杆菌科细菌的鉴定 back 注意事项1 标本采集时要用无菌尿杯收集 条件允许时可采集二次晨尿或尿三杯的中尿进行细菌培养 2 标本接种等操作时要注意无菌操作 3 制片采取标本时要选取优势菌落进行涂片 涂片时要适量挑取细菌 涂开并使其均匀分布在载坡片上 4 染色时要正确掌握染色的时间和染液的顺序 洗脱时要根据涂片厚薄灵活掌握 并要尽量淋洗